专利名称：水稻根特异性启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻基因OsGCWH基因启动子序列，即从该基因ATG上游开始-l-1920bp之间的核苷酸序列，该启动子序列能够在水稻转基因调控体系中驱动目标基因在根中特异表达及应用。
背景技术：
植物基因能够正常表达是依赖基因上游的启动子序列。在植物基因工程中，我们可以利用具有不同表达调控水平的启动子来驱动目标基因的表达。其中在植物中使用最广泛的启动子为CaMV35S启动子。该启动子是烟草花叶病毒基因的启动子，能在大部分植物中对异源基因进行启动表达，是组成型启动子(Chua NH, Benfey PN. The cauliflower mosaic virus35S promoter !combinatorial regulation of transcription on plants. Science, 1990, 250 :959-966)。从病毒中克隆出来的基因启动子序列应用到植物基因工程中，可能存在潜在的生物不安全性，因此，人们也从植物本身克隆活性强的组成型启动子。例如来源于拟南芥的PTSBl和PPHYB启动子(Naomi SS, Ichiro Μ. Constitutive promoters available for transgene expression instead of CaMV35S RNA promoter Arabidopsis promoters of tryptophan synthase protein subunit and phytochrome B. Plant Biotechnology, 2002,19 (1) :19-26)。广泛应用于单子叶植物转基因工程中，并作为研究的水稻Actinl和玉米WDiquitin启动子，据报道，这些启动子在大麦和玉米中 ^ ^ 35S 白勺 15 (Schledzewski K, Mendel RR. Quantitative transient gene expression :Comparison of the promoters for maize polyubiquitinl, rice actin 1， maize-derived Emu and CaMV 35S in cells of barley,maize and tobacco. Transgenic Res. 1994,3 :249-255)。尽管组成性启动子能高效、非特异性地启动外源基因表达，但在实际应用中逐渐暴露出一些问题，这种外源基因的组成型表达往往会造成大量异源蛋白的积累，从而打破植物原有的代谢平衡，妨碍植物的正常生长。例如生长迟缓、生育期长、甚至不育和死亡 (Pina MT, Skinner JS, Park EJ, Jekni Ζ, Hayes PM, Thomashow MF, Chen Τ. Use of a stress inducible promoter to drive ectopic AtCBF expression improves potato freezing tolerance while minimizing negative effects on tuber yield. Plant Bioteech J，2007，5 :591-604)。因此，能够驱动外源基因在植物组织器官中定时、定点表达的组织特异性启动子逐渐成为研究的重点。作为植物的地下部，根直接与土壤接触，从土壤中吸取水分和养分、运输物质和储存营养等，是植物极其重要的生理器官，因此研究根特异性启动子具有实在的应用价值。如利用根特异性启动子可以改善植物根的生长，提高植物的抗旱耐盐能力，增加根的分泌物， 对土壤污染进行生物修复等。同时利用根特异性启动子研究植物根的发育、根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良培育高产稳产的作物新品种具有重要的意义。目前使用中的根特异性启动子并不多。在植物内源的根特异性启动子开发应用之前，使用的农杆菌Ri质粒中的一个根特异的基序rolD (Elmayan T，Tepfer M. Evaluationintobacco of the organ specificity and strength of the rolD promoter doman Aof the 35S promoter and ths 35S promoter. Transgenic Res,1995,4 :388-396)。最近几年人们也寻找到一些根特异性启动子，如利用拟南芥的黑芥子酶(myrosinase)PmO启动子调控CKX3基因，使该基因在根中表达，促进根的加快生长，提高了作物抗旱和吸收矿物质的能力(Werner Τ, Nehnevajova Ε, Kollmer I, Novak 0，Strnad Μ, Kramer U,Schmiilling Τ. Root-specific reduction of cytokinin causes enhanced root growth,drought tolerance,and leaf mineral enrichment in Arabidopsis and tobacco. PlantCell. 2010,22(12) :3905-3920)；用根特异性引物Rcc3驱动OsNACIO，发现特异性表达该基因后，也使根变大，并能在干旱胁迫下增加植物产量(Jin Seo Jeong,Youn Shic Kim, KwangHun Baek, Harin Jung, Sun-Hwa Ha, Yang Do Choi, Minkyun Kim, Christophe Reuzeau,and Ju-Kon Kim. Root-Specific Expression of OsNACIO Improves Drought Toleranceand Grain Yield in Rice under Field Drought Conditions. Plant Physiol. 2010153 185-197)。综上所述，在植物中，合理使用根特异性启动子能明显改善植物性状，但应用于水稻等禾谷类作物基因工程遗传载体构建中能够选用的植物内源根特异性启动子依然较少，因此，发展更多的水稻等禾谷类作物的根特异性启动子对基础研究和生产应用都具有重要的意义。关于水稻基因0sGCW14(Gramene ID :L0C_0sl0g31680)启动子调控外源基因根特异性表达及应用目前还未见相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供水稻OsGCWH基因根特异性启动子及其应用。本发明的目的是提供一种水稻根特异性启动子，其中，所述基因启动子的核苷酸序列为下述之一
具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；
具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列；具有在所述SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加或取代或插入或缺失一个或一个以上的核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物，具有相同功能的核苷酸序列。本发明优先的一种技术方案是，包含所述核苷酸序列的根特异性启动子与载体结合，构成重组载体。本发明优先的一种技术方案是，所述载体可为噬菌体、Ti质粒、粘粒、微型染色体、病毒、逆转录病毒中的一种。本发明优先的一种技术方案是，所述载体可为Ti质粒，植物病毒中的一种。本发明优先的一种技术方案是，一种包含所述核苷酸序列的根特异性启动子的转化体，所述转化体被包含在宿主细胞内，所述宿主细胞为植物细胞，所述植物细胞为水稻、玉米、小麦或大麦的植物细胞，
本发明另一种技术方案是，提供一种包含上述技术方案中启动子在根特异性表达中的应用，其中，所述启动子与目标基因融合，转化到植物细胞、植物组织或植物器官中，所述植物细胞、植物组织或植物器官被培育成植株，实现目标基因在根中特异性表达。
本发明优先的一种技术方案是，所述植物细胞、植物组织或植物器官为禾本科植株的植物细胞、植物组织或植物器官，所述禾本科植株为水稻、玉米、小麦或大麦植株。本发明的具体内容是
从水稻基因芯片中发现了 4个GCW家族基因(glycine-rich cell wall structural protein2，富含甘氨酸细胞壁结构蛋白2)，分别为L0C_0sl0g3 1680、L0C_0sl0g31640、 L0C_0sl0g31660和L0C_0sl0g31720，均在根中特异性表达。其中L0C_0sl0g31680在根中的表达量最高，位于10号染色体上，无内含子，命名为0sGCW14。逆转录和实时聚合酶链式反应(RT-PCR)和定量逆转录和实时聚合酶链式反应 (qRT-PCR)等实验显示，OsGCffH在水稻的叶、小穗和愈伤组织中没有表达或极低，在根中表达量很高，是水稻根特异性表达基因。其在根中的表达丰度与OsActin比较，表达水平基本一致。因此0sGCW14是水稻根特异表达基因。通过将OsGCWH启动子与报告基因(⑶S)融合进行水稻的转化研究，发现该基因启动子诱导基因在水稻的根中表达，地上部未见表达，说明该启动子能够调控目的基因在根中特异表达。本发明的技术效果表明，所克隆的水稻OsGCWH启动子能够调控基因在根中特异表达，在实际应用中具有一定的价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在根中特异表达，可对土壤污染进行生物修复，或提供植物的抗旱、盐和碱的耐受力，或提高植物对土壤养分的高效吸收，或增强土壤病原微生物的抵抗力等，同时还可以改造植物根系的构型对农作物进行遗传改良。
图1.芯片检测出4个特异性表达基因在水稻不同器官中的表达量花药(Anther)，胚(Embryo)，胚乳(Endosperm)，叶(Leaf)，子房(Ovary)，内稃 (Palea)，花序(Panicle)，胚芽(Plumule)，根(Root)，茎顶端(SAM)，种子(Seed)，叶鞘 (Sheath)，莲叶(Shoot)，小穗(Spikelet)，雄蓝(Stamen)，莲干(Stem)，柱头(Stigma)。图2. real-time RT-PCR方法检测0sGCW14基因在水稻品种日本晴叶片和根， 诱导的愈伤组织以及幼穗中的表达水平。根(R00T)，叶(LEAF)，愈伤组织(CALLI)，小穗 (SPIKLET)。图3. RT-PCR方法检测0sGCW14基因在水稻品种日本晴叶片和根，诱导的愈伤组织以及幼穗中的表达水平。图4.表达载体pCB4801: :0sGCW14P的构建示意图； 图5.转基因植株(Tl)幼苗基因(GUS)染色图。
具体实施例方式在本文，术语“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其蛋白质分开。通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。
用于本发明的载体可以是如噬菌体、质粒、粘粒、微型染色体、病毒或逆转录病毒载体。可用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体是能在需复制和/或表达多核苷酸的宿主细胞中复制的载体。一般说来，携带本发明的核酸序列的重组表达载体可以使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach, 1998, Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press,New York, pp.411-463 ；Geiserson and Corey,1998, Plant Molecular Biology (2ndEdition))。已开发出多种方法用于经由互补的粘性末端使多核苷酸与载体可操作相连。例如，可在欲插入载体DNA内的DNA区段添加互补的同聚体序列片段。然后通过互补同聚体尾之间的氢键连接载体和DNA区段以形成重组DNA分子。复制或表达载体可包括至少一个选择标记。所述标记包括编码抗生素的抗性基因，例如新霉素磷酸转移酶(Neomycin phosphotransferase)基因npt II、潮霉素磷酸转移Bl (Hygromycin phosphotransferase)基因 hpt 禾口二S1 卩十酸还原6| (Dihydrofolatereductase)基因dhfr ；另一类是编码除草剂抗性基因，例如，草丁膦乙酰转移酶(Phosphinothricin acetyltransferase)基因 bar、5_ 烯醇丙酮酰草酸 _3_ 磷酸合成酶(5-Enoylpyruvate shikimatr-3-phosphate)基因印sps。适当宿主的代表性例子包括但不限于原生质体细胞和植物细胞。上述宿主细胞的适当培养基和培养条件是本领域已知的。目的基因或目的多核苷酸的转化方法一类是载体介导的转化方法，即将目的基因插入到农杆菌的质粒或病毒的DNA等载体分子上，随着载体DNA的转移而将目的基因导入到植物基因组中；农杆菌介导和病毒介导法就属于这种方法。第二类为基因直接导入法，是指通过物理或化学的方法直接将外源目的基因导入植物的基因组中。物理方法包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法等；化学方法有PEG介导转化方法和脂质体法等。第三类为种质系统法，这包括花粉管通道法、生殖细胞浸染法、胚囊和子房注射法等。本发明中，使用的术语“转化体”(transformant)，即带有异源DNA分子的宿主细胞或生物体。本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高。通过众所周知的技术可以鉴定出被成功转化的细胞，即含有本发明所述核苷酸序列的重组载体的细胞或生物体。以下结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1 根特异性表达基因的筛选
从CREP基因表达数据库平台(http://cr印.ncpgr. cn/)下载Affymetrix水稻芯片数据，将这些芯片数据通过RMAExpress软件进行均一化处理用于基因特异性表达筛选。为了寻找根特异性表达基因，对2个不同品种水稻(珍汕97和明恢6 表达芯片数据均一化，寻找在根中高表达但在其它组织中低表达的基因，用t检验(one-way ANOVA t test)筛选差异显著基因，发现4个基因0sl0g31680、0sl0g31640、0sl0g31660和0sl0g31720在根中特异性高表达，在其它组织尤其是地上部器官中表达量极低(见图1)，这4个基因均为富含甘氨酸细胞壁结构蛋白2家族基因。其中0sl0g31680(0sGCW14)在根中的表达量最高，在根中的杂交强度信号达到6232. 68，而在其它组织中均不超过20，在4个基因中其根中表达量和特异性综合表现更好，以该基因作为进一步研究的对象。实施例2 在水稻组织中的定量聚合酶链式反应(PCR)表达分析2. 1材料准备
水稻品种日本晴种子发芽后，移植于液体培养基(自来水配制成1/5MS大量元素)。幼苗生长15d后，分别剪取叶片和根快速投入液氮保存，用于抽提叶和根的RNA ；将水稻播种在大田中，当水稻开始抽穗，幼穗长度2厘米时，剪取幼穗快速投入液氮保存，用于抽提穗的RNA ；将种子接种到愈伤组织诱导培养基(MS+2，4-D 2. Omg/L)上，1个月后将诱导出来的愈伤组织快速投入液氮保存，用于抽提愈伤组织的RNA。无DNA的总RNA制备
根据某公司提供的植物叶RNA小量抽提试剂盒使用说明书抽提。使用Beckman CoulterTM DU 640紫外分光光度计测定RNA浓度。为除去残留在RNA中的DNA，每个总RNA样品取5 μ g，加入1 μ L DNAase I (美国hvitrogen公司)和1 μ L IOX反应缓冲液，补足体积至10 μ L，常温反应30min，然后每管加入1 μ L 2mmol L—1乙二胺四乙酸(EDTA)终止反应，最后在70°C加热IOmin使DNAase I失活。第一链cDNA的合成
将上述RNA样品各取2 μ L，按美国!Iomega公司反转录试剂盒提供的试剂依次添加4μ L 25mmol I71 MgC12,2y L 10XRT 缓冲液，2 μ L dNTP 混和液和 1 μ Loligo (dT) 15，加水补足体积到18. 5μ L，在70°C加热变性lOmin，快速在冰上冷却。然后加0. 5 μ L RNaseinhibitor 和 1 μ L AMVRTase，在 42°C水浴 60min，70°C下加热 IOmin 终止反应。定量PCR
根据基因0sGCW14的序列设计特异性引物RF :5’ -GGT GGC GGT AAT GGTCAA GG-3，，RR :5，-TGG TAC GAA ACA TAG TGG GCT CC-3，用于荧光定量 PCR，根据 Actin (GenBank accession No. AY212324)基因的 cDNA 序列设计特异性引物 AF 5，-CTTCCTCATGCCATCCTGC-3，，AR :5，-GCAAGCTTCTCCTTGAT GTCC-3，用于参照基因的荧光定量PCR。PCR使用美国ABI PRISM 7000定量PCR仪，每一个PCR设置一次重复。反应体系包含STOR Premix Ex TaqT、2X) 10 μ L，正反向引物各0. 5 μ L，各种处理的cDNA模板1 μ L，加水补足体积至25 μ L。反应程序为95°C 30s，然后在95°C 10s，61 °C 34s下循环40次，设定在每个循环中60°C 34s时读取荧光值，同时进行ROX值校正，最后添加荧光PCR产物融解曲线分析，其他操作详见仪器使用说明书。为了检测RNA样品中是否存在DNA的污染，随机选取3个样品，各取1 μ L RNA作为模板进行PCR，方法同上。分析方法
Ct是通过7000 system SDS Versionl. 2. 3软件在PCR的荧光域值通过手工确定为0. 15后产生的，将数据输入到EXCEL进行计算分析。数据分析采用方法为2_ΔΔετ，然后利用EXCEL表作表达差异柱状图。分析结果
通过ACTIN基因均一化后，以幼穗的表达量设为1，进行柱状作图，可以看出根中的表达量极高，而在叶中几乎没有表达(见图幻。将上面PCR反应进行40个反应循环后，各取 IOyL在琼脂糖电泳胶中电泳，结果表明仅在根中扩出条带，其它3个组织器官中均未扩出相应大小条带(见图幻。说明该基因在根中是高表达的，但在其它器官中不表达。 实施例3 :0sGCW14基因启动子调控⑶S报告基因的表达分析 3. IOsGCffH基因启动子融合⑶S载体的构建
根据0sGCW14基因的ID号L0C_0sl0g31680从GRAMENE数据库中将上游序列(SEQ ID NO 1)下载，设计带接头的 ιΗ 反向引物 G-GCWF (5 ’ -AAAAAGCAGGCTCGGACATGTTAGAGGTAATGGA C-3，)和 G-GCWR(5，-AGAAAGCTGGGTGAACTATGAGGGCAGGAGGAG-3，)，其中带下划线的为接头。 以该对引物扩增日本晴基因组DNA。所得PCR产物取1 μ L为模板，以引物attBl (5，-GGGG ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3，)和 attB2(5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3，)进行扩增，随后以该PCR产物与pD0NR207载体进行BP重组反应，重组反应液转化大肠杆菌感受态细胞，含庆大霉素平板上生长。挑取阳性克隆，进行PCR验证，然后抽提质粒。将质粒与载体pCB4801质粒进行LR重组反应，重组反应液转化大肠杆菌感受态细胞，含卡那霉素平板上生长。挑取阳性克隆，进行PCR验证，然后抽提质粒。所得质粒的图谱见图4。这样就将OsGCWH基因启动子与基因(GUS)进行了融合。该质粒转化农杆菌EHA105，最后进行水稻愈伤组织转化实验。水稻遗传转化 3. 2. 1种子消毒
成熟的日本晴水稻种子去壳后放入无菌三角瓶中，用75%酒精浸泡l-2min，无菌水冲洗2次；再用30% Natno消毒30min，其间需经常摇动，再用无菌水洗3-4次，用无菌滤纸吸干多余的水分，将种子接种到愈伤组织诱导培养基(MS+2，4-D 2. Omg/L)上，每皿约30粒， 于暗培养。继代培养
经过近1月的诱导，水稻长出黄色膨大的愈伤组织，去其盾片，将愈伤转至新鲜的愈伤组织诱导培养基(MS+2，4-D 2. Omg/L)上进行继代。每2周继代一次，一般继代2_4次即可获得适合转基因的嫩黄色、颗粒状的胚性愈伤组织。在继代培养2周后，挑选胚性颗粒用于遗传转化。农杆菌的培养
在转化平板上挑取单菌落在Iml农杆菌培养基中培养。在50ml农杆菌培养基(含相应抗生素)中加入Iml上述培养物，200rpmJ8°C培养5-6hr至0D600为0.6-1.0，培养结束前2hr加入乙酰丁香酮(AS，终浓度100uM)。取上述菌液在室温下，4000rpm，lOmin，弃上清，加入MS液体培养基(含AS IOOuM)重悬菌体，在与上相同的条件下培养》ir，使菌液的 0D600 = 0. 5-1，此时可用来转化愈伤组织，AS = acetosringone。共培养
将水稻胚性愈伤组织浸入农杆菌菌液20-30min，再用无菌吸水纸吸干水分，将侵染的愈伤组织置于共培养培养基(MS+2，4-D 2. 0mg/L+AS IOOuM)上，28°C暗培养三天。
洗菌
共培养的愈伤组织先用无菌水冲洗3遍，再浸泡在含Cef/CN 400mg/L的MS液体培养基中20-30min后，将愈伤组织转入无菌滤纸上吸干。选择培养
将吸干水分的愈伤组织接种于选择培养基(MS+2，4-D 2. Omg/L+Hyg 30mg/L+Cef400mg/L)上。3周后，挑选新长出的愈伤接种于选择培养基(MS+2，4-D 2. Omg/L+Hyg 50mg/L+Cef250mg/L)上，再选择 2 周。分化培养
将经过2次选择得到的抗性愈伤组织转入到预分化培养基(N6+KT 2. Omg/L+NAA0. 2mg/L+6-BA 2. Omg/L+Hyg 30mg/L+Cef200mg/L+ 琼脂 9g/L+ 蔗糖 45g/L)上暗培养 10 天左右，再转到分化培养基(N6+KT 2. Omg/L+NAA 0. 2mg/L+6-BA 2. Omg/L+Hyg 30mg/L+琼脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)上光照培养。生根培养
约1-2个月，将2cm左右高的幼苗转到生根培养基(l/^MS+Hyg 15mg/L+琼脂4. 5g/L+蔗糖20g/L)上诱导不定根的发生。转基因苗的移栽
权利要求
1.一种水稻根特异性启动子，其特征在于，所述基因启动子的核苷酸序列为下述之具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列；具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列；具有在所述SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列中添加或取代或插入或缺失一个或一个以上的核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物，具有相同功能的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，包含所述核苷酸序列的根特异性启动子与载体结合，构成重组载体。
3.根据权利要求2所述的启动子，其特征在于，所述载体可为噬菌体、Ti质粒、粘粒、微型染色体、病毒、逆转录病毒中的一种。
4.根据权利要求3所述的启动子，其特征在于，所述载体可为Ti质粒，植物病毒中的一种。
5.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，一种包含所述核苷酸序列的根特异性启动子的转化体，所述转化体被包含在宿主细胞内，所述宿主细胞为植物细胞，所述植物细胞为水稻、玉米、小麦或大麦的植物细胞，
6.一种包含权利要求1 5中任意一种所述启动子在根特异性表达中的应用，其特征在于，所述启动子与目标基因融合，转化到植物细胞、植物组织或植物器官中，所述植物细胞、植物组织或植物器官被培育成植株，实现目标基因在根中特异性表达。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物细胞、植物组织或植物器官为禾本科植株的植物细胞、植物组织或植物器官，所述禾本科植株为水稻、玉米、小麦或大麦植株。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种水稻调控外源基因在根中特异表达的OsGCW14基因启动子及其应用，本发明公开的是一种水稻基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明还介绍了OsGCW14基因启动子的用途，用于构建根特异表达的转基因植物载体并转化植物宿主。其优点是，可对土壤污染进行生物修复，或提供植物的抗旱、盐和碱的耐受力，或提高植物对土壤养分的高效吸收，或增强土壤病原微生物的抵抗力等，同时还可以改造植物根系的构型对农作物进行遗传改良。
文档编号A01H5/06GK102559676SQ20111040800
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月9日 优先权日2011年12月9日
发明者余舜武, 吴金红, 罗利军, 陈晨 申请人:上海市农业生物基因中心