专利名称：玉米低温诱导型启动子及活性分析的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，涉及一段DNA序列，在低温胁迫下它可以作为启动子调控基因的表达，具体涉及一种来源于玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3并在植物中高度表达的低温诱导型启动子序列。
背景技术：
中国是一个人口众多的农业大国，粮食安全生产事关国计民生与社会稳定。低温伤害(包括冷害和冻害)是影响我国大部分地区的严重气象灾害，尤其是东北和黄淮海地区，如东北地区在1969年、1972年和1976年发生了 3次严重的低温冷害，每次均使粮食减产50亿千克以上。由于我国幅员辽阔，地形多样，低温冷冻害发生范围非常广，从亚热带、 暖温带、中温带一直到寒温带都有冷冻害发生，如2008年初发生在我国南方大部分地区的雨雪冰冻及低温冷冻灾害造成的直接经济损失达11亿多元。目前，冷冻害对农业生产造成的损失人们还没有太好的办法。对于蔬菜等相对小规模的农业生产，人们采用了温室栽培， 可以一定程度上抵御冷冻害对生产造成的损失，但温室的建设无疑增加了生产成本，用过的塑料等也容易造成污染。而对于小麦等需要大面积种植的粮食作物，利用温室栽培显然不现实，人们只能根据气象专家对气候的预测来避开低温时期，但由于气候的多变性，预测的准确性很低，对生产指导意义不大。因此，科学研究者只能转而培育抗低温的品种。自转基因技术成熟以来，科学家们已经得到了很多转基因品种。然而，由于转入的基因大多数是由组成型启动子驱动表达的，组成型启动子具有高效表达、且在植物整个生长期都表达的特点，这使得大部分的转基因作物都具有植株矮小的特点，不利于植物的正常生长。而诱导型启动子在某些特定的物理或化学信号的刺激下，能够快速有效地诱导基因的转录，来抵御不良环境的影响。诱导型启动子独特的优点是它能根据自身的需求在特定的组织器官、环境下诱导基因转录，解决组成型启动子面对的问题。，解决组成型启动子面对的问题。迄今为止，从玉米中分离的逆境诱导型的启动子很少。目前，分离和鉴定的低温诱导型启动子并不多，主要有油菜的bnll5、拟南芥 rc^9A、corlfe和adh、小麦wes 120和玉米mlip 15等基因启动子。其中拟南芥Columbia 品种的基因组中分离得到corlfe基因的启动子，片段大小为900bp，并构建了与GUS基因融合表达载体，转入马铃薯，进行⑶S活性检测。转基因马铃薯经过低温处理之后，可检测 GUS的活性，反之，则检测不到GUS的活性，说明该启动子受低温诱导。美国康涅狄格大学的 Mariya K等构建了 corlfe基因的启动子驱动FAD7基因的质粒，将其整合到烟草的基因组中，使烟草获得了抗低温的特性。利用低温诱导型启动子驱动抗低温基因的高效表达，从而改良作物的耐低温性成为目前研究的热点。然而，目前能应用于转基因研究的诱导型启动子仍然很少。因此，对于新的抗低温相关启动子的克隆、顺式作用元件具体序列的确定、各元件之间的相互作用， 以及与这些元件互作的转录因子的研究仍然是今后启动子研究的重点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种低温诱导型启动子序列，该启动子序列能够诱导目的基因高水平表达，而且该启动子来源于玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3。本发明的第二个目的是提供一种用于植物转化的低温诱导型启动子真核表达载体，该载体指导高水平表达目的基因ZmDBP3的低温诱导型启动子序列和5’非翻译区。本发明的第三个目的是提供一种所述载体转化的转基因玉米成熟胚，该转基因玉米胚能反映启动子诱导活性的高低。为实现上述目的，本发明克隆了玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的低温诱导型启动子区，并构建了用于植物转化的载体，所述载体包含带有ZmDBP3基因的5’非翻译区的上述启动子。随后利用所述载体在玉米成熟胚中诱导表达，并观察到该启动子与低温诱导相关的高水平活性。本发明提供一种获得的玉米低温诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的-Ibp至-1151bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，低温可以在植物中诱导本发明所述的启动子的高水平活性。获得的玉米低温诱导型启动子序列源自玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3。一种克隆得到的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻译区包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的+Ibp至+255bp区(见序列表)的DNA核苷酸序列，本发明所述的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻译区能通过增强导入植物中的目标外源基因的翻译效力，而诱导目标基因的高水平表达。为实现另一个目的，本发明提供一种用于玉米转化的低温诱导型的植物表达载体，所述植物表达载体包含玉米低温诱导型启动子序列和玉米DRE响应元件结合蛋白基因 ZmDBP3的5，非翻译区。上述用于玉米转化的低温诱导型载体是指能够在转基因植物中持久表达外源基因的二元载体。所述二元载体可以是任何包含T-DNA (转移DNA)的RB (右边界序列)和 LB (左边界序列)，能够在根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens) Ti质粒存在下转化植物的二元载体。该载体可以是经常用于相关领域的二元载体，例如PCAMBIA1301载体、 PBI121 载体。一种用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚，包含玉米低温诱导型启动子序列和玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻译区。本发明提供SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3的PCR引物，适于扩增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。关于本发明所述的用于植物的诱导型载体(pCAMBIA1301)，所述的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的启动子和5’非翻译区在植物表达载体中位于外源基因的前面。本发明提供通过插入本发明所述的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的启动子和5’非翻译区至含有GUS报告基因的载体中而构建的pCAMBIA1301。但是，所述GUS报告基因是外源基因，并预期可以用任意其它有用的外源基因来代替。本发明提供一种应用低温诱导型瞬时表达的玉米成熟胚。植物能通过使用根癌农杆菌(An，G. 1987，Plant Physiology)或粒子轰击方法 (Lacorte等，1997，Plant Cell R印orts)将上述植物低温诱导型启动子二元载体进行转化。本发明提供来自玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的低温诱导型启动子和 5’非翻译区，根据本发明的启动子和5’非翻译区使得能够在植物中进行低温诱导表达。本发明的有益效果在于可用于启动抗低温基因的高效表达，应用于不耐低温的植物中使植株获得抗低温的性状，对于解决低温地区粮食危机、生态恶化等问题都有积极意义。
图1为玉米(B73)基因组电泳 2 为 ZmDBP3_pro PCR 电泳3为ZmDBP3_pro连T载酶切鉴定电泳 4 为 ZmDBP3-pro 连 pCAMBIA-130IPCR 鉴定电泳5为ZmDBP3-pro连pCAMBIA-1301酶切鉴定电泳6为pCAMBIA 1301 ZmDBP3-Pro转农杆菌PCR鉴定电泳 1 至图 6 中=Maker 从大到小依次为 1849bp ； 1470bp ； 1090bp ；738bp ；424bp ； 280bp图7为植物表达载体构建示意8为ZmDBP3启动子的⑶S检测(背面)照片
图9为ZmDBP3启动子的⑶S检测(正面)照片图8和9中ZmDBP3 (a) :4°C处理；ZmDBP3 (b)未处理；35S 应用最广泛的组成型
启动子
具体实施例方式下面结合附图介绍具体实施步骤，将能够使本领域技术人员更清楚地理解如何实施本发明。尽管已经结合本发明的优选的具体实施方式
来对本发明进行了描述，但是以下描述的目的是示例性的，而不是限制本发明的范围。实施例1 玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的低温诱导型启动子的克隆玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的启动子(启动子序列包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的-Ibp至-1151bp区的DNA核苷酸序列)，在玉米ZmDBP3基因的 5’区序列中得到鉴定。玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3登录在NCBI GenBank (登录号 FJ805751. 1)，序列表显示本发明上述基因的植物低温诱导型启动子和5’非翻译区的DNA 序列。在本文件的启动子序列表中，转录起始位点的碱基C用+1示出。并用启动子分析网站分析了启动子的核心元件。启动子分析网站 http //bioinformatics, psb. ugent. be/webtools/plantcare/ html/。以玉米基因组DNA (图1)为模板，扩增得到目的片段，经1 %琼脂糖凝胶电泳分析， 扩增出长度为1406bp的条带(图2)，并进行回收。回收片段与PMD18-T载体连接得到重组质粒pMD18-T: :ZmDBP3ftx)，提取质粒并进行酶切验证(图3)，并测序。
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更具体地说，通过PCR扩增克隆的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的启动子和25^p的5’非翻译区(见序列表)，上述PCR所用引物详细显示在表1中。对于PCR 扩增，反应程序:95V 3min ；95°C 30S，58. 5°C 30S,72°C 2min，32 个循环；72°C IOmin ；表1:引物
权利要求
1.一种获得的玉米低温诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列包含相对于 SEQ ID NO 1的转录起始位点的-Ibp至_1151bp区的DNA核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的获得的玉米低温诱导型启动子序列，其特征在于所述启动子序列源自玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3。
3.根据权利要求2所述的获得的玉米低温诱导型启动子序列，其特征在于一种克隆得到的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5，非翻译区包含相对于SEQ ID NO 1的转录起始位点的+Ibp至+255bp区的DNA核苷酸序列。
4.一种用于玉米转化的低温诱导型的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体包含权利要求1所述的玉米低温诱导型启动子序列和权利要求3所述的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻译区。
5.一种用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚，其特征在于所述转基因玉米成熟胚包含权利要求1所述的玉米低温诱导型启动子序列和权利要求3所述的玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5’非翻译区。
6.SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3的PCR引物，其特征在于所述引物适于扩增包含SEQ ID NO 1的序列DNA片段。
全文摘要
玉米低温诱导型启动子及活性分析属生物工程技术领域，本发明提供了一种获得的玉米低温诱导型启动子序列，包含相对于SEQ ID NO1的转录起始位点的-1bp至-1151bp区的DNA核苷酸序列；同时提供用于玉米转化的低温诱导型的植物表达载体，包含玉米低温诱导型启动子序列和玉米DRE响应元件结合蛋白基因ZmDBP3的5′非翻译区；用植物表达载体转化的转基因玉米成熟胚；SEQ ID NO2和SEQ ID NO3的PCR引物适于扩增包含SEQ ID NO1的序列DNA片段。本发明可用于启动抗低温基因的高效表达，应用于不耐低温的植物中使植物获得抗低温的性状，对于解决低温地区粮食危机有积极意义。
文档编号A01H5/00GK102399783SQ20111037648
公开日2012年4月4日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者余刚, 刘金亮, 张世宏, 李桂华, 潘洪玉, 贾承国, 赵淑莉, 陈宣明 申请人:吉林大学