专利名称：脊椎动物用饲料组合物的制作方法
脊椎动物用饲料组合物
技术领域：
本发明涉及一种养殖方法，具体而言，涉及ー种脊椎动物用饲料组合物。
现有技术随着世界人ロ快速成长，以及可耕地面积的減少，可利用的粮食资源渐趋短缺，提升单一面积生产量以及增加附加营养价值是世界粮食生产的趋势。针对渔业而言，因海上捕捞所得的渔获量已几近饱和，且动物蛋白市场对渔类产品的需求日益成长，由水产养殖业以弥补捕捞渔业产品供应量的不足已是势在必行。石斑鱼(Epinephelus spp.)物种分类属硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鱼卢行目(Perciforms)、鯧科(Serranidae)、石斑亚科(Epinephelinae)、石斑属(Epinephelus),为暖水性鱼类，广布全世界热带与亚热带海域，为养殖界公认亚太地区最重要的经济鱼种。台 湾主要养殖玛拉巴石斑、点带石斑、龙胆石斑和青点石斑。一般石斑鱼养殖至少需八至十二个月才达上市体型，但最后的收成率都不高。除了早期稚鱼易遭受病毒及细菌感染而死亡夕卜，养殖期间的天候因素、水质污染问题、饵料生物的选择与管理方面都会增加业者的风险。因此如何提高养殖鱼类的养成速度，缩短上市的时间，降低饲料转换率(饲料投喂重量/鱼只体重増加重量)及养殖期间可能发生的风险，是值得努力研究的方向。富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic andrich incysteine, SPARC),又称骨结合素(osteonectin)、BM40,其蛋白大小约35_45kDa,主要分布于细胞外基质(extracellular matrix, ECM)之中，是一种细胞基质蛋白(matricelluarprotein),亦为ー种具有与细胞外基质结合亦可与细胞结合特性的具有多功能的糖蛋白(glycoprotein)。虽然SPARC主要分布于细胞外基质之中，但其功用却不同于一般基质中的结构性蛋白所负责的细胞结构组成、支持作用；相反的，SPARC专司细胞与细胞外基质之间的沟通桥梁，属于调控性的蛋白质，能调节数种细胞基质蛋白的产生及储存堆积(Bradshaw及Sage,2001,J Clin Invest 107 ; 1049-1054 ;Lane 及 Sage，1994，FASEB J 8;163_173)。而SPARC主要表现于胚胎发育过程，对细胞分化、组织的钙化生成、骨骼发育、型态及器官发育有极大影响，当于生物成体时此蛋白的表现量有降低的趋势，主要是当皮肤或是组织受伤时的修复及重组过程会有较明显的表现(Lane及Sage, 1994)。SPARC主要可以分成三个功能区(Hohenester等人，I"7，EMBO J 16 ；3778-3786) :1、酸性区(Acidic domain):位于蛋白质N端，此区可与5 8个I丐离子形成弱亲和カ的结合，具有抑制细胞延展及调控细胞外基质生产的功能；2、类卵泡抑制素区(Follistatin like domain):此区包含多个半胱氨酸,且有类似卵泡抑制素的功能,能够抑制细胞增生，此区还包含另ー个特别的序列-铜离子结合序列(K) GHK (Iruela-Arispe等人，1995，Mol Biol Cell 6 ;327_343)，具有促进血管的增生的功能；3、细胞外钙离子结合区(ECdomain):为SPARC的C端，具有两个EF-手型结构域(EF-handmotif)可与I丐离子形成高亲和カ的结合，能与细胞或某些胶原蛋白结合，亦具有抑制细胞增生及延展的效果(Maurer 等人，1995，J Mol Biol 253 ;347_357)。目前对SPARC生物功能性的研究探讨已有ー些发现，于活体外的老鼠内皮细胞培养观察中可以发现到几个特性(一)SPARC的表现可以抑制细胞型态的延展，使细胞趋于圆形(Murphy-Ullrich 等人，1991，J Cell Biol 115 ;1127_1136);调控细胞外基质的组成及其中某些细胞外基质蛋白质的表现，进而调节细胞与外基质之间的结合状况从而改变细胞型态及迁徙的能力(Hasselaar 等人，1991，J Biol Chem 266 ;13178_13184 ;Tremble 等人，1993，J Cell Biol 121 ； 1433-1444) ; (ニ)抑制细胞周期的进行，主要使周期停于中Gl期，故有抑制细胞生长的功能(Yan 及 Sage，1999，JHistochem Cytochem 47 ; 1495-1506)；(三)于血管细胞培养的研究发现其具有促进血管增生的性质(Funk及Sage，1991，Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88 ;2648_2652);而在活体内发现，去除SPARC基因的老鼠在出生不久后即有白内障的现象，推測SPARC对于眼睛晶状体的发育为必需的蛋白(Yan及Sage，1999);而研究中也发现在spare基因敲除的老鼠中，可以观察到皮肤组成发生异常改变，脂肪层有增厚的现象，且其脂肪细胞有体积变大及数目增多的现象，血液中由脂肪细胞所分泌的瘦蛋白浓度也有上升的情形，因此推测SPARC蛋白可能和体内调控脂肪量变化有相关关系(Bradshaw 等人，2003，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 ;6045_6050)。 肌肉倍增基因(myostatin),亦称为第八号生长分化因子(growth anddifferentiation factor-8,⑶F_8),为转化生长因子TGF-0家族中的成员。肌肉倍增基因可负向调控肌肉的生长分化。在牛及人体的研究中皆可发现当肌肉倍増基因失去功能吋，因无法执行负向调控肌肉之生长分化，造成肌肉倍増的表现型出现(McPherron及 Lee,1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,12457-12461 ；Schuelke 等人，2004, TheNewEngland Journal of Medicine 350,2682-2688)。在哺乳动物研究方面，将小鼠的肌肉倍增基因敲除(McPherron 及 Lee，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 ; 12457-12461)、在小鼠肌肉中大量表现肌肉倍増抑制蛋白(如Follistatin)或是让其讯息传递所需的受体蛋白ActRIIB 失去功能(Lee 及 McPherron，2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 ;9306_9311)，都会导致肌肉倍増的结果出现。而在硬骨鱼类研究方面，使用反义吗啉敲除(Antisensemorpholinoknock-down)技术抑制斑马鱼胚胎中的肌肉倍增蛋白-I的mRNA,可使胚胎生长速度变快(Amali 等人,2004, Developmental Dynamics 229 ;847_856);或利用 RNAi 技术使斑马鱼肌肉倍增基因-I默化，出现巨大斑马鱼的特征(Acosta等人，2005，Journal ofBiotechnology 119 ;324_331),进ー步以组织切片去探讨研究这些肌肉细胞,发现肌肉细胞体积变大(Hypertrophy)及肌肉细胞数目增生(Hyperplasia),可能是导致肌肉倍增的原因。另ー方面，体外细胞株研究结果指出，若在C2C12肌肉母细胞株内大量表现肌肉倍増蛋白质，可抑制肌肉母细胞的增生，使细胞停留在细胞周期当中的Gl至S期(Thomas等人，2000, The Journal of Biological Chemistry 275 ;40235_40243)。另一方面，若在肌肉星状细胞内大量表现肌肉倍増蛋白质，发现其可抑制肌肉星状细胞活化及自我更新(self-renewal) (McCroskery, 2003, The Journal of CellBiology 162 ;1135_1147),亦证明肌肉倍増蛋白质在肌肉发育过程当中，的确扮演负向调控的角色。除了其本身会在肌肉细胞内进行调控之外，其它文献指出其有抑制脂肪新生的功能存在(Rebbapragada等人，2003，Molecular and CellularBiology 23 ;7230_7242)，也有研究指出其有抑制肌肉母细胞调亡的功倉泛(Rios等人,2001,Biochemical and BiophysicalResearch Communications280 ；561-566)。然而关于肌肉倍增蛋白质及SPARC的研究中，并无关于饲料转换率(饲料投喂重量/体重增加重量)的报导，于养殖业中，除了肌肉增加外，饲料转换率亦是成本控制之重要关键，再者，现今针对免疫抑制脊椎动物的方法为采用注射抗原性片段，耗时耗力，且易造成脊椎动物受伤，业界仍需要开发可降低饲料转换率的饲料组合物，以提高养殖的养成速度。
发明内容本发明涉及一种脊椎动物用饲料组合物，其可提高养殖的养成速度，缩短上市的时间，降低饲料转换率及养殖期间可能发生的风险。本发明提供一种脊椎动物用饲料组合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗体。
优选地，根据本发明的饲料组合物进一步包含肌肉倍增蛋白质、肌肉倍增蛋白质的片段或抗肌肉倍增蛋白质或其片段的抗体。
图I为石斑鱼经免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的血清抗体效价图。图2为石斑鱼经免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的体重变化图。图3为石斑鱼经免疫抑制肌肉倍增蛋白质的血清抗体效价图。
具体实施方式本发明提供一种脊椎动物用饲料组合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗体。根据本发明的饲料组合物通过抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的功能，可在脊椎动物体中降低饲料转换率，其中饲料转换率被定义为(饲料投喂重量)/(体重增加重量)。优选地，根据本发明的饲料组合物进一步包含肌肉倍增蛋白质、肌肉倍增蛋白质的片段或抗肌肉倍增蛋白质或其片段的抗体。根据本发明的饲料组合物可适用于各种脊椎动物体中；优选地，根据本发明的饲料组合物适用于鱼体；更优选地，该鱼体为硬骨鱼纲(Osteichthyes),目前已选殖出包括斑马鱼、大西洋鲑鱼、莫桑比克吴郭鱼、条纹鲈鱼、金头鲷鱼、虹鳟、河鳟、河鲶、点带石斑鱼及日本真鲈的肌肉倍增基因，且其氨基酸序列具有高度保守性，推测应具有相同的功能；尤其优选地，该鱼体为硬骨鱼纲鲈行目(Perciforms);尤其优选地，该鱼体为硬骨鱼纲S卢行目鯧科(Serranidae);尤其优选地,该鱼体为硬骨鱼纲S卢行目鯧科石斑亚科(Epinephelinae);尤其优选地，该鱼体为硬骨鱼纲硬骨鱼纲鲈行目鯧科石斑亚科石斑属(Epinephelus);最佳地,该鱼体为点带石斑鱼(Epinephelus coioides)。根据本发明的饲料组合物利用抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白质的功能以提高脊椎动物的饲料转换率，其可针对基因、转录反应、翻译反应、蛋白质活性及信号转导路径等各阶段以抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白质的功能，本发明所属技术领域中具通常知识者可选择适当的操作以抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白质的功能，例如利用基因敲除方法去除基因体中的富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増基因、抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白质本身的活性或是抑制受体蛋白的作用。优选地，富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白质的功能是通过免疫抑制法而抑制，其利用抑制蛋白质活性的方式抑制其功能，可对脊椎动物产生较小的系统性副作用。在本发明的一个优选的具体实施例中，免疫抑制法为给予脊椎动物富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白质、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白质的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白质或其片段的抗体。优选地，该富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白质的片段为抗原性片段。本发明所属技术领域中具通常知识者可克隆得编码富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白质的基因，表达该蛋白或其抗原性片段，并将其免疫至动物体内，而得到该抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白质的抗体或其抗原性片段的抗体。根据本发明的抗体可通过将富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白质或其抗原性片段 免疫其它动物，并纯化出抗体而得，或是直接将富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍増蛋白质或其抗原性片段免疫脊椎动物体，使该脊椎动物体本身产生抗体。根据本发明的抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体，优选地，该抗体为多克隆抗体。本发明所述的“抗原性片段”是指蛋白质抗原中，可引起免疫反应产生的抗原的片段，其可经由结构预测或是选取蛋白质片段观察免疫动物的免疫反应而得该片段。肌肉倍増蛋白质在序列上与其它TGF-P家族成员具高相似度，包括三个部分
(I)N端疏水区域，作为蛋白分泌释出的信号；(2)具高度保守性的蛋白切割位置RXRR(序列辨识编号2) ； (3)半胱氨酸丰富的C端活性区域(Sharma等人’ 1999, Journal ofcellular physiology 180;1_9)。许多报告证实,脊椎动物的肌肉倍增蛋白质的氨基酸序列在C端活性区域具有高度保守性(McPherron等人，1997, Nature 387 ;83_90)。目前针对肌肉倍增蛋白质的研究中(Whittemore等人,2003, Biochemical and BiophysicalResearchCommunications 300 ;965_971),发现一对肌肉倍增蛋白质具高度专一性的单克隆抗体JA16，分析与肌肉倍増蛋白质结合位置，发现其结合位置是位于小鼠肌肉倍増蛋白质C端的15个氨基酸DFGLDCDH1STESRC(SEQ ID No : I)，可知该C端区域为抗原性片段，故优选地，该肌肉倍増蛋白质的抗原性片段为肌肉倍増蛋白质的C端区域；更佳地，该肌肉倍增蛋白质的C端区域具有如SEQ ID NO :1所不的序列。另ー方面，由于抗原性片段为小片段胜肽，若直接将此小片段的抗原免疫动物时，免疫反应可能不令人满意，优选地，建构含有多个重复数的线性重复排列抗原(Lineararrayepitopes, LAE),以提高免疫反应。此外,亦可利用细菌毒素以帮助输送抗原,将已去除毒素活性的毒素作为运载系统，利用该毒素的特性，提升整体的免疫效果。优选地，根据本发明的线性重复排列抗原与绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin A, PE)区域Ia融合。绿脓杆菌外毒素的分子量为66kDa，含有613个氨基酸，其蛋白结构主要有三个区域，其中的区域Ia(氨基酸1-252)为受体结合区，负责和哺乳动物细胞膜上的a 2-巨型球蛋白/低密度脂蛋白细胞受体(a 2-macroglobulin/low density lipoprotein receptor,LDLR)结合后，再经由细胞内吞作用(Receptor-mediatedendocytosis)进入细胞的内膜体中，利用绿脓杆菌外毒素已证实能有效增强诱导免疫反应(Donnelly等人，1993, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90 ;3530_3534)。在本发明的一个优选的具体实施例中，该富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白质、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白质的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白质或其片段的抗体生物包埋于丰年虾体中。丰年虾经常作为饲料而容易施予至鱼体中。优选地，该丰年虾为丰年虾幼虫；更优选地，该丰年虾幼虫被冷冻干燥为粉末。在本发明的另一优选的具体实施例中，该富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白质、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白质的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白和/或肌肉倍增蛋白质或其片段的抗体表达于微生物中，该微生物可直接添加于饲料成分中，例如包埋于丰年虾体中。优选地，该微生物的培养液被冷冻干燥为粉末。另一方面，该微生物优选为大肠杆菌。 在本发明的一个优选的具体实施例中，与对照组比较，以免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白功能可有效降低饲料转换率超过约5% ;更优选地为从约8%至约40%。兹以下列实施例来详细说明本发明，但并不意味本发明仅局限于这些实施例所揭示的内容。实施例实施例I :免疫抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白抗原制备对照组及实验组共48只点带石斑鱼，重量平均70± 10g、长度平均五到六时，实验过程约五个月。设计的抗原主要是由使用引物I (SEQ ID NO 3)及引物2(SEQ ID NO 4)扩增spare基因。建立35L发酵培养制程，将含有抗原性片段的大肠杆菌BL21(DE3)菌株培养于50L发酵槽。将4管5mL经LB/氨苄青霉素(Ampicillin)培养基于37°C培养隔夜，并将培养菌株分别接种至0. 2L的LB/氨苄青霉素培养液中，共1L，于37°C振荡培养至00_约0. 3，再加A 35L的培养液中培养，每隔I小时取样测定其OD6tltl监测其生长曲线变化情形。进一步依其生长曲线变化选出适当的时间点，加入最终浓度0. ImMIPTG以诱导大肠杆菌大量表达融合蛋白，并于37°C振荡培养3小时后离心收集菌体。融合蛋白的表达情况则经由SDS-PAGE及西式印迹法(western blotting)确认，以确认优选的35L发酵条件。制备丰年虾生物包埋口服疫苗丰年虾的孵化称取4克的丰年虾干燥卵，置于250mL烧杯中，加入150mL淡水浸泡约半小时。以网筛过滤丰年虾耐久卵并以适量淡水冲洗干净。将丰年虾耐久卵加入5升孵化液中，均匀散布。将打气石置入并开始打气，调节进气体积约为每分钟500立方厘米(维持溶氧大于2ppm)。打开照明设备，室温及水温保持在26至28°C之间。24小时后关掉打气并将照明移至容器底部，将丰年虾幼虫利用趋旋光性诱引至容器底部，静置5分钟，此时未孵化卵及孵化的空卵壳会漂浮至水面，利用虹吸管原理或其它可吸水的器具将上浮卵壳吸除。将孵化的一龄幼虫以网筛(孔径120微米ym)轻柔过滤，以海水轻轻冲洗后更换2升新的孵化液。轻柔搅拌孵化液使丰年虾幼虫均匀散布，吸取一毫升孵化液滴入I毫升方格计数盘中，为避免幼虫的扰动，可以放置在50°C加热盘上加热十分钟杀死幼虫，方便计数。计数时将计数盘置于解剖显微镜下，放大倍率设为60 100倍观察。此计数盘上有划线1000小格，计算方式可随机选取10X 10小格(0. I毫升幼虫数)计算幼虫只数，以同样方法重复计算盘上其它位置数量后取平均数，再乘以10倍即为每毫升幼虫数，或是可以将盘上所有幼虫全部计数亦可。根据计算结果，调整丰年虾密度至每毫升约为500只。将打气石置入并开始打气，调节进气体积约为每分钟300至400立方厘米(維持溶氧大于2ppm)。室温及水温保持在26 28°C之间，培养12至18小时后，丰年虾将会进行第一次脱壳而长成ニ龄幼虫，此时即可以进行生物包埋步骤。生物包埋将大肠杆菌以IOOOXg离心沉降。倒除多余的培养基，并用等量的PBS将菌体重新悬浮，洗去菌体上多余培养基。再以1000Xg离心一次，用适量的PBS重新悬浮菌体，制备成浓度为I X 101(lCfu/mL的菌液。杀菌方法为加热杀菌法，将菌液置于65°C水浴槽中加热10分钟，杀菌完毕后置于冰上10分钟。将丰年虾ニ龄幼虫分装为所需要的体积，接着将准备好的菌液加入其中，使大肠杆菌终浓度约为lX101(lCfu/mL，适度打气2小吋。
包埋结果确认采样前先将打气关掉，吸取2毫升丰年虾包埋液至小网筛上并以大量清水冲洗。将丰年虾幼虫吸出移入离心管中。将微量离心管置于-20度冰箱10分钟将丰年虾幼虫冻死后取出，倒在九厘米培养皿中并加入少许无菌水将丰年虾幼虫均匀散布，接着以微量吸管吸取500只ニ龄幼虫至微量离心管中，以3000rpm离心使幼虫集中在离心管底部并将离心管中的水分吸除，再吸取IOOy L无菌水加入离心管中。以微量研磨棒将丰年虾幼虫于微量离心管中小心并仔细磨碎。并进行SDS-PAGE及西式印迹法分析。含丰年虾饲料的制作将已经滤食或未滤食的ニ龄丰年虾的水分尽量去除，利用冷冻干燥机将其冻干成粉末，丰年虾粉末与一般粉碎饲料以i : 1000比例进行混合再重新制粒。饲料制作将菌液浓缩，利用冷冻干燥机将其冻干成粉末，菌粉与一般粉碎饲料进行混合，混合比例为Ig饲料混3. 3 X IO9Cfu大肠杆菌粉，再重新制粒。动物实验实验动物共分为四组实验组PEIa-抗原性片段组，对照组分别为喂饲一般饲料、喂饲含丰年虾饲料及喂饲含包埋PEIa片段丰年虾饲料三组，共80只点带石斑鱼，重量平均约52. 36克、长度平均五到六吋，实验过程约四个月。每个星期一、ニ、三喂食含抗原饲料，四、五、六喂食一般饲料，星期日禁食，另外在免疫前以及免疫后每ニ个星期，搜集鱼血液，血液经过静置20 40分钟后凝固，利用离心法处理后取其血液上清液以进行酵素免疫分析，测验血液中对抗内生性蛋白抗体的カ价。酵素免疫分析法利用抗原抗体专ー性结合的原理，首先将Iy g(100ii USPARC-His重组蛋白片段与附着缓冲液混合均匀，并加入96孔Nunc-Immuno 盘(NUNC )底部于4°C静置隔夜，使蛋白结合至底盘，以PBST洗涤3次后，加入100 u L、含有5%脱脂牛奶的TBST溶液中于室温下反应I小时，再以PBST洗涤至少3次，将以PBST稀释的待测血清作为ー级抗体，加入后于室温静置约2 3小吋，以PBST洗涤至少3次，接着加入ニ级抗体的老鼠抗石斑鱼血清100 u L静置室温下I小时，以PBST洗涤至少3次，最后加入100 u L后方接有碱性磷酸酶的羊抗鼠血清作为三级抗体，于室温静置I小时后以PBST洗涤，最后每孔各加入50 y L受质溶液p-硝基苯磷酸盐(p-Nitrophenyl Phosphate)锭于室温下静置30分钟(视呈色情况而定)，再以酵素细胞分析仪中读取OD4tl5的吸光值。结果丰年虾组首先抽取石斑鱼血液，分离出血清之后利用酵素 免疫分析法，检测喂饲含有肌肉抑制素抗原性片段的重组融合蛋白后，各时期的石斑鱼血清对于抗重组石斑鱼肌肉倍增蛋白质C端抗原活性区域的抗体效价。抗体效价于免疫后第十周开始被侦测到，持续上升至第二十二周，其中PEIa-抗原性片段组的抗体效价较三组对照组喂饲一般饲料、喂饲含丰年虾饲料及喂饲含包埋PEIa片段丰年虾饲料为高，抗体效价达到超过400。(如图I)计算二十四周内的动物实验期间的总饲料消耗量、体重变化(如图2)以及饲料转换率，统计发现PEIa-抗原性片段组与其它三组对照组于二十四周内消耗总饲料量大约相等，PEIa-抗原性片段组平均饲料转换率为I. 46，喂饲一般饲料、喂饲含丰年虾饲料及喂饲含包埋PEIa片段丰年虾饲料分别为2. 67，2. 58以及2. 81，即喂饲肌肉倍增蛋白质抗原性片段的实验组，在上市前的养成过程可花费较少的饲料得到肉质较丰腴的石斑鱼(如表I所示)。表I :
对照丰年丰年虾丰年虾及 组虾及PEIaPEIa-抗原性片段
FCR 2.672.582.811.46实施例2 :免疫抑制肌肉倍增蛋白质制备表达肌肉倍增蛋白质抗原性片段重组蛋白的大肠杆菌建立35L发酵培养制程，将含有抗原性片段的大肠杆菌BL21(DE3)菌株培养于50L发酵槽。将4管5mL经LB/氨苄青霉素(Ampicillin)培养基于37°C培养隔夜，并将培养菌株分别接种至0. 2L的LB/氨苄青霉素培养液中，共1L，于37°C振荡培养至00_约0. 3，再加A 35L的培养液中培养，每隔I小时取样测定其OD6tltl监测其生长曲线变化情形。进一步依其生长曲线变化选出适当的时间点，加入最终浓度0. ImMIPTG以诱导大肠杆菌大量表达融合蛋白，并于37°C振荡培养3小时后离心收集菌体。融合蛋白的表达情况则经由SDS-PAGE及西式印迹法(western blotting)确认，以确认优选的35L发酵条件。制备丰年虾生物包埋口服疫苗丰年虾的孵化称取4克的丰年虾干燥卵，置于250mL烧杯中，加入150mL淡水浸泡约半小时。以网筛过滤丰年虾耐久卵并以适量淡水冲洗干净。将丰年虾耐久卵加入5升孵化液中，均匀散布。将打气石置入并开始打气，调节进气体积约为每分钟500立方厘米(维持溶氧大于2ppm)。打开照明设备，室温及水温保持在26至28°C之间。24小时后关掉打气并将照明移至容器底部，将丰年虾幼虫利用趋旋光性诱引至容器底部，静置5分钟，此时未孵化卵及孵化的空卵壳会漂浮至水面，利用虹吸管原理或其它可吸水的器具将上浮卵壳吸除。将孵化的ー龄幼虫以网筛(孔径120微米ym)轻柔过滤，以海水轻轻冲洗后更换2公升新的孵化液。轻柔搅拌孵化液使丰年虾幼虫均匀散布，吸取一毫升孵化液滴入I毫升方格计数盘中，为避免幼虫的扰动，可以放置在50°C加热盘上加热十分钟杀死幼虫，方便计数。计数时将计数盘置于解剖显微镜下，放大倍率设为60 100倍观察。此计数盘上有划线1000小格，计算方式可随机选取10X 10小格(0. I毫升幼虫数)计算幼虫只数，以同样方法重复计算盘上其它位置数量后取平均数，再乘以10倍即为每毫升幼虫数，或是可以将盘上所有幼虫全部计数亦可。根据计算结果，调整丰年虾密度至每毫升约为500只。将打气石置入并开始打气，调节进气体积约为每分钟300至400立方厘米(維持溶氧大于2ppm)。室温及水温保持在26 28°C之间，培养12至18小时后，丰年虾将会进行第一次脱壳而长成ニ龄幼虫，此时即可以进行生物包埋步骤。生物包埋将大肠杆菌以IOOOXg离心沉降。倒除多余的培养基，并用等量的PBS将菌体重新悬浮，洗去菌体上多余培养基。再以1000Xg离心一次，用适量的PBS重新悬浮菌体，制备成浓度为I X 101(lCfu/mL的菌液。杀菌方法为加热杀菌法，将菌液置于65°C水浴槽中加热10分钟，杀菌完毕后置于冰上10分钟。将丰年虾ニ龄幼虫分装为所需要的体积，接着将准备好的菌液加入其中，使大肠杆菌终浓度约为lX101(lCfu/mL，适度打气2小吋。 包埋结果确认采样前先将打气关掉，吸取2毫升丰年虾包埋液至小网筛上并以大量清水冲洗。将丰年虾幼虫吸出移入离心管中。将微量离心管置于-20度冰箱10分钟将丰年虾幼虫冻死后取出，倒在九厘米培养皿中并加入少许无菌水将丰年虾幼虫均匀散布，接着以微量吸管吸取500只ニ龄幼虫至微量离心管中，以3000rpm离心使幼虫集中在离心管底部并将离心管中的水分吸除，再吸取IOOy L无菌水加入离心管中。以微量研磨棒将丰年虾幼虫于微量离心管中小心并仔细磨碎。并进行SDS-PAGE及西式印迹法分析。动物实验实验动物共分为四组实验组PEIa-抗原性片段组，对照组分别为喂饲一般饲料、喂饲含丰年虾饲料及喂饲含包埋PEIa片段丰年虾饲料三组，共40只点带石斑鱼，重量平均约157g、长度平均五到六吋，实验过程约四个月。每个星期一、ニ、三喂食含抗原饲料，四、五、六喂食一般饲料，星期日禁食，另外在免疫前以及免疫后每ニ个星期，搜集鱼血液，血液经过静置20 40分钟后凝固，利用离心法处理后取其血液上清液以进行酵素免疫分析，测验血液中对抗内生性蛋白抗体的カ价。含丰年虾饲料的制作将已经滤食或未滤食的ニ龄丰年虾的水分尽量去除，利用冷冻干燥机将其冻干成粉末，丰年虾粉末与一般粉碎饲料以i : 1000比例进行混合再重新制粒。饲料制作将菌液浓缩，利用冷冻干燥机将其冻干成粉末，菌粉与一般粉碎饲料进行混合，混核比例为Ig饲料混3. 3 X IO9Cfu大肠杆菌粉，再重新制粒。结果丰年虾组首先抽取石斑鱼血液，分离出血清之后利用酵素免疫分析法，检测喂饲含有肌肉抑制素抗原性片段的重组融合蛋白后，各时期的石斑鱼血清对于抗重组石斑鱼肌肉倍增蛋白质C端抗原活性区域的抗体效价。抗体效价于免疫后第十周开始被侦测到，持续上升至第十六周，其中PEIa-抗原性片段组的抗体效价较三组对照组喂饲一般饲料、喂饲含丰年虾饲料及喂饲含包埋PEIa片段丰年虾饲料为高，抗体效价达到大约920。(如图3)计算四个月的动物实验期间的总饲料消耗量以及饲料转换率，统计发现PEIa-抗原性片段组与其它三组对照组于四个月内消耗总饲料量大约相等，PEIa-抗原性片段组平均饲料转换率为I. 35，喂饲一般饲料、喂饲含丰年虾饲料及喂饲含包埋PEIa片段丰年虾饲料分别为I. 72,1. 76以及I. 82，即喂饲肌肉倍增蛋白质抗原性片段的实验组，在上市前的养成过程可花费较少的饲料得到肉质较丰腴的石斑鱼(如表2所示)。表2:
权利要求
1.一种脊椎动物用饲料组合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗体。
2.根据权利要求I的饲料组合物，其中该脊椎动物为鱼。
3.根据权利要求I的饲料组合物，进一步包含肌肉倍增蛋白质、肌肉倍增蛋白质的片段或抗肌肉倍增蛋白质或其片段的抗体。
4.根据权利要求I或3的饲料组合物，其中该富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗体、肌肉倍增蛋白质、肌肉倍增蛋白质的片段或抗肌肉倍增蛋白质或其片段的抗体生物包埋于丰年虾体中。
5.根据权利要求I或3的饲料组合物，其中该富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗体、肌肉倍增蛋白质、肌肉倍增蛋白质的片段或抗肌肉倍增蛋白质或其片段的抗体表达于微生物中。
6.根据权利要求5的饲料组合物，其中该微生物为大肠杆菌。
7.根据权利要求I或3的饲料组合物，其中该富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白质的片段融合至绿脓杆菌外毒素区域la。
8.根据权利要求I或3的饲料组合物，其中该富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白质的片段为抗原性片段。
9.根据权利要求I或3的饲料组合物，其中该富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白质的片段位于融合蛋白上。
10.根据权利要求I或3的饲料组合物，其中该富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或肌肉倍增蛋白质的片段线性重复排列于该融合蛋白中。
全文摘要
本发明提供一种脊椎动物用饲料组合物，其包含富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白的片段或抗富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白或其片段的抗体。
文档编号A23K1/18GK102793079SQ20111040805
公开日2012年11月28日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年5月27日
发明者陈宗岳, 黄意菱 申请人:陈宗岳