专利名称：小桐子高频再生方法
技术领域：
本发明涉及生物组织培养育苗技术领域，尤其涉及小桐子高频再生方法。
背景技术：
小桐子(/airoMa curcas L )，又叫麻疯树、麻风树、膏桐、黑皂树、木花生、油芦子、亮桐、臭梧桐等，属大戟科(^Modiaceae)麻疯树属Uatrophi )，落叶灌木或小乔木，是一种多年生木本油料植物。小桐子原产美洲，广泛分布于热带亚热带地区。小桐子可全株开发，其果实、枝、叶均能利用。小桐子种子含油率高，经过加工可制成生物柴油。小桐子种子、树皮、叶、根和乳汁中含有多种成分的生物药源，可提取制作生物医药和生物农药。小桐子种子加工后的油饼蛋白质含量较高，脱毒后可制作生物饲料，未脱毒的可制作优质的有机生物肥。另外，小桐子茎叶有毒，牲畜不吃，病虫较少，不易燃烧， 可作为田间地边的生物篱和防风防火屏障。培育小桐子能源林，利用其种子提炼生物柴油是小桐子产业发展的主要方向。我国现有栽培和半野生的小桐子，其繁殖主要靠种子繁殖和扦插繁殖，繁殖的周期长，成本高。又因其为木本植物，采用常规育种来改变其遗传性状相当困难，因此采用现代生物技术如转基因技术等成为首选。一些国家和地区已经开始了对小桐子进行了分子水平的育种工作。选育的优良品种大量繁殖，通过组培方式快速繁殖小桐子将在小桐子选育种生产上有重要的应用价值。目前，关于小桐子的组织培养及快速繁殖的报道较多，例如陆伟达、魏琴、唐琳等人发表《麻疯树愈伤组织的诱导及快速繁殖》(《应用与环境生物学报》2003年第9卷第2 期，第127 130页)；陈金洪、高敏、黄记生等人发表的《麻疯树茎段离体培养及快速繁殖研究》(《广西农业科学》2006年第37卷第3期，第22广223页)等，然而这些现有繁殖方法存在以下不足之处1.均采用不同的激素浓度组合诱导愈伤组织和芽分化，未涉及采用高浓度单激素诱导愈伤组织实验；2.所采用不同激素配比中，单个激素的浓度均在0. 0广3mg/ 1 ；3.均采用不同外植体诱导愈伤组织，愈伤组织诱导率40、0%，但不定芽的分化率相差极大，为0 80%。
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题在于，提供一种小桐子高频再生方法，以提升高频再生率。为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案一种小桐子高频再生方法，包括如下步骤
获得无菌苗步骤，选取饱满的野生小桐子种子，剥去外壳，消毒处理后再剥离胚乳，将完整的种子胚和子叶接种在萌发培养基上萌发培养，获得无菌苗；
愈伤组织初次诱导步骤，剪取无菌苗长势好的子叶再切成子叶小块并接入愈伤组织初次诱导培养基黑暗培养7 11天，该愈伤组织初次诱导培养基成分为MS培养基+0. 5 8. 0mg/L吲哚丁酸，PH值5.8 ；
愈伤组织再次诱导步骤，取出经过初次诱导的愈伤组织，转入愈伤组织再次诱导培养基黑暗培养12 14天，该愈伤组织再次诱导培养基成分为MS培养基+0.广2.0 mg/L 6-苄基嘌呤+0. 05 1. 0 mg/L吲哚丁酸；
再生芽诱导步骤，取出经过再次诱导的愈伤组织转入不定芽诱导培养基光照培养直至获得分化出的不定芽，该不定芽诱导培养基成分为MS培养基+0. 5^1.5 mg/L 6-苄基嘌呤 +0. 05 0. 1 mg/L吲哚丁酸+(Tl. 0 mg/L的赤霉素；
生根培养步骤，选取茎叶生长均勻的不定芽切下，并在0. Γ2. 0 mg/L的吲哚丁酸或生根粉中浸泡5 120min，接入生根培养基进行生根培养，该生根培养基成分为1/2MS培养基 +0 2 mg/L吲哚丁酸；
炼苗移栽步骤，选择长出至少3条长度超过3cm的根的生根苗，炼苗移栽。进一步地，萌发培养基主要包括MS培养基，pH值5. 8，每瓶培养基接2_3颗，接好的材料在M_26°C下先在暗培养3飞天再光照培养，光照12-16h/天，光照强度1600-2000 lx，光照培养10-12天后获得无菌苗。进一步地，所述萌发培养基中还加入有3. 0%蔗糖和0. 7%琼脂。进一步地，愈伤组织初次诱导步骤中，切好的子叶块是正面朝上地接入愈伤组织初次诱导培养基。进一步地，愈伤组织初次诱导步骤中，将无菌苗长势好的子叶放入垫有无菌滤纸的灭菌的盘中，加入无菌水，将子叶切成0. 3^0. 5cm2大小的小块，愈伤组织初次诱导培养时，温度为24 26°C。进一步地，愈伤组织再次诱导步骤中，培养温度为24l6°C。进一步地，再生芽诱导步骤中，培养条件为温度M 26°C，光照时间12h/天，光照强度1600 2000 Ix,培养20 30天。进一步地，生根及移栽步骤中，不定芽的切法为芽在结下广4mm处平切。进一步地，炼苗移栽步骤，将选中的生根苗在自然光条件下过渡广3星期，期间逐渐开盖炼苗并移栽至温室。进一步地，所述获得无菌苗步骤中选用的野生小桐子种子为中国云南元谋野生小桐子种子。通过采用上述技术方案，本发明至少具有如下有益效果
1.本发明中高频的再生体系的建立可使转化工作顺利进行，获得较高的遗传转化效率及效果。通过对小桐子种子萌发无菌苗的不同部位作为外植体进行再生，筛选出子叶正面朝上的再生频率最高可达90%以上，从种子材料的获得到再生植株需65 80天，外植体不受季节限制，为小桐子的遗传转化奠定基础。2.本发明方法是在无菌操作中完成，不受时间和地域限制，可高效提供小桐子的再生苗方法，可为大规模生产及分子育种等生物技术手段提供技术支持。3本发明中在愈伤组织培养阶段用到了黑暗培养，这对于愈伤组织的生长有利， 能有效的抑制愈伤组织的褐化，且黑暗条件培养有利于细胞的脱分化。4本发明中用到了高浓度的单激素培养这一目前尚未见报道的技术手段，获得了很好的愈伤组织及再生芽分化效果。
5本发明中在愈伤诱导步骤中分子叶正反面的朝向做了区分实验，发现两者存在差异，相比之下，正面朝上效果更佳。
具体实施例方式本发明提供一种小桐子高频再生方法，包括如下步骤
51)获得无菌苗步骤；
52)愈伤组织初次诱导步骤；
53)愈伤组织再次诱导步骤；
54)再生芽诱导步骤；
55)生根培养步骤；
56)炼苗移栽步骤。以下对各步骤进行具体描述。Si)获得无菌苗步骤，采集中国本土野生小桐子种子，在本发明的实施方式中，选用云南元谋野生小桐子种子为材料，选取饱满的种子，剥去外壳，进行消毒处理，消毒处理的具体操作如下
(1)用体积百分比75%的乙醇溶液浸泡30秒；
(2)无菌水洗4 5次;
(3)0.1% (质量百分比)升汞浸泡3-10分钟；
(4)倒出升汞，用无菌水洗4-6次，每次5分钟；
(5)加入无菌水，浸泡2-4小时。消毒处理后的种子再剥离胚乳，将完整的种子胚和子叶接种在萌发培养基上萌发培养，萌发培养基通常采用MS培养基即可，必要时还可以视情况进一步加入3. 0%蔗糖和 0. 7%琼脂，调节pH值5. 8，每瓶培养基接2-3颗，接好的材料在M_26°C下先在暗培养3、 天再光照培养，光照12-16h/天，光照强度1600-2000 Ix,通常地，光照培养10-12天后可得到无菌苗。可以理解地，获得无菌苗步骤并非本发明创新的核心所在，现有的各种选种、消毒处理及萌发培养的方式均可应用于本发明。S2)愈伤组织初次诱导步骤，其具体操作如下(1)取灭菌的盘，垫上两层无菌滤纸；
(2)取出无菌苗，用剪刀剪下长势较好的子叶，放入盘中；
(3)然后加入少量无菌水，用刀将其切成0.3^0. 5cm2大小；
(4)将切好的子叶块接入愈伤组织初次诱导培养基，该培养基成分为MS培养基+0.5 8. 0 mg/L吲哚丁酸，并调PH值5. 8 ；
(5)接种好的材料在温度M 26°C下黑暗培养7 11天。在愈伤组织初次诱导步骤中，采用的愈伤组织初次诱导培养基相当关键，其中，吲哚丁酸的浓度达到0. 5^8. Omg/L这一现有技术中从未使用过的高浓度。此外，将子叶块接入愈伤组织初次诱导培养基时，子叶块正面朝上还是反面朝上对对愈伤组织诱导及芽分化率诱导会有所影响，为确定该影响，进行了三组实验，实验数据如下表1所示。表1 子叶正、反面朝向对分化芽的影响I I . ::11^ii Ii ； mn . |
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IIIK <m i; ·<:. 1 ITSSι ι χ ri: III AHI I4| 1 II
III H II ··￥I: 51: Ι ^ II| Sl | ？Il ￥> IS3)愈伤组织再次诱导步骤，其具体操作如下
(1)取出黑暗培养的材料，转入愈伤组织再次诱导培养基，该培养基成分为MS培养基 +0. Γ2. 0 mg/L 6-苄基嘌呤 +0. 05 1. 0 mg/L 吲哚丁酸；
(2)接入培养基中的材料在温度24l6°C，黑暗培养12 14天。S4)再生芽诱导步骤，其具体操作如下
(1)将暗培养的愈伤组织取出转入不定芽诱导培养基，该培养基成分为MS培养基 +0. 5 1. 5 mg/L 6-苄基嘌呤+0. 05 0. 1 mg/L吲哚丁酸+(Tl. 0 mg/L的赤霉素；
(2)培养条件为温度2416°C，光照时间为12h/天，光照强度为160(Γ2000lx，培养 2(Γ30天即获得分化出的不定芽。S5)生根培养步骤，其具体操作如下
(1)选取茎叶生长均勻的不定芽切下，切法为芽在结下广4mm处平切；
(2)并在0.广2.0mg/L的吲哚丁酸或生根粉中浸泡5 120 min，接入生根培养基进行生根培养，该生根培养基成分为1/2MS培养基+0.3 mg/L吲哚丁酸；
S6)炼苗移栽步骤，选择长出至少3条长度超过3cm的根的生根苗，进行炼苗移栽。下面结合几个实例详述描述本发明的实施方案。需要说明的是，下述实例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实例来限定本发明的保护范围。实例1
本实例各步骤具体如下
Sl)获得无菌苗步骤采集云南元谋野生小桐子种子，挑取饱满的种子，剥去外壳，在体积百分比75%的乙醇溶液中浸泡30秒，再用无菌水冲洗2-3次，然后在0. 1%氯化汞中消毒 3-lOmin，用无菌水冲洗5_7次，再用无菌水浸泡2_4小时，然后剥去胚乳，取完整的胚和子叶接种于MS培养基中，每瓶接2-3颗，23-26°C下暗培养2_4天后再转入光照培养10-12天， 得到无菌苗。S2)愈伤组织初次诱导步骤选取生长健壮，叶面平整均勻的无菌苗子叶，取灭菌的盘，垫上无菌滤纸，加入少量无菌水，切成0. 5cm2大小，子叶片形态学正面朝上接入愈伤组织初次诱导培养基置于M_26°C暗培养7天，所述愈伤组织初次诱导培养基为C4固体培养基，其成分为MS培养基+4. Omg/L的吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%琼脂，pH5. 8。S3)愈伤组织再次诱导步骤将培养后的材料转入愈伤组织再次诱导培养基Cl，
6置于M-26°C光照培养14天，光照强度为160(Γ2000 lx，所述愈伤组织再次诱导培养基Cl 成分为MS培养基+1. 5 mg/L 6-苄基嘌呤+0. 05 mg/L 3-吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%琼脂，pH5. 8。S4)再生芽诱导步骤将愈伤组织转出，接入不定芽分化培养基SR13，温度控制在 24l6°C，光照时间为12h/天光照强度为1600 2000 lx，培养20 30天即获得分化出的不定芽，所述不定芽分化培养基SR13成分为MS培养基+1.0 mg/L 6-苄基嘌呤+0. 1 mg/L吲哚丁酸+0. 5mg/L的赤霉素，附加3. 0%蔗糖、0. 7%琼脂，ρΗ5· 8。S5)生根培养步骤将不定芽切下，切口选择在结下2mm处，用浓度为1. 0 mg/L吲哚丁酸浸泡切口 5min后，接入生根培养基，所述生根培养基成分为1/2MS +0.3 mg/L吲哚丁酸，培养8 20天后生根率达90%以上；
S6)炼苗移栽步骤选取生长出3条以上长度超过3cm的根的生根苗，在自然光条件下过度广3星期，逐渐开盖炼苗并移栽至温室。实例2
本实例的各步骤具体如下
Si)获得无菌苗步骤采集云南元谋野生小桐子种子，挑取饱满的种子，剥去外壳，在体积百分比75%的乙醇溶液中浸泡30秒，无菌水冲洗2-3次，然后在0. 1%氯化汞中消毒 3-lOmin，无菌水冲洗5_7次，然后用无菌水浸泡2_4小时后，再剥去胚乳，取完整的胚和子叶，接种于MS培养基中，每瓶接2-3颗，23-260C暗培养2_4天后转入光照培养10-12天，得到无菌苗。S2)愈伤组织初次诱导步骤选取生长健壮，叶面平整均勻的无菌苗子叶，取灭菌的盘，垫上无菌滤纸，加入少量无菌水，切成0. 5cm2大小，子叶片形态学正面朝上接入愈伤组织初次诱导培养基，本实例中，所述愈伤组织初次诱导培养基为C2固体培养基，其成分为=MS培养基+0. 5 mg/L的吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%琼脂，pH5. 8，置于M_26°C暗培养9天。S3)愈伤组织再次诱导步骤将培养后的材料转入愈伤组织再次诱导培养基C11， 置于M-26°C光照培养14天，光照强度为160(Γ2000 lx，所述愈伤组织再次诱导培养基Cll 成分为=MS培养基+0. 5mg/L 6-苄基嘌呤+0. lmg/L 3-吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%琼脂， ρΗ5· 8。S4)再生芽诱导步骤将愈伤组织转出，接入不定芽分化培养基SR10，温度控制在 24l6°C，光照时间为12h/天光照强度为1600 2000 lx，培养20 30天获得不定芽，所述不定芽分化培养基SRlO成分为MS培养基+0. 5 mg/L 6-苄基嘌呤+0. 05 mg/L吲哚丁酸 +0. 25 mg/L 的赤霉素 +3. 0% 蔗糖 +0. 7% 琼脂，ρΗ5· 8。S5)生根培养步骤将不定芽切下，切口选在结下2mm处，用浓度为1. 0 mg/L吲哚丁酸浸泡切口 5min后，接入生根培养基培养基，所述生根培养基培养基成分为1/2MS培养基+1 mg/L吲哚丁酸，培养8 20后生根率达90%以上；
S6)炼苗移栽步骤选取生长出3条以上长度超过3cm的根的生根苗，在自然光条件下过度广3星期，逐渐开盖炼苗并移栽至温室。实例3
各步骤具体如下Sl)获得无菌苗步骤采集云南元谋野生小桐子种子，挑取饱满的种子，剥去外壳，用体积百分比75%乙醇中浸泡30秒，无菌水冲洗2-3次，然后在0. 1%氯化汞中消毒3-lOmin，无菌水冲洗5-7次，然后，用无菌水浸泡2-4小时后剥去胚乳，取完整的胚和子叶，接种于MS 培养基中，每瓶接2-3颗，2316°C暗培养2-4天后转入光照培养10-12天，得到无菌苗。S2)愈伤组织初次诱导步骤选取生长健壮，叶面平整均勻的无菌苗子叶，取灭菌的盘，垫上无菌滤纸，加入少量无菌水，切成0. 5 cm2大小，子叶片形态学正面朝上接入愈伤组织初次诱导培养基，置于M_26°C暗培养11天，所述愈伤组织初次诱导培养基为C6固体培养基，其成分为MS培养基+含8. 0 mg/L的吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%琼脂，pH5. 8。S3)愈伤组织再次诱导步骤将培养后的材料转入愈伤组织再次诱导培养基，置于 24j6°C光照培养14天，光照强度为160(Γ2000 lx，愈伤组织再次诱导培养基为C13培养基，其成分为MS培养基+2 mg/L 6-苄基嘌呤+0.1 mg/L 3-吲哚丁酸+3. 0%蔗糖+0. 7%琼脂，pH5. 8。S4)再生芽诱导步骤将愈伤组织转出，接入不定芽分化培养基SR17，温度控制在 24l6°C，光照时间为12h/天，光照强度为160(Γ2000 lx，培养20 30天即获得分化出的不定芽，所述不定芽分化培养基SR17成分为MS培养基+1.5 mg/L 6-苄基嘌呤+0. 05 mg/L 吲哚丁酸+0. 5 mg/L的赤霉素+3. 0%蔗糖+0. 7%琼脂，pH5. 8。S5)生根培养步骤将不定芽切下，切口选择在结下2mm处，用浓度为1. 0 mg/L吲哚丁酸浸泡切口 5min后，接入生根培养基，所述生根培养基成分为1/2MS培养基+2 mg/L 吲哚丁酸，培养8 20天后生根率达90%以上；
S6)炼苗移栽步骤选取生长出3条以上长度超过3cm的根的生根苗，在自然光条件下过度广3星期，逐渐开盖炼苗并移栽至温室。以上三个实例中，各自使用的样品总数量、愈伤组织数量及经不定芽诱导培养后的芽分化数量如下表2所示
表2 各实例中芽分化数量统计表
权利要求
1.一种小桐子高频再生方法，其特征在于，包括如下步骤获得无菌苗步骤，选取饱满的野生小桐子种子，剥去外壳，消毒处理后再剥离胚乳，将完整的种子胚和子叶接种在萌发培养基上萌发培养，获得无菌苗；愈伤组织初次诱导步骤，剪取无菌苗长势好的子叶再切成子叶小块并接入愈伤组织初次诱导培养基黑暗培养7 11天，该愈伤组织初次诱导培养基成分为MS培养基+0. 5 8. 0 mg/L吲哚丁酸，PH值5.8 ；愈伤组织再次诱导步骤，取出经过初次诱导的愈伤组织，转入愈伤组织再次诱导培养基黑暗培养12 14天，该愈伤组织再次诱导培养基成分为MS培养基+0.广2.0 mg/L 6-苄基嘌呤+0. 05 1. 0 mg/L吲哚丁酸；再生芽诱导步骤，取出经过再次诱导的愈伤组织转入不定芽诱导培养基光照培养直至获得分化出的不定芽，该不定芽诱导培养基成分为MS培养基+0. 5^1.5 mg/L 6-苄基嘌呤 +0. 05 0. 1 mg/L吲哚丁酸+(Tl. 0 mg/L的赤霉素；生根培养步骤，选取茎叶生长均勻的不定芽切下，并在0.广2.0 mg/L的吲哚丁酸或生根粉中浸泡5 120min，接入生根培养基进行生根培养，该生根培养基成分为1/2MS培养基 +0 2 mg/L吲哚丁酸；炼苗移栽步骤，选择长出至少3条长度超过3cm的根的生根苗，炼苗移栽。
2.根据权利要求1所述的小桐子高频再生方法，其特征在于萌发培养基主要包括MS 培养基，PH值5. 8，每瓶培养基接2-3颗，接好的材料在M_26°C下先在暗培养3飞天再光照培养，光照12_16h/天，光照强度1600-2000 lx，光照培养10-12天后获得无菌苗。
3.根据权利要求2所述的小桐子高频再生方法，其特征在于所述萌发培养基中还加入有3. 0%蔗糖和0. 7%琼脂。
4.根据权利要求1所述的小桐子高频再生方法，其特征在于愈伤组织初次诱导步骤中，切好的子叶小块是正面朝上地接入愈伤组织初次诱导培养基。
5.根据权利要求1或4所述的小桐子高频再生方法，其特征在于愈伤组织初次诱导步骤中，将无菌苗长势好的子叶放入垫有无菌滤纸的灭菌的盘中，加入无菌水，子叶是切成 0. 3^0. 5cm2大小的子叶小块，愈伤组织初次诱导培养时，温度为24l6°C。
6.根据权利要求1所述的小桐子高频再生方法，其特征在于愈伤组织再次诱导步骤中，培养温度为M 26°C。
7.根据权利要求1所述的小桐子高频再生方法，其特征在于再生芽诱导步骤中，培养条件为温度M 26°C，光照时间12h/天，光照强度1600 2000 lx，培养20 30天。
8.根据权利要求5所述的小桐子高频再生方法，其特征在于生根及移栽步骤中，不定芽的切法为芽在结下广4mm处平切。
9.根据权利要求1所述的小桐子高频再生方法，其特征在于炼苗移栽步骤，将选中的生根苗在自然光条件下过渡广3星期，期间逐渐开盖炼苗并移栽至温室。
10.根据权利要求1所述的小桐子高频再生方法，其特征在于所述获得无菌苗步骤中选用的野生小桐子种子为中国云南元谋野生小桐子种子。
全文摘要
本发明涉及一种小桐子高频再生方法，包括获得无菌苗步骤，选取饱满的野生小桐子种子，消毒处理后将种子胚和子叶接种在萌发培养基上萌发培养，获得无菌苗；愈伤组织初次诱导步骤，剪取无菌苗长势好的子叶切成小块，接入愈伤组织初次诱导培养基黑暗培养7~11天；愈伤组织再次诱导步骤，取出经过初次诱导的愈伤组织，转入愈伤组织再次诱导培养基黑暗培养12~14天；再生芽诱导步骤，取出经过再次诱导的愈伤组织转入不定芽诱导培养基光照培养直至获得分化出的不定芽；生根培养步骤，选取茎叶生长均匀的不定芽切下，并在吲哚丁酸或生根粉中浸泡后接入生根培养基进行生根培养；炼苗移栽步骤。本发明愈伤率可达100%，不定芽分化率可达90%左右。
文档编号A01H4/00GK102524065SQ201110426508
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月19日 优先权日2011年12月19日
发明者孔晓香, 孙怀娟, 李耿光, 李艳梅, 陈小莲 申请人:普罗米绿色能源(深圳)有限公司