专利名称：一种芒属植物芒荻杂种9号体胚组培快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及芒荻杂种9号基于胚性愈伤的组培快繁技术领域，更具体涉及一种芒属植物芒荻杂种9号体胚组培快速繁殖方法，它适用于以芒荻杂种9号幼穗为外植体通过愈伤诱导途径获得幼苗，以及增殖、生根、驯化与移栽。
背景技术：
国际上化石能源日益紧缺，化石能源带来的污染也日趋严重，目前新能源的开发利用已经成为世界各国所面临的新课题。在全球寻找替代化石能源与第一代能源作物的努力过程中，芒草已逐渐进入了研究人员的视野，有望成为第二代能源植物。国内外已有众多科学研究机构开始进行芒属植物有的研究。湖南农业大学通过将芒与南荻人工杂交培育出了湘杂芒1号、2号、3号三个新品种。而已在欧美作为能源植物的奇岗就是一种天然的二倍体芒和四倍体荻的杂种，在20世纪90年代就有相关组培快繁技术的报道，研究者们分别采用了幼叶、下胚轴、幼根，幼穗作为外植体进行芒属植物的快繁技术研究，但其出愈率和分化率都各不相同，以幼穗的繁殖效率最高，但未获得胚性愈伤。另外，在2005年也有关于芒属植物利用器官发生途径的组培快繁技术的报道，没得到胚性愈伤。而本研究是利用芒荻杂种9号的幼穗为外植体得到了胚性愈伤，再继续诱导分化、成苗并移栽。因此，本研究不仅达到了快速高效的繁殖芒荻杂种9号的目的，同时为芒荻杂种9号的转基因操作提供了可靠的组培体系。为筛选更加耐旱、耐寒、抗盐碱的新种质，进行人工杂交和育种，以及为基因遗传学分析提供基础。发明内容
本发明的目的是在于提供了一种芒属植物芒荻杂种9号体胚组培快速繁殖方法， 方法易行，操作简便，且分化出愈率和成苗率很高，本方法胚性愈伤出愈率较高，愈伤再诱导生苗率较高，组培苗驯化移栽后，成活率高，适用于芒荻杂种9号种苗产业化生产的快速扩繁，也适用于芒荻杂种9号的转基因操作。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施
本发明的内容包括以芒荻杂种9号幼穗为外植体诱导胚性愈伤的初代培养基，生苗继代培养基，以及幼苗的生根诱导培养基。
一种芒属植物芒荻杂种9号体胚组培快速繁殖方法，其步骤是
(1)幼穗选取选取芒荻杂种9号(来源于本单位湖北光芒能源植物有限公司的杂交育种材料)处于颖花原基形成期的幼穗，幼穗内种子尚未形成，中轴也比较软，还没形成基本的分支。
(2)用初代诱导培养基诱导将其剪成2-3厘米小段，先用75% (体积比)酒精消毒25-3 ，然后用0.1% (质量体积比)氯化汞浸泡(3- 分钟，再用无菌水冲洗2-4 次，将其接种在幼穗的初代诱导培养基(初代诱导培养基是指为获得无性繁殖系所采用的接种外植体的培养基)上。经过(观-30)天的初代诱导，获得胚性愈伤。培养条件为2448°C，暗培养。初代诱导培养基为以下配方选其一 A :MS培养基附加激动素KTl-ang/L， 2,4 二氯苯氧乙酸2，4-D3-5mg/L，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L，或B =MS培养基附加激动素 KT3-^ig/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-Dl-;3mg/L，六水氯化镁 MgCl2 · 6H20 800mg/L，蔗糖 30g/ L,PhytagelR 3g/L。采用这两种培养基中的任何一种培养基都能诱导出状态良好的胚性愈伤组织，生长15天左右在幼穗基部开始出愈，开始愈伤为透明状白色，随着培养时间的增长在愈伤的表面逐渐长出白色或淡黄色愈伤。
(3)用生苗培养基继代培养所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗， (25-30)天继代一次，增殖系数为3-4。培养条件为M_28°C，每天光照14-16个小时(采用人工光源照射)，光强为2000LX。所述的生苗培养基配方为以下配方选其一 ·Λ -MS培养基附加激动素 KTl-ang/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-D 0. 1-lmg/L，蔗糖 30g/L，WiytagelR 3g/L， 或B =MS培养基附加6-苄氨基腺嘌呤6-BAl-ang/L，2,4 二氯苯氧乙酸2，4-Dl_aiig/L，六水氯化镁MgCl2 ·6Η20 800mg/L，蔗糖30g/L，WiytagelR 3g/L。将胚性愈伤转到其中任何一种生苗培养基之后4-6天，愈伤开始转绿，8-12天开始分化出芽，15-20天即可形成小幼苗。
(4)用生根诱导培养基生根诱导所生幼苗在生根诱导培养基上诱导生根，培养 (25-30)天，生根率达60%以上。培养条件为2448°C，每天光照14-16个小时(采用人工光源照射)，光强为2000LX。生根诱导培养基为以下配方选其一 A :1/2MS培养基附加2，4 二氯苯氧乙酸2，4-D0. 5-ang/L，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L，或B :MS培养基附加激动素 KTl-3mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2,4-DO. 5-ang/L，蔗糖 30g/L, PhytagelR3g/L。将长到 5-10 厘米的幼苗转到任意一种生根培养基上，大概5天左右幼苗就会分化出大量白色或黄色的根，且根系发达。
(5)驯化移栽在温室内，将生长健壮的、株高在5-6厘米的组培苗移栽到由沙土组成的驯化苗圃中驯化。每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15-20d后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。温室条件为15°C-25°C，照明使用卤光，光照14-16个小时(采用人工光源照射)个小时，光照强度为2000LX。获得了大量健壮的芒荻杂种9号幼苗。
本发明建立基于胚性愈伤的芒荻杂种9号组培快繁体系，增值率比较高(3-4倍)， 增殖稳定，根系健壮，移栽成活率较高，是适于商业扩繁芒荻杂种9号的成熟技术。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
1、本发明与现有技术相比，消毒方法简单，且效率高，初代污染率几乎为零。
2、本发明得到的愈伤繁殖率高，每继代一次扩大3-4倍。
3、本发明一次得到了组培快繁技术体系和转基因下游技术体系，为后续转基因工作打下基础。
图1为一种芒荻杂种9号愈伤示意图。
此图为芒荻杂种9号诱导的愈伤图，从图中可以看出，愈伤表面有白色或者淡黄色愈伤，基部愈伤稍有水渍状。
图2为一种芒荻杂种9号愈伤分化示意图。
此图为芒荻杂种9号胚性愈伤转在分化培养基上20天后长出的幼苗。
图3为一种芒荻杂种9号驯化移栽示意图。
此图为芒荻杂种9号幼苗的驯化移栽到温室中生长两个月后植株的图片。
具体实施方式
实施例1
一种芒属植物芒荻杂种9号体胚组培快速繁殖方法，其步骤是
1、幼穗选取选取芒荻杂种9号处于颖花原基形成期的幼穗，幼穗内种子尚未形成，中轴也比较软，还没形成基本的分支。
2、初代诱导(诱导初代培养基)将其剪成2或3厘米小段，先用75% (体积比) 酒精消毒25-3 ，然后用0.1% (质量体积比)氯化汞浸泡5分钟，再用无菌水冲洗三次， 将其接种在幼穗的初代诱导培养基上。经过30天的初代诱导，获得胚性愈伤。培养条件为 25°C，暗培养。诱导初代培养基为A:MS培养基附加激动素KTl-aiig/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-D3-5mg/L，蔗糖30g/L，WiytagelR 3g/L。生长10天左右在幼穗基部开始出愈，开始愈伤为透明状白色，随着培养时间的增长在愈伤的表面逐渐长出白色或淡黄色愈伤。
3、生苗继代培养(生苗培养基)所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗， 观天继代一次，增殖系数为3-4。培养条件为25°C，每天光照16个小时(采用人工光源照射)，光强为2000LX。生苗培养基配方为:k -MS培养基附加激动素KTl-ang/L，2，4 二氯苯氧乙酸2，4-D 0. 1-lmg/L，蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L。将长势良好的胚性愈伤转到生苗培养基之后5天左右，愈伤开始转绿，10天左右开始分化出芽，18天左右即可形成5厘米左右小幼苗，30天左右长至15厘米左右。
4、生根诱导(生根诱导培养基)所生幼苗在生根诱导培养基上诱导生根，培养30 天，生根率达40%以上。培养条件为25°C，每天光照16个小时(采用人工光源照射)，光强为2000LX。生根诱导培养基为A :1/2MS培养基附加2，4 二氯苯氧乙酸2，4_D0. 5-2mg/L, 蔗糖30g/L，PhytagelR 3g/L，PhytagelR 3g/L。将长到5-10厘米的幼苗转到生根培养基上，大概5天左右幼苗就会分化出大量白色或黄色的根，且根系发达。
5、驯化移栽在温室内，将生长健壮的、株高在5-6厘米的组培苗移栽到由沙土组成的驯化苗圃中驯化。每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15-20d后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。温室条件为15°C -25°C，照明使用卤光，光照14-16个小时，光照强度为2000LX。获得了大量健壮的芒荻杂种9号幼苗。
实施例2
一种芒属植物芒荻杂种9号体胚组培快速繁殖方法，其步骤是
1、幼穗选取选取芒荻杂种9号处于颖花原基形成期的幼穗，幼穗内种子尚未形成，中轴也比较软，还没形成基本的分支。
2、初代诱导(诱导初代培养基)将其剪成2或3厘米小段，先用75% (体积比) 酒精消毒25-3 ，然后用0.1% (质量体积比)氯化汞浸泡5分钟，再用无菌水冲洗三次， 将其接种在幼穗的初代诱导培养基上。经过30天的初代诱导，获得胚性愈伤。培养条件为 25°C，暗培养。诱导初代培养基为B:MS培养基附加激动素KT3-^ig/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-Dl-;3mg/L，六水氯化镁 MgCl2 · 6H20 800mg/L，蔗糖 30g/L, PhytagelR3g/L。生长 10 天左右在幼穗基部开始出愈，开始愈伤为透明状白色，随着培养时间的增长在愈伤的表面逐渐长出白色或淡黄色愈伤。
3、生苗继代培养(生苗培养基)所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗，28 天继代一次，增殖系数为3-4。培养条件为25°C，每天光照16个小时(采用人工光源照射)， 光强为2000LX。生苗培养基配方为B =MS培养基附加6-苄氨基腺嘌呤6-BAl_aiig/L，2,4 二氯苯氧乙酸2，4-Dl-ang/L，六水氯化镁MgCl2 ·6Η20 800mg/L，蔗糖30g/L，WiytagelR 3g/ L。将长势良好的胚性愈伤转到生苗培养基之后5天左右，愈伤开始转绿，10天左右开始分化出芽，18天左右即可形成5厘米左右小幼苗，30天左右长至15厘米左右。
4、生根诱导(生根诱导培养基)所生幼苗在生根诱导培养基上诱导生根，培养30 天，生根率达40%以上。培养条件为25°C，每天光照16个小时(采用人工光源照射)，光强为2000LX。生根诱导培养基为B =MS培养基附加激动素KTl-;3mg/L，2，4 二氯苯氧乙酸2， 4-DO. 5-ang/L，蔗糖30g/L，PhytagelR3g/L0将长到5_10厘米的幼苗转到生根培养基上， 大概5天左右幼苗就会分化出大量白色或黄色的根，且根系发达。
5、驯化移栽在温室内，将生长健壮的、株高在5-6厘米的组培苗移栽到由沙土组成的驯化苗圃中驯化。每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，大约15-20d后，视幼苗长势，即可移栽到苗圃中。温室条件为15°C -25°C，照明使用卤光，光照14-16个小时，光照强度为2000LX。获得了大量健壮的芒荻杂种9号幼苗。
权利要求
1. 一种芒属植物芒荻杂种9号体胚组培快速繁殖方法，其步骤是A、幼穗选取选取芒荻杂种9号处于颖花原基形成期的幼穗；B、用初代诱导培养基诱导将其剪成2-3厘米小段，先用75%体积比酒精消毒25-3 ， 然后用0. 1%质量体积比的氯化汞浸泡3-5min，再用无菌水冲洗2_4次，将其接种在幼穗的初代诱导培养基上，经过28-30天的初代诱导，获得胚性愈伤，培养条件为24- °C， 暗培养，初代诱导培养基为A :MS培养基附加激动素KTl-aiig/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-D3-5mg/L,蔗糖 30g/L，PhytagelR 3g/L，或 B =MS 培养基附加激动素 KT3_^ig/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-Dl-;3mg/L，六水氯化镁 MgCl2 ·6Η20800π^/1，蔗糖 30g/L，WiytagelR 3g/L ；C、用生苗培养基继代培养所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗，25-30天继代一次，增殖系数为3-4，培养条件为24- °C，每天光照14-16个小时，光强为2000LX， 所述的生苗培养基配方为A =MS培养基附加激动素KTl-aiig/L，2，4 二氯苯氧乙酸2，4-D 0. 1-lmg/L，蔗糖 30g/L，WiytagelR 3g/L，或 B :MS 培养基附加 6-苄氨基腺嘌呤 6-BAl-ang/ L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-Dl-2mg/L,六水氯化镁 MgCl2 · 6H20800mg/L,蔗糖 30g/L, PhytagelR 3g/L，将胚性愈伤转到其中一种生苗培养基之后4_6天，愈伤开始转绿，8-12天开始分化出芽，15-20天形成小幼苗；D、用生根诱导培养基生根诱导所生幼苗在生根诱导培养基上诱导生根，培养25-30 天，培养条件为M_28°C，每天光照14-16个小时，光强为2000LX，生根诱导培养基为A 1/2 MS 培养基附加 2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-DO. 5-aiig/L，蔗糖 30g/L，WiytagelR 3g/L，或 B :MS 培养基附加激动素 KTUmg/L，2，4 二氯苯氧乙酸 2，4-DO. 5-2mg/L,蔗糖 30g/L，PhytagelR3g/ L，将长到5-10厘米的幼苗转到任意一种生根培养基上，5天幼苗就会分化出白色或黄色的根；E、驯化移栽在温室内，将生长健壮的、株高在5-6厘米的组培苗移栽到由沙土组成的驯化苗圃中驯化，每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，15-20d后，视幼苗长势，移栽到苗圃中，温室条件为15°C _25°C，照明使用卤光，光照14-16个小时，光照强度为2000LX，获得了芒荻杂种9号的幼苗。
全文摘要
本发明公开了一种芒属植物芒荻杂种9号体胚组培快速繁殖方法，其步骤A、幼穗选取选取芒荻杂种9号处于颖花原基形成期的幼穗；B、用初代诱导培养基诱导剪成小段，用酒精消毒，然后用氯化汞浸泡，无菌水冲洗，将其接种在幼穗的初代诱导培养基上，初代诱导，获得胚性愈伤；C、用生苗培养基继代培养所获得的胚性愈伤在继代培养基上继代生苗；D、用生根诱导培养基生根诱导所生幼苗在诱导培养基上诱导生根；E、驯化移栽在温室内，每天定期给幼苗喷施驯化培养液和清水，移栽到苗圃中，光照，获得了芒荻杂种9号的幼苗。方法易行，操作简便，且分化出愈率和成苗率很高，成活率高，适用于芒荻杂种9号种苗产业化生产的快速扩繁。
文档编号A01H4/00GK102524068SQ20111045188
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月29日 优先权日2011年12月29日
发明者刁英, 占红良, 周发松, 胡中立, 胡晖, 赵玲玲 申请人:湖北光芒能源植物有限公司