专利名称：来自Solanum x edinense的功能R基因的克隆和开发的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从S.x edinense分离的抗性基因。此外，本发明涉及所述抗性基因(例如用于克隆功能同源物)的应用，以及所述抗性基因在提高或赋予植物中对卵菌感染的至少部分抗性的方法中的应用。更具体地，本发明提供了一种抗性基因，该抗性基因能够通过基因工程技术或通过标记物辅助的育种技术增强或赋予对疫霉属(Phytophthorasp.)(例如致病疫霉(Phytophthora infestans))的至少部分抗性。
背景技术：
由卵菌致病疫霉引起的晚疫病(late blight)是在全球马铃薯生产中最严重的疾病之一，也是二十世纪中期白马铃薯(Irish potato)饥荒的原因，曾导致100万人死亡。业内已经耗费大量工作来控制病原体，对致病疫霉的化学控制仍然是主要的作物管理策略。但是由于环境安全正在变得更加重要，而且所述病原体有时能够进化出对杀真菌剂处理的抗性。因此，将抗性导入现代马铃薯变种中是控制该疾病最持久的策略。上个世纪，曾广泛使用矮爺(Solanum demissum)(六倍体的墨西哥种)在马铃薯中培育晚疫病抗性。最初，描述了源自矮茄的一系列11个R基因。其中，已将Rl、R2、R3a/b、R6和R7定位于马铃薯(Solanum tuberosum)的基因图谱中。但是，这些R基因赋予致病变-特异性(pathovar-specific)抗性,但所述病原体会迅速战胜渗入马铃薯变种中的那些基因(主要是町、1 2、1 3、1 4和1 10)。因此，需要新的抗性来源来解决这些问题。目前，已经报道有几种其它的野生茄属(Solanum)品种为抗性的潜在来源，其中已对许多品种进行了基因表征(表8)。近来，鉴别晚疫病抗性的工作已经聚焦于源自不同野生茄属品种且赋予广谱抗性的主要的R基因上。除了 S. demissum以外，已经报道了作为晚疫病抗性新来源的其它野生爺属品种，诸如 无莖薯(S. acaule)、S. chacoense、S. berthaulti1、S. brevidens、S. bulbocastanum、S. microdontum、S. sparsipilum、S. spegazzini1、S. stoloniferum、S. sucrense、S. toralapanum、S. vernei 和 S. verrucosum(综述(Jansky, 2000))。S. xedinense P. Berthault (—种来自墨西哥的五倍体(2n = 5x = 60)马铃薯品种)是墨西哥矮煎和南美洲S. tuberosum spp. andigena之间的天然杂种。已在1908年由Salaman鉴定出五倍体S. x edinense作为对致病疫霉抗性的有趣来源，且在1914年被 Brioli 列入育种计划中(Pavek 等 2001 ;Toxopeus 1964)。用 Edinburgh BotanicGarden(Glendinning 1983，其中首次描述了五倍体S. x edinense的杂种特性)命名五倍体S. X edinense。已在育种计划中使用了五倍体S. x edinense，且已显示出对致病疫霉良好的大田抗性(Van Soest等1984)。已从一种S. x edinense基因型(ednl51_3)中克隆出两种功能 R 基因Rpi_ednl.1 和 Rp1-ednl. 2 (也被称为 R2-样)(Champouret 2010)。已通过R2家族的等位基因发掘鉴定了该两种基因。该两种基因均位于染色体4上的R2簇中。该两种R基因均识别AVR2 (Champouret 2010 ；Lokossou等2009)，且它们的抗性并不对所有的致病疫霉分离群(包括IP0-C)有效(Lokossou等.2009)。
迄今为止，已经不仅从该品种，还从其它茄属品种中克隆了多个晚疫病R-基因，如位于染色体8上的等位基因RB和Rp1-blbl,及位于S. bulbocastanum染色体6上的Rp1-blb2 (表6)。近来，也已经分离了 Rpi_blb3抗性基因(W02008/091153)。此外，还表征了S. chacoense 的抗性基因(EP 09170769.5)。尽管用 RB 及 Rpi_blbl、Rpi_blb2 和 Rpi_blb3得到的初步结果是有希望的，但仍需要更多的R-基因，尤其因为在S. bulbocastanum基因型中这些基因的等位基因发掘揭示在单个基因型中以相对较高的频率发生Rp1-blbl和Rpi_blb3的天然堆叠(stacking) (Lokossou 2010)。在单个基因型中堆叠多个R基因呈现为实现对抗潜在病原体高水平且持久保护的可行策略。R基因的聚合(pyramiding)仍具有争议，不知道它是否为持久的方法(McDowell等2003 ；Pink等1999 ；Pink2002)。Rp1-blbl (Rauscher 等 2006)( 一种具有强效果的 R 基因)和 Rp1-mcdl (Tan 等 2008)( 一种具有弱效果的R基因)的聚合揭示在抗性水平上的累加效果(Tan等2010)。观察R基因的天然聚合强化了植物可从组合单个R基因(甚至包括具有较弱效果的一些R基因)中收益的观念(Pink 2002)。
发明内容
现在，本发明涉及一种分离或重组的核酸序列，所述分离或重组的核酸序列包括编码图4的氨基酸序列Rpi_edn2的核酸序列或该核酸序列的功能片段或功能同源物。在另一实施方式中，本发明涉及一种包括根据本发明所述的核酸序列的载体。本发明进一步包括一种包括·根据本发明所述的核酸序列或根据本发明所述的载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞优选为农杆菌细胞或植物细胞。在另一实施方式中，本发明包括一种包括根据本发明所述的核酸或载体的植物细胞。所述植物细胞优选地是来自茄科植物的细胞，更优选地是来自马铃薯(Solanumtuberosum)的细胞，更优选的是来自四倍体马铃薯(tetraploid Solanum tuberosum)的细胞。此外，本发明还涉及一种包括所述细胞的转基因植物及源自所述植物的一部分，更优选地其中所述部分是块茎。本发明的又一部分是一种由根据本发明所述的分离或重组的核酸或它的功能片段或功能同源物编码的蛋白，优选地其中所述蛋白具有如图4中描述的Rp1-edn2的氨基酸序列。本发明进一步公开了一种(特异性)结合所述蛋白的抗体。在又一实施方式中，本发明涉及一种用于在植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法，所述方法包括为植物或它的一部分提供根据本发明所述的核酸或载体或宿主细胞或蛋白。在所述方法中，所述植物优选地是来自茄科属的植物，更优选地是马铃薯。更优选地是在所述方法中，所述卵菌包括疫霉属(Phytophthora),优选地包括致病疫霉(Phytophthora infestans )。在再一实施方式中，本发明涉及一种能够特异性结合根据本发明所述的核酸或它的互补核酸的结合分子，优选地，其中所述结合分子是引物或探针。在又一实施方式中，本发明包括一种用于选择植物或植物材料或它们的后代对卵菌感染的易感性或抗性的方法，所述方法包括以下步骤测试所述植物或植物材料或它们的后代的至少一部分存在或没有根据本发明所述的核酸；优选地，其中使用特异性结合所述核酸的引物或探针进行所述测试；或，其中所述测试包含检测表5和表7的一种或多种标记物的存在；或，其中所述标记物包括如图4中描述的Rp1-edn2基因序列的一部分。进一步地，本发明涉及一种用于培育具有抗性的四倍体植物的方法，包括a.使用已经包含根据本发明所述的核酸序列的多倍体植物的配子与四倍体植物的配子杂交；以及b.选择存在所述核酸序列的所述杂交的后代。在另一实施方式中，本发明包括一种用于在植物育种中进行标记物辅助的选择以获得抗卵菌抗性的标记物，其中所述标记物挑选自在表5和表7中示出的标记物；或其中所述标记物包括如图4中描述的Rp1-edn2基因序列的一部分。
图1 :用于Rpi_edn2的定位和克隆的基因型的谱系。图2 :ednl50-4x cv.并行种群的基因型图谱。示出了多个Fl个体的子集。图中示出对四种致病疫霉分离群(90128、IP0-C、PCI99189和UK7824)的应答，对分别连接至对90128和PIC99189的抗性的效应物AVR2和AVR4的应答，及连接至单个R基因座的一个或两个标记物的基因型评分。R :抗性(绿色)，S :易感的(红色)，Q :不清楚的基因型，ab 存在片段，aa:不存在片段，nd:不确定。灰色的水平线使R基因座分开。Fl个体数16包含来自cv.并行体的三个Rp1-edn基因和潜在的R10。图3 :在ednl50_4x cv.并行种群中隔离的、分别定位在染色体9和11上的Rp1-edn2和Rp1-edn3基因的基因位置。基因图谱与SH x RH UHD参照基因图谱进行对比(van Os 等 2006，Genetics 173:1075-1089)。垂直的黑色条示出已知的R基因簇。图4 Rp1-edn2的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。图5 Rp1-edn2和高同源性蛋白的氨基酸序列比对。图6 :本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶中疫霉菌易感性的瞬时互补。在使用pDEST32:edn2或空的双元载体(binary vector)进行农杆菌渗入法(agro-1nfiltration) 2天后,通过接种致病疫霉分离群IP0_C (左半侧叶片)和H30P04(右半侧叶片)的游动孢子悬浮液攻击叶片。对上述两种分离群均具有抗性与在Fl种群中的染色体9基因共隔离。已经被空的双元载体进行农杆菌渗入的对照植物在接种后6天出现典型的病害表型。在使用Rpi_edn2进行农杆菌渗入的植物中可看到为HR或XR(极值抗性(extreme Resistance))的抗性。图7 :通过 Rpi_edn2 的 PITG_15039 的识别。效应物的候选者在OD6tltl = O. 5(斑点 2 = Avr3a，4 = PITG_09616，6 =PITG_10540，和8 = PITG_15039)时通过农杆菌渗入本氏烟草的右半侧叶片中。在左半侧叶片中，相同的效应物与R3a(斑点I = Avr3a)或与Rpi_edn2 (斑点3 = PITG_09616, 5 =PITG_10540，和7 = PITG_15039)共渗入。在农杆菌渗入后6天获取图片。图8 :包含Rp1-edn2 基因的BAC克隆的核苷酸序列。斜体是增变基因转座因子(pos. 195 3310)。突出显示的是Rpi_edn2基因(pos. 5618 8829)。编码序列位于位置6140 8731之间。粗体显示的是部分Rpi_edn2同源基因(pos. 11924 13956)。下划线显示的是完整的Rp1-edn2同源基因(pos. 14406 17847)。潜在的开放阅读框位于位置15157 17745之间。图9 Rp1-edn2染色体组区域的注释。使用FGENESH算法预测基因。黄色箭头示出增变基因转座因子(基因a)的存在。红色箭头示出Rp1-edn2和Rp1-edn2-样序列(基因b和c)的存在。第一红色箭头中的方框示出编码Rpi_edn2蛋白的单个外显子的位置。由各数字示出在如图8中所描述的BAC插入片段中相对于插入片段的起始位点的位置。
具体实施例方式本文所用术语“植物或该植物的一部分”是指任何完整或部分的植物，单细胞和细胞组织(如植物中未受损的植物细胞)，可以再生出马铃薯植物的细胞团(cell clump)和组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自花粉、胚珠、叶片、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽、块茎(包括用于食用的马铃薯块茎，或用于栽培或克隆繁殖的“种块”)和种子的单个细胞和组织，以及花粉、胚珠、叶片、胚芽、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽、幼枝、根茎、种子、原生质体、愈伤组织等。本文所用术语“种群(population) ”是指具有共同遗传起源的植物的遗传多样性的集合。本文所用术语“变种”如在国际植物新品种保护联盟(UPOV)条约中所定义的，表示在已知最低类别的单个植物分类单元内的任意植物群，所述群可以(a)由给定基因型或基因型的组合产生的特征性的表达来确定；(b)通过至少一种所述特征性的表达而与其它任意植物群区分开；和(C)视作关于其进行无变化繁殖的适宜性的单位。本文所用术语“栽培品种(cultivar) ” (表示栽培的变种)定义为通常不会在自然界发现、但已被人类栽培出的变种，即具有与“野生”状态不同的生物学状态，其中所述“野生”状态表示植物或 加物(accession)最初未经栽培或天然的状态。术语“栽培品种”具体涉及具有为四倍体的多倍性水平的马铃薯植物。术语“栽培品种”进一步包括但不限于半天然品种、半野生品种、杂草品种(weedy)、传统栽培品种、地方品种、育种材料、研究材料、育种系、复合种群、杂种、原始原种/基本种群、近交系(杂种栽培品种的亲本)、隔离种群、突变体/遗传原种和高级/改良的栽培品种。本文所用“杂交”是指雄性植物(或配子)对雌性植物(或配子)进行授精。术语“配子”表示单倍体或二倍体的生殖细胞(卵子或精子)，该生殖细胞是在植物中通过减数分裂、或通过第一次或第二次重组、或从配子体经双减数分裂生成的，并该生殖细胞参与有性生殖；在有性生殖的过程中，两个异性配子融合以形成二倍体或多倍体的合子。该术语通常包括花粉(包括精子细胞)和胚珠(包括卵子)。因此“杂交”通常表示一个个体的胚珠与来自另一个个体的花粉进行授精，而“自交”表示一个个体的胚珠与遗传上相同的该个体的花粉进行授精。本文所用术语“回交”是指如下过程两个亲本系之间杂交所产生的植物与其亲本系之一杂交；其中在回交中使用的亲本系称作回归亲本(recurrent parent)。重复回交会产生与回归亲本越来越相似的基因组，直至这可在所述亲本的纯合性或杂合性水平下实现。
本文所用“自交”定义为表示自体受精的过程，其中某一个体被它自身的花粉授粉或授精。本文所用术语“标记物”是指，在推断基因组序列特性差异的方法中使用的任意指示物。所述指示物的实例是限制性片段长度多态性(RFLP)标记物、扩增片段长度多态性(AFLP)标记物、单核苷酸多态性(SNP)、插入突变、微卫星标记物(SSR)、序列特征性扩增区域(SCAR)、酶切扩增多态性序列(CAPS)标记物或同工酶标记物，或本文所述标记物的组合，所述标记物限定特定的遗传定位和染色体定位。本文所用“基因座”定义为给定基因在植物染色体上占据的遗传位置或物理位置。本文所用术语“等位基因”是指基因的一种或多种可选择形式中的任意一种，所有所述等位基因皆涉及植物中特定表型特性或特征的存在或缺失。在二倍体细胞或生物体中，给定基因的两个等位基因占据一对同源染色体上的对应基因座。在有些情况下，称为“单倍型”(haplotype)(即染色体段的等位基因)比“等位基因”更准确，但在这些情况下，术语“等位基因”应当理解为包括术语“单倍型”。本文所用且 仅限于二倍体的术语“杂合的”是指当不同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座处时存在的遗传条件。本文所用的且仅限于二倍体的术语“纯合的”定义为当相同的等位基因位于同源染色体上的对应基因座处时存在的遗传条件。本文所用且限于四倍体的术语“无显性组合(nulliplex) ”、“单纯形(simplex) ”、“二显性组合(duplex) ”、“三显性组合(triplex)”和“四显性组合(quadruplex) ”定义为当在对应同源染色体的对应基因座处的特定等位基因分别出现O、1、2、3或4次时的遗传条件。在四倍体水平，当等位基因存在于四显性组合条件下时，才观察到与隐性等位基因相关的表型效应；而当等位基因存在于单纯形或更高条件下时，已经观察到与显性等位基因相关的表型效应。本文所用术语“单倍体”、“二倍体”、“四倍体”和“五倍体”定义为在每个细胞(不包括生殖细胞)中分别具有一对、两对、四对和五对各染色体。本文所用术语“单倍型”是指在相同染色体上一起传递的多个基因座上的等位基因的组合。根据给定组的基因座之间已发生重组现象的次数，单倍型包括指少至两个基因座的单倍型和指整个染色体的单倍型。当提及评定存在与Rpi_edn2基因表达相关的真菌抗性时，本文所用术语“推断(infer或inferring) ”是指,通过在植物或其部分的核酸样品中单独或组合地分析所述基因核苷酸的存在，得出关于所述基因存在于该植物或其部分中的结论。如本文所公开的，通过检验核酸分子表达水平的定性差异或定量差异可以直接鉴别核苷酸的存在，或者，通过检验Rp1-edn2蛋白的表达水平可间接鉴别核苷酸的存在。本文所用术语“引物”是指如下的寡核苷酸当置于能诱导与核酸链互补的引物延伸产物的合成的条件下，即，存在核苷酸和聚合试剂(诸如DNA聚合酶)且在适宜温度和pH的条件下，所述寡核苷酸能够与扩增靶点退火结合，以允许DNA聚合酶附着在上面，从而作为DNA合成的起始位点。(扩增)引物优选为单链，以获得最大扩增效率。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。另外，引物必须足够长，从而在存在聚合试剂的条件下启动延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度和引物来源。如本文所使用的“双向引物对”或“引物对”表示如在DNA扩增(诸如在PCR扩增中)的技术领域中通常使用的一个正向引物和一个反向引物。
本文所用术语“探针”是指单链寡核苷酸序列，所述单链寡核苷酸序列可识别靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中的互补序列，并与所述互补序列形成氢键合的双链。
术语“严谨(stringency)” 或“严谨杂交条件(stringent hybridization condition) ”表示可影响杂交物稳定性的杂交条件，例如，温度、盐浓度、pH、甲酰胺浓度等。 通过实验优化这些条件，以使引物或探针与其靶核酸序列的特异性结合最大化，并使非特异性结合最小化。所用的该术语包括如下的条件在该条件下，探针或引物会与其靶序列杂交以达到比其它序列更大的可检测程度，例如超过背景至少2倍。严谨条件是序列依赖性的，且在不同情况下是不同的。较长序列在较高温度下进行特异性杂交。通常所选择的严谨条件为在限定的离子强度和PH下，比特定序列的热解链温度(Tm)低约5°C。Tm是如下的温度(在限定的离子强度和PH下)在该温度处，50%的互补靶序列与完全匹配的探针或引物杂交。
典型的严谨条件如下在该严谨条件中，在pH7. O 8. 3时，盐浓度小于约1.0M Na+离子、典型地约O. 01 1.0M Na+离子浓度(或其它盐)，并且对于短的探针或引物(例如，10 50个核苷酸)该温度至少约为30°C，而对于长的探针或引物(例如，多于50个核苷酸)该温度则至少约为60°C。可借助于加入去稳定剂(诸如甲酰胺)来实现严谨条件。 示例性的低严谨条件或“降低的严谨条件”包括在37°C，在30%甲酰胺、IM NaClU % SDS 的缓冲溶液中杂交；并在40°C，在2x SSC中洗涤。示例性的高严谨条件包括在37°C，在 50%甲酰胺、IM NaCl、l% SDS中杂交；并在60°C，在O.1x SSC中洗涤。杂交过程在本领域中是众所周知的，且描述在例如 Ausubel, F. M. , Brent, R. , Kingston, R. E. , Moore, D. D., Seidman, J. G. , Smith, J. A. , Struhl, K.主编(1998)的 Current protocols in molecular biology (V. B. Chanda,系列版 New York John Wiley & Sons (纽约约翰威立国际出版公司))中。
本发明描述了 Rpi_edn2基因的克隆。Rpi_edn2被定位于S. X edinense的染色体 9上的R基因簇。该基因包含与其它抗性基因共同的三个结构域CC、NBS和LRR结构域。
迄今为止，基于保守的蛋白结构域已经鉴定出R-基因的五个主要类别(综述参见 Martin GB, Bogdanove AJ, Sessa G, Annu Rev Plant Biol 2003,54:23-61)。最丰富的类别是细胞质核苷酸结合位点-富含亮氨酸的重复序列(NBS-LRR)蛋白(Rommens CM， Kishore GM,Curr Opin Biotechnol 2000，11 :120-125)。其它类别的包括锚定至跨膜(TM) 结构域(受体样蛋白[RLP])具有细胞质外的LRR(eLRR)的蛋白，具有细胞外LRR的细胞质丝氨酸-苏氨酸(Ser/Thr)受体样激酶(RLK)(诸如在W02004/007712中公布的)，没有LRR的细胞质Ser/Thr激酶,及具有融合至卷曲螺旋(CC)结构域的膜锚定物(membrane anchor)的蛋白。共有的NBS-LRR编码蛋白目前包括来自不同植物种类的超过二十种已经经过功能验证的 R-基 因(Van Der Biezen EA, Freddie CT, Kahn K, Parker JE, Jones JD，Plant J 2002,29 =439-451) 0已经将研究集中于这个家族，因为迄今为止它仅有的已知功能在于抗病性(Meyers BC, Kaushik S, Nandety RS, Curr Opin Plant Biol 2005,8 129-134)。基因产物由保守的中心NBS和10 40个短的LRR基序的可变长度的C-末端 LRR 结构域组成(Cannon SB, Zhu H, Baumgarten AM, Spangler R, May G, Cook DR, YoungND, J Mol Evol 2002,54:548-562)。NBS结构域对于ATP结合和水解是很重要的，且相信NBS结构域参与了由病原体存在引发的信号转导(van Der Biezen EA, Jones, Curr Biol1998，8 :R226_R227 ；Tameling WI,Elzinga SD, Darmin PS, Vossen JH, Takken FL,HaringMA,Cornelissen BJ,Plant Cell 2002，14 :2929-2939)。LRR结构域可能参与蛋白-蛋白的相互作用，识别病原体诱导子分子(Young ND, Curr Opin Plant Biol 2000,3:285-290)。LRR中的高突变率有助于遗传变异性，对不同病原体的特异识别是必需的(Michelmore Rff,Meyers BC, Genome Res 1998,8:1113-1)。基于 N-末端基序，在 NBS-LRR R 蛋白中存在两个子家族。TIR NBS子家族R蛋白在N-末端氨基酸基序和Drosophila Toll中的受体结构域和在动物中的基底哺乳动物白介素(IL)I免疫因子之间显示出同源性(Parker JE,Coleman MJ,Szabo V,Frost LN,Schmidt R,van Der Biezen EA,Moores T,Dean C,DanielsMJ, Jones JD, Plant Cell 1997,9:879-894)。非-TIR NBS 子家族 R 蛋白可包含 N-末端卷曲螺旋(CC)基序，该N-末端卷曲螺旋(CC)基序的一个子集为亮氨酸拉链序列(LZ)编码。TIR子家族NBS-LRR蛋白显示受限于双子叶植物。卷曲螺旋(CC)结构域位于Rpi_edn2蛋白在氨基酸I和153之间的N-末端部分(在图4中描述了氨基酸序列)。在第一 153个残基中，可在Rp1-edn2中识别出由疏水残基组成的三对推断的七肽基序(heptad motif)。可在残基153和444 (Ploop,激酶_2, GLPL)之间的氨基酸伸展中识别出NB-ARC (核苷酸-结合位点，凋亡，R基因产物，CED-4)结构域(Van der Biezen和Jones 1998)。Rpi_edn2的C末端的一半包括一系列不规则大小的15个LRR基序,可根据共有序列Lx·xLxxLxxLxLxxC/N/Sx (X) LxxLPxx (其中x是任意氨基酸，且L选自亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸(L、I或V)的组)比对该不规则大小的15个LRR基序(McHaIe 等 2006)。在上述蛋白水平下,Rpi_edn2与Rp1-mcql.1享有80%的氨基酸一致性，Rpi_edn2与Rp1-mcql. 2享有77%的氨基酸一致性。而发现Rpi_edn2与Rpi_vntl (73% )和Tm_22(抗番茄花叶病毒的番茄抗性基因)具有较低的半分比同源性，分别享有73%和72%的一致性。在第一实施方式中，本发明提供了分离或组合的核酸序列，所述分离或组合的核酸序列包括编码如4中所示的氨基酸序列Rpi_edn2的核酸序列或其功能片段或功能同源物(即如图4中示出的氨基酸序列的功能片段或功能同源物)。术语“核酸”指单链或双链的DNA或RNA分子。还包括本文所描述的核苷酸序列的互补序列。术语“其功能片段”典型地用于指Rpi_edn2蛋白的片段或编码该片段的核酸序列，所述“其功能片段”能够在茄科(Solanaceae)植物中提供抗卵菌感染，更具体地抗致病疫霉，更具体地抗分离群IPO-C的至少部分抗性或提高抗卵菌感染，更具体地抗致病疫霉，更具体地抗分离群IPO-C的抗性。所述片段例如为Rp1-edn2蛋白的截短形式。Rpi_edn2蛋白的截短形式/片段是如下的片段小于863个氨基酸，且优选(部分)包括Rpi_edn2蛋白的NB-ARC和LRR结构域和/或N-末端CC结构域。术语“功能同源物”典型地用于指与本文所述的Rp1-edn2蛋白或核酸具有高度同源性或具有高度一致性的蛋白序列或编码所述蛋白的核酸序列，所述(编码的)蛋白能够在茄科植物中提供抗卵菌感染，更具体地抗致病疫霉，更具体地抗分离群IPO-C的至少部分抗性或提高抗卵菌感染，更具体地抗致病疫霉，更具体地抗分离群IPO-C抗性。所述功能同源物包括至少部分保持Rpi_edn2蛋白的作用的人工改变或氨基酸残基替换。例如，某些氨基酸残基可以常规替换为其他具有相似性质的残基，例如将一个碱性残基替换为另一个碱性残基，将一个酸性残基替换为另一个酸性残基，将一个疏水残基替换为另一个疏水残基等等。疏水氨基酸的实例是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸是具有芳族侧链的氨基酸的实例，半胱氨酸以及甲硫氨酸是具有含硫侧链的氨基酸的实例。丝氨酸和苏氨酸含有脂族羟基，且被认为是亲水的。天冬氨酸和谷氨酸是具有酸性侧链的氨基酸的实例。简言之，术语“其功能同源物”包括Rpi_edn2蛋白的变体，其中已经插入、取代或缺失了氨基酸，但该Rpi_edn2蛋白的变体仍至少部分保持Rpi_edn2蛋白的作用，即在茄科植物中至少部分地提供抗卵菌感染，更具体地抗致病疫霉，更具体地抗分离群IPO-C 的抗性或提高抗卵菌感染，更具体地抗致病疫霉，更具体地抗分离群IPO-C抗性。优选的变体是仅含有如上所述的常规氨基酸取代的变体。在术语“其功能同源物”中还包括同源序列。优选地，所述同源物在氨基酸水平上具有高于80%的一致性。更优选地，所述氨基酸具有至少85%或90%的一致性。甚至更优选的是具有91%、92%、93%、94%或95%—致性的氨基酸。最优选的是与Rpi_edn2的氨基酸序列具有有96%、97%、98%或99% —致性的氨基酸。当将各序列与图5中的那些蛋白比对时，根据本发明的同源蛋白与Rp1-edn2序列具有更高程度的一致性。
功能同源核酸序列是编码如上所述的功能同源蛋白的核酸序列。
例如，使用计算机程序(诸如BLAST、ClustalW或ClustalX)可以确定同源性和/ 或一致性百分比。
许多核酸序列编码与图4所示的Rpi_edn2蛋白100%—致的蛋白。这是因为核苷酸三联体中的核苷酸可以在不会改变对应氨基酸的情况下发生改变(核苷酸三联体中的摆动)。因而，可以在不影响蛋白氨基酸序列的情况下，改变编码该蛋白的核苷酸序列。然而在一个优选的实施方式中，本发明提供了如图4中描述的分离或重组的核酸序列。在一个优选的实施方式中，本发明提供了一种代表Rpi_edn2蛋白编码序列(CDS)的分离、合成或重组的核酸，即图4的核苷酸I 2589(加阴影的)或其功能片段或功能同源物。
例如，通过使用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)瞬时转化试验(农杆菌渗入法)和/或使用离体叶片试验，可以测试本文所描述的Rpi_edn2基因和蛋白的片段及其同源物的功能。
农杆菌渗入形成功能筛选用于测试候选基因，由此使用含有候选Rp1-edn2同源物或编码该候选Rpi_edn2同源物的核苷酸序列的农杆菌株渗入4周龄野生型本氏烟草植物。渗入后一天或几天(最多三天)，在离体叶片试验中，使用对本氏烟草有毒性的致病疫霉菌株(例如IPO-C或90128)攻击经渗入的叶片。该系统同样适用于测试Rpi_edn2的候选同源片段。
如通过农杆菌渗入实现的瞬时基因表达是用于有用蛋白的高水平表达的一种快速灵 活且可再现的方法。在植物中，根癌农杆菌重组菌株可以用于瞬时表达已插入细菌Ti 质粒的T-DNA区域中的基因。将细菌培养物渗入叶片中，在T-DNA转移期间，在植物细胞中异位表达感兴趣的基因。但是，由于异位RNA表达在2 3天后停止，因此使该系统的实用性受到限制。已示出转录后基因沉默(PTGS)是该效率不足的主要原因。基于共表达病毒编码的基因沉默抑制蛋白(番茄丛矮病毒(TBSV)的pl9蛋白)的系统阻止了渗入组织中的PTGS的起始，从而允许高水平的瞬时表达。在pl9的存在下，许多蛋白的表达增加了 50倍或更多，以便可以从少至IOOmg的渗入的叶片材料中实现蛋白纯化。尽管pl9的使用具有优点是明显的，但没有P19的农杆菌渗入也可以用于测试候选片段和功能同源物的功能。可选择地，各候选基因(例如是片段或同源物)构建体用于转化易感的马铃薯栽培品种例如Desiree。在离体叶片试验中使用例如分离群H30P04、IPO-C、CA65、USA618或90128攻击初级转化体。对这些分离群(特别是对IP0-C)具有抗性的转化体携带例如Rp1-edn2的功能片段或同源物。在另一个实施方式中，本发明提供了一种包含本文提供的核酸的载体，上述核酸即能够在茄科植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性。更具体地，本发明提供了一种包含分离、合成或重组的核酸序列的载体，该分离、合成或重组的核酸序列包含编码图4的氨基酸序列Rpi_edn2的核酸序列或其功能片段或功能同源物。本发明还提供了一种包含上述核酸序列的载体。可选择地，此类载体包含编码Rpi_edn2蛋白的两种核苷酸序列。合适的载体的实例是pBeloBACI1、pBINplus、pKGW_MG或任何可商购的克隆载体。如下所述，存在许多可将本发明的核酸转移至植物中的途径。一种合适的转移方法是由农杆菌介导的，其中要转移的核酸是双元载体的一部分，因此优选上述载体是双元载体。另一种合适的方法是包含编码Rpi_edn2的基因的植物与不含该基因的植物杂交，且鉴定已经遗传得到Rpi_edn2基因的那些杂交后代。本发明另外提供了一种包含本文所述核酸或本文所述载体的宿主细胞。优选的宿主细胞的实例是适用于BAC克隆的大肠杆菌(E. coli)细胞(例如DH10B)或农杆菌属(宿主)细胞。在另一个实施方式中，所述宿主细胞包括植物细胞。优选的植物细胞是源自茄科成员的细胞；甚至更优选地，所述植物细胞包括来自马铃薯、番爺(Solanum Iycopersicum)(以前称作Lycopersicon esculentum)、胡椒属植物(pepper)和爺子的细胞。通过技术人员已知的方法(例如再生方法)，可以从所述细胞得到转基因或遗传改造的植物(例如马铃薯或番茄植物)。本发明进一步提供了一种本文所述的遗传改造的植物的叶片、块茎、果实或种子或部分或后代。在另一个实施方式中，本发明提供了一种由本文所述的分离或重组的核酸或其功能片段或功能同源物编码的蛋白。在优选的实施方式中，本发明提供了一种由图4中描述的核酸序列编码的蛋白。在另一个优选实施方式中，本发明提供了一种包括图4的氨基酸序列或其功能片段或功能同源物的蛋白。本文所描述的Rp1-edn2蛋白包括863个氨基酸。Rpi_edn2与来自S. mochiquense的R基因Rp1-mcql. 1(80%)和Rp1-mcql. 2(77%)享有最高的同源性。但是，如在表6中所示，本发明的Rpi_edn2蛋白由于它提供对疫霉属分离群不同谱系的抗性的事实，而与这些高度同源性的蛋白不同。Rpi~edn2 (与 Rp1-vntl、Tm_22 和 Rp1-mcql.1 一样)是 CC-NBS-LRR抗性基因大家族的成员。参考基因T m-22、Rp1-vntl和Rp1-mcql.1可被称为归于所谓的Tm-22家族子群中，Rp1-edn2成为该Tm_22家族子群的成员。但是，基于序列同源性，可认为Rp1-edn2形成该Tm_22家族的新的子类。
如已经描述的，Rpi_edn2的功能片段或其功能同源物是能够在茄科植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的片段或同源物。
上文中已经提供了测试Rp1-edn2的功能片段或功能同源物的功能性的方式。
基于本文所描述的核酸序列，本发明还提供了探针和引物，即与图4中描述的(互补)DNA链互补的寡核苷酸序列。探针例如在Southern或Northern分析中是有用的,且引物例如在PCR分析中是有用的。基于本文所描述的核酸序列的引物对辅助在经典育种和/ 或通过植物(优选地，所述植物是马铃薯、番爺(以前称作Lycopersicon esculentum))、胡椒属植物和茄子的核酸成分的遗传改造进行育种以选择能够表达例如Rpi_edn2的植物的领域中活跃的植物育种者非常有用。
因此，在进一步的实施方式中，本发明提供了一种能够结合至如本文所述的核酸或它的互补核酸的结合分子。在优选的实施方式中，上述结合分子是引物或探针。如上所述，该结合分子对于植物育种者是非常有用的，因此本发明进一步提供了一种用于选择植物或植物材料或它们的后代对卵菌感染的易感性或抗性的方法。优选地，从所述植物分离要被测试的植物的核酸，然后所获得的核酸与一种或多种(优选不同的)结合分子接触。研究人员可例如使用PCR分析以测试植物的植物基因组中存在或不存在Rp1-edn2。所述方法在无标记物的转化方案(诸如在W003/010319中描述的方案)中特别优选。
本文描述的Rpi_edn2蛋白还可用于通过技术人员已知的方式诱导出抗体。由此, 本发明还提供了一种(特异性)结合由本文所描述的分离或重组的核酸(例如图4的核酸序列)编码的蛋白的抗体，或一种(特异性)结合如图4中描述的蛋白或其功能片段或功能同源物的抗体。所述抗体在蛋白分析方法(诸如Western印迹或ELISA)中有用，因此所述抗体可用于选择成功表达Rpi_edn2基因的植物。
基于本文所提供的核酸序列，本发明还提供了在植物中导入或提高抗卵菌感染的抗性的方式。因此，本发明还提供了一种用于在植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法，所述方法包括为植物或其部分提供
分离或重组的核酸序列，所述分离或重组的核酸序列包括编码图4的Rpi_edn2氨基酸序列的核酸序列或其功能片段或功能同源物；或
载体，所述载体包括如本文所描述的核酸序列；或
如本文所描述的宿主细胞。
所述用于在植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法可基于经典育种，与已经包含Rpi_edn2基因的亲本植物分离开。或者所述方法涉及将 DAN转移入植物中，即涉及用于转化植物细胞的方法，所述用于转化植物细胞的方法包括为所述植物细胞提供一个或多种本文所描述的核酸序列或本文所描述的载体或本文所描述的宿主细胞。
存在多种可将重组核酸转移至植物细胞的途径，例如农杆菌介导的转化。但是， 当研究人员希望实施本发明时，还存在其它将DNA有效传递给受体植物细胞的方式。值得相信的是，用于将DNA传递给植物细胞的合适方法实际上包括可以将DNA导入细胞中的任意方法，诸如通过DNA的直接传递(诸如通过PEG-介导的原生质体转化)，通过干燥 / 抑制-介导的 DNA 摄取(Potrykus 等人，Mol. Gen. Genet.，199 :183-188,1985)，通过电穿孔(美国专利号5，384，253),通过与碳化娃纤维一起搅拌(Kaepp ler等人，1990 ;美国专利号5，302，523 ;和美国专利号5，464，765)，及通过DNA包被颗粒的加速(美国专利号5，550, 318 ;美国专利号5，538，877 ;和美国专利号5，538，880)。通过应用所述这些技术，可以稳定转化来自基本任意的植物物种的细胞，且这些细胞可以发育成转基因植物。在使用农杆菌介导的转移的情况下，优选使用实质有毒性的农杆菌，诸如根癌农杆菌(A tumefaciens)(实例是A281菌株或由其衍生菌株)，或在本领域中可得到的其它有毒性的菌株。这些农杆菌菌株携带源自Ti质粒PTiBo542毒性区域的DNA区域，所述Ti质粒PTiBo542协调T-DNA的加工及该T-DNA向植物细胞中的转移。基于农杆菌的植物转化是本领域众所周知的，例如，Komari, T.等人的Plant Transformation Technology Agrobacterium-Mediated Transformation(见 Handbook of Plant Biotechnology,Christou, P.和Klee, H.编,约翰威立国际出版公司，奇切斯特(Chichester), UK 2004,第233-262页)。优选地，使用无标记物的转化方法，诸如在W003/010319中描述的方法。在优选的实施方式中，使用额外的抗性基因转化靶标植物，为已知名为“基因堆叠”的现象。如在实验部分解释且示出的，多种抗性基因的存在可提高植物抗感染的抗性，因为首先，相对于对感染试剂的不同分离群或致病型的抗性，这些基因可互相补偿；其次，引发多于一种的抗性机制(仅靠一种抗性机制自身将不会导致完全抗性)可导致在宿主植物中抗性反应的实质增加，这将足以达到完全抗性。可选择地，可通过杂交将Rp1-edn2基因的核酸，及可选的其它抗性基因(如Rp1-mcql.1、Rp1-mcql.2、Rp1-vntl、Rp1-chcl、Rp1-avll.1、Rp1-avll. 2、Rp1-blblΛRp1-blb2、Rp1-blb3及其它很多抗性基因)导入植物中。所述杂交方案从选择合适的亲本植物开始。所述亲本植物可以是例如原始的Solanum x edinense基因型(诸如增加物GLKS 25492，GLKS 25493和GLKS 25494)，或通过上述基因工程已得到期望核酸的植物。在根据本发明的方法中，可以使用本领域已知用于杂交的所选择的植物的任意合适的方法，包括体内和体外方法。本领域技术人员应理解，在合适的时侯，可以使用体外技术，诸如原生质体融合或胚拯救(embryo rescue)。在根据本发明方法中用于杂交目的的所选择的植物可以具有任意类型的倍性。例如，所选择的植物可以是单倍体、二倍体、四倍体或五倍体。使用四倍体植物杂交多倍体植物的方法在本领域是公知的，且本领域的技术人员可容易地应用。例如，已在育种计划，特别是用于S. X edinense抗致病疫霉良好的大田抗性中使用了很长时间的S. X edinense (van Soest, 1984)。使用四倍体变种(例如并行体)的五倍体S. X edinense的杂交产生四倍体后代。对于马铃薯，优选是具有抗性的四倍体植物，已知四倍体植物具有块茎的较高产量。优选地，使用经典的体内杂交方法使选择的植物彼此杂交，所述经典的体内杂交方法包括一次或多次包括自交的杂交步骤。通过实施上述经典杂交步骤，可以在后代中组合两种亲本的特征。例如，可以使提供高产量的植物与含有大量某种营养物的植物杂交。所述杂交会得到包含两种特征的后代，即不仅包含大量营养物而且还提供高产量的植物。当实施回交时，Fl后代与它的高产亲本P之一杂交，以确保F2后代的特征类似于高产亲本的特征。例如，为了最终提供具有卵菌抗性的高产四倍体后代的目的，使用秋水仙素使选择的具有卵菌抗性的二倍体马铃薯成为四倍体，然后与选择的高产四倍体马铃薯栽培品种杂交。另外，还可以实施自交。选择的植物(亲本或后代)与它们自身杂交，以产生用于育种的自交系变种(inbred variety)。例如,从上述Fl后代选出的样本与它们自身杂交以得到F2后代，从该F2后代中可以选择出具有水平增加的抗性的样本。
在将核酸转移至植物或植物细胞中以后，必须确定哪些植物或植物细胞已经具有所述核酸。当在根据本发明的方法中选择和杂交亲本基因型时，在至少一个选择步骤中使用标记物来辅助选择。本领域已知，可在体内和体外发现处于不同生物学水平的指示某种特性或状况的标记物。例如，可在肽水平或基因水平上发现标记物。在基因水平，可以在 RNA水平或DNA水平上检测标志物。优选地，在本发明中，在DNA水平上检测所述标记物的存在。可选择地，通过特异性结合Rpi_edn2蛋白的抗体转化免疫测定，可以评估Rpi_edn2 蛋白在植物部分中的适当表达。与根据本发明的引物和探针最接近地，还可以利用在编码序列附近发现的特异性标记物。在下面的实验部分中示出了上述标记物，包括在表7中示出的Tm2-样图谱的标记物。高度优选的标记物是Tml900、Tml9F_Mse、Stm021、mcq-ATGl、 mcq-c2-终止、EDN-F和EDN-R，以及用于在实验部分和表5中描述的Tm2_样图谱的引物。 甚至更高度优选的标记物源自图4中示出的核酸序列。建议该序列的各部分对基因是唯一的，从而该序列的部分可用作非常特异的标记物。
在转基因方法的情况中，通过使用可选择的标记物或报告基因可实现选择转化的植物。在选择性标记物或选择中，在植物转化中使用最广泛的基因是EP131623中提出的赋予抗选择性试剂卡那霉素抗性的细菌新霉素磷酸转移酶基因(nptl、nptll和nptIII基因)，及在EP186425中提出的赋予抗潮霉素抗性的细菌aphIV基因。EP275957公开了来自产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙酰基转移酶基因的应用，该乙酰基转移酶基因赋予抗除草剂草胺膦(phosphinotricin)的抗性。EP218571中提出了赋予抗除草剂草甘膦相对抗性的植物基因。报告基因适合的实例是葡糖醛酸酶(GUS)、 β_半乳糖苷酶、萤光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)。然而优选使用无标记物的方法(诸如在 W003/010319中公开的方法)，其中使用基于核苷酸序列的试验可测定抗性基因的存在。
在优选实施方式中，本发明提供了一种用于在植物中提供抗卵菌感染的部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法，所述方法包括为植物或其部分提供
分离或重组的核酸序列，所述分离或重组的核酸序列包括编码Rpi_edn2氨基酸序列(见图4)的核酸序列或其功能片段或功能同源物；或
载体，所述载体包括本文所描述的核酸序列；或
如本文所描述的宿主细胞，
其中，所述卵菌包括疫霉属、优选致病疫霉；和/或其中，所述植物包括来自茄科的植物，优选马铃薯或番茄植物，更优选四倍体的马铃薯植物。
本发明还提供了一种植物，所述植物可使用如上所述的用于在植物中提供抗卵菌感染至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法得到。优 选的植物是来自茄科的植物，更优选地，所述植物是马铃薯或Solanum Iycopersicum(以前称作Lycopersicon esculentum)、Solanum melononga、Capsicum spp (诸如 C. annuum、C. baccatum、C.chinense、C. frutescens和C. pubescens)。因而本发明还提供了一种植物，所述植物已经具有编码Rpi_edn2蛋白的核酸或其功能片段或功能同源物。
本发明进一步提供了一种根据本发明植物的转基因植物部分或后代，所述根据本发明的植物包含编码图4的Rp1-edn2氨基酸序列的核酸或其功能片段或功能同源物。
在一个优选实施方式中，将本文所述的核酸转移至除Solanum edinense以外的茄属变种，即将本文所述的核酸优选提供给具有非edinense背景的植物，优选S. lycopersicon或马铃薯。其中后者最优选是四倍体变种，更优选是商业上感兴趣的变种，诸如 Bint je、Desiree 或 Premiere、Spunta、Nicola、Favorit、Russet Burbank、Aveka 或Lady Rosetta。还可将根据本发明的抗性提供给对卵菌感染已经具有部分抗性的植物，其中为所述植物提供编码其它抗性基因(诸如Rp1-blbl、Rp1-blb-2、Rp1-blb-3、Rp1-vntl、Rp1-chcl、Rp1-avl 1-1 > Rpi_avll_2、Rp1-Rl> Rpi_R2、Rpi_R3a、Rpi_R3b、Rp1-mcdl 或Rp1-mcql)的核酸。为了向植物提供抗卵菌感染的至少部分抗性，本发明进一步提供了分离或重组的核酸序列的应用，所述分离或重组的核酸序列包含编码图4的Rpi_edn2氨基酸序列的核酸序列或其功能片段或功能同源物；或包含任意所述核酸序列的载体的应用；或包含任意所述核酸序列或所述载体的宿主细胞的应用。在一个优选实施例中，所述卵菌包括疫霉属菌，甚至更优选包括致病疫霉。在另一个优选实施例中，所述植物包括马铃薯或SolanumIycopersicum (以前称作 Lycopersicon esculentum)。在又一实施方式中，本发明提供了一种用于生产Rpi_edn2蛋白或其功能片段或功能同源物的方法，所述方法包括将本文描述的核酸功能性地连接至调节序列，且允许所述核酸在宿主细胞中表达。调节序列的实例为启动子和/或终止子序列 。此外，携带本发明的抗性分子的植物还示出特异的病原体图谱，在这个意义下，所述植物将示出与源自致病疫霉的不同分离群的许多诱导子或效应物分子的过敏反应(结果为受感染组织的坏死)。如在表9中可见的，几种效应物诱发avl478-2植物中的该应答(更多细节参见实验部分)，诸如 PITG_20336、PITG_14039、PITG_20301、PITG_20303、PITG_20300、PITG_22880、PITG_09616、PITG_10540、PITG_15039、PITG_04097、PITG_04169、PITG_16726、PITG_23131 和 PITG_07550_9,而其它效应物(诸如 Avr3a、Avr-vntl、Avr-blbl、PITG_00774和PITG_10465)仅示出没有或极小的应答。因此，本发明的多个部分还为当转化进入植物且在植物中表达时示出对病原体效应物应答的那些核酸，所述病原体效应物类似于在表7中描述的图谱，更具体的是示出以多于50%的情况在HR发生中示出对 PITG_20336、PITG_14039、PITG_20301、PITG_20303、PITG_20300、PITG_22880、PITG_09616、PITG_10540、PITG_15039、PITG_04097、PITG_04169、PITG_16726、PITG_23131和 PITG_07550_9 的反应。将以下面非限制性的实例更加详细的解释本发明。实验部分在本研究中，我们旨于鉴定负责在S. X edinense中抗致病疫霉的高水平抗性的R基因的定位位置，用于进一步的基于基因图谱的克隆。从与CV.并行体杂交的不同S. X edinense基因型(ednl51_l和ednl50_4)产生两种隔离种群。使用可以在不同的R基因之间进行区分分离群和效应物测试该两种隔离种群(Champouret 2010 ；0h等2009 ；Vleeshouwers 等 2008)。使用 SSR标记物、NBS 作图(profiling) (van der Linden 等 2004)和CAPS标记物将抗性的隔离连接至染色体位置。对于不同的R基因开发基因家族导向的图谱分析(⑶FP)，且成功实施⑶FP以获得与那些R基因密切连接的标记物。
材料和方法
植物材料和定位种群(mapping population)
由德国(GLKS)的马铃薯收藏大 Liisewitz (Potato Collection Gross Liisewitz) 提供S. X edinense P. Berthault增加物。从接近墨西哥的托卢卡(Toluca de Lerdo)区域收集该增加物(SolRgene 数据库，http://www. plantbreeding. wur. nl/phytophthora/)。 筛选来自三种S. x edinense增加物(GLKS 25492,GLKS 25493和GLSK 25494)的十五种基因型对致病疫霉的抗性。选择两种抗性基因型，且该两种抗性基因型与易感的cv.并形体杂交以产生Fl定位种群。转移感兴趣的重组Fl基因型以进行体外培养，以维持并增殖该重组Fl基因型。具有抗性的个体Ednl50-4-104与cv Aveka杂交(图1)。具有抗性的克隆RH4x-149-006与KA2002-5030杂交以产生隔离种群KA2006-515。在大田中测试100个个体对致病疫霉IPO-C的抗性。抗性以1:1在得到的后代中隔离，表示在具有抗性的亲本中一个主要Rpi基因的存在。
疫霉属分尚群和疾病测试
疫霉属分离群和它们的种特异性及来源示于表I中。通过Geert Kessel>Francine Govers (瓦格宁根大学，荷兰)和Paul Birch (邓迪大学，苏格兰，英国)可获得这些分离群。通过三种不同的疾病试验测试植物的抗性体外试验(Huang 2005)、离体叶片试验 (Vleeshouwers等1999)和大田实验。使用致病疫霉分离群90128在五株小植物上进行一次体外试验。在离体叶片试验中，从五周龄的植物收集在第三和第五完全发育的叶片之间的一个叶片，且使用两种分离群90128和IPO-C接种该叶片。六天后对叶片进行评分，由于过敏感应答(hypersensitive response, HR)评为具有抗性(R)，如果出现孢子病变则评为易感(S)，或因为无明确抗性或易感的应答被评为定量的(quantitative，Q)。在荷兰的瓦格宁根，于2005年和2007年的夏天进行了包括S. X edinense基因型的两次大田试验。每次大田试验由两个随机化的田区(block)组成，且在这两个田区中，基因型表示为作为单个实验单元处理的四种植物的小块试验田(如Colon和Budding(1988)所描述的)。 为了在不同年份之间进行对比，包括了标准栽培品种Ostara、Bildtstar、Eersteling、Pimpernel、 Robijn和Biogold。撒料机(spreader)排由马铃薯栽培品种Bintje组成,边界排由马铃薯栽培品种Nicola组成。为了进行接种生产，在离体叶片试验中使用分离群IPO-C接种大量马铃薯栽培品种Bintje的叶片。六天后，洗掉孢子以在大型容器中制备孢子悬浮液。通过于10°C在容器中培养诱导游动孢子释放。在傍晚，使用具有两个喷射臂的拖拉机将游动孢子悬浮液喷射到马铃薯大田上。以每周为间隔进行疾病评估。对各样地估计覆盖晚疫病病变的叶片区域的百分比(Colon等1988)。从这些读数计算疾病发展曲线下方的面积 (AUDPC) (Fry 1978)，随后将AUDPC值转化成I (易感的) 9 (具有抗性)的级别(SolRgene 数据库)。
标记物的开发
从在温室中生长的植物收集幼小的叶片组织。通过下面的CTAB方案(Park等 2005)，使用Retsch仪器以96孔的版式分离基因组DNA。在本研究中使用了几个标记物技术CAPS标记物，SSR标记物,NBS作图标记物(van der Linden等2004)和不出特定R基因家族的R基因家族导向的(GFDP)作图标记物。
应用覆盖马铃薯基因组(Collins等 1999 ;Feingold 等 2005 ;Ghislain 等 2004)的一组大约80个SSR标记物，以确定隔离的R基因的染色体位置。来自定位种群的亲本基因组DNA以及11个有抗性的Fl个体和11个易感的Fl个体用于SSR标记物筛选。使用单个PCR程序进行SSR标记物的PCR反应初始循环，95°C 2分钟；然后包括95°C 30秒， 56 0C 30秒(使用1°C /分钟的变速(ramp))，及72°C 45秒(使用1°C /分钟的变速)的30 个循环；及，最终步骤，720C 3分钟。随后在丙烯酰胺凝胶上跑PCR产物，且使用L1-COR技术(Lincoln,内布拉斯加,美国)可视化。
为了证实定位位置且获得连接至R基因的PCR标记物，测试了来自SGN数据库 (http://solgenomics. net/)的已知CAPS标记物,及位于在已鉴定的染色体臂上的R基因簇附近的SH X RH基因图谱(van Os等，2006)。
使用基因家族导向的作图来开发紧密连接至R基因的标记物。通过用基因家族特异的引物取代NBS引物，按照之前描述的NBS作图(van der Linden等2004)进行基因家族导向的作图。对于三种R基因家族R2、Tm2和N,收集了从NCBI (http://www. ncb1. nlm. nih. gov/)可获得的序列和来自我们实验室进行的等位基因发掘研究的序列，并进行了比对。对于基因的不同结构域上的各家族(CC或TIR，NBS和LRR)(表I)，在保守序列上设计引物。特别为N样作图设计一些简并的引物。该分析与对Fl种群的集群分离分析法(BSA， Michelmore等1991)组合。集中提供抗性表型或易感表型的八个Fl个体,且使用引物/酶组合进行筛选。通过丙烯酰胺凝胶上的电泳使PCR产物可视化。从凝胶中切出已鉴定出与抗性相关联的片段，且测序。
效应物筛选
克隆源自致病疫霉基因组(Haas等2009)的大约250个RXLR编码基因(还被称为效应物)的集合，使得它们的信号肽在双35S启动子的控制下不进入双元载体pMDC32 中。所有的质粒与辅助质粒pBBRlMCS-5. virGN54D(Van Der Fits等2000)组合导入根癌农杆菌菌株AGLl (Lazo等1991)中。在从体外增殖移植后三周，在幼小的ednl50_4植物上进行农杆菌渗入。在总的24个重复(implication)中，制得每个效应物克隆。使用R3a 和Avr3a(Bos等2006)作为阳性对照，空的pMDC32作为阴性对照。通过van der Hoorn等 (2000)描述的方法经一些适应性改变进行重组根癌农杆菌的农杆菌渗入实验。
根癌农杆菌培养物在补充有抗生`素的3ml的LB培养基中生长，以选择根癌农杆菌菌株(羧苄青霉素)、双元载体(卡那霉素或壮观霉素)和辅助质粒(氯霉素)。第二天， 将培养物转移至补充有抗生素的15ml的YEB培养基中，以选择载体和辅助质粒。在第三天，收获细胞，并重悬在补充有乙酰丁香酮的MMA溶液中至最终0D600为0. 3。从渗入后的 3 8天评分应答，对通过(过敏感的)细胞死亡对渗入的反应的重复数量进行计数，且计算反应性渗入的百分比。
对于与效应物克隆的Rpi_edn2共渗入，制备OD6tltl = 0. 5的农杆菌在MMA中的悬浮液。连续制成各农杆菌悬浮液的1:1混合物，且渗入到本氏烟草植物的叶片中。渗入后一星期，评价过敏感细胞死亡的出现。
实施例1
在Solanum x edinense增加物中对致病疫霉抗性的筛选
为了鉴定用于R基因定位和克隆的抗性基因型,在来自三种Solanum x edinense 增加物的总的15种基因型中测试了对致病疫霉的抗性。通过使用分离群90128进行的体外试验首先测试了 15个个体。14种基因型给出了高水平抗性，一种基因型具有较低水平的抗性(表2)。从各增加物中，每种增加物选择两种高抗性基因型。在离体叶片试验中证实它们对分离群90128的抗性，且使用额外的分离群IPO-C接种也得出抗性表型。在2005年和2007年的两次大田实验证实在所有测试基因型中对IPO-C的强抗性。选择两种抗性基因型ednl50-4和ednl51_l产生Fl种群。在定位种群中的抗性的隔离基因型ednl50_4和ednl51_l与cv.并形体杂交以产生Fl定位种群。在离体叶片实验中，对各Fl个体进行表型分析对四种不同的致病疫霉分离群的抗性。测试了来自ednl50_4 x cv.并形体种群的159个个体及来自ednl51_l x cv.并形体种群的125个个体。对四种分离群的每一种分离群的抗性隔离在两个种群中(表3)。对90128的抗性隔离在两个种群中。对90128的抗性的隔离模式不同于对其它隔离群的抗性的隔离模式。Champouret (2010)在S. x edinense基因型ednl51_3中克隆到两个功能R2同源物(Rp1-ednl.1和R2-样)。R2赋予对90128的抗性，及赋予对在该种群上测试的其它分离群的易感性。因此，假定赋予对90128的抗性的R基因(Rp1-ednl)定位于R2簇。在两个种群中对IPO-C的抗性的隔离也仿效不同于对分离群PIC99189和UK7824的抗性的隔离的模式(表4)。这暗示着至少三种R-基因是形成观察到的隔离模式的原因，且这三种基因可基于它们的分离群识别图谱进行区分。总之，两个Fl种群示出对三种分离群(90128、99189和UK7824)的抗性和易感性(表3)的相似的隔离比率，且所述相似的隔离比率在分离群之间是独立的(表4)。在两个种群中对IPO-C的抗性的隔离是轻微歪斜的。但是种群ednl51-l x cv.并形体中具有抗性的Fl植物的数量较高，而种群ednl50-4 x cv.并形体中易感Fl植物的数量较高。可推测三种R基因的相同组存在于两种S. X edinense亲本基因型中。因此，本研究的剩余部分仅着重于一个Fl种群ednl50-4x cv.并形体。标记物开发使用种群ednl50_4 x cv.并形体对在种群中隔离的R基因进行定位。已知源自ednl50-4的Rp1-ednl.1和源自亲本并形体的RlO的两种基因的定位位置。所有我们测试了已知存在于感兴趣基因座中的标记物。对于定位于染色体4上的R2簇中的Rp1-ednl. 1，进行R2基因家族的作图。RlO定位于R3簇中的染色体11上(Bradshaw等2006)，因此测试了来自R3簇的CAPS标记物。其它两种基因的定位位置是未知的，且进行了基因组的广泛筛选。进行SSR筛选和NBS作图，以确定给予对IPO-C抗性的R基因，及给予对PIC99189的抗性的R基因的定位位置。为了该目的选择出对所有分离群均具有抗性或易感性的Fl个体的子集。使Fl个体的DNA保持分离用于SSR筛选，且扩大Fl个体的DNA用于NBS作图。来自R2族的Rp1-ednl存在于ednl50_4中 已经从基因型ednl51_3克隆得到同源物R-样和Rp1-ednl. 1，该基因型ednl51_3源自如ednl51-l的相同的增加物(Champouret 2010)。我们研究了该基因是否也存在于ednl50-4中。在R2基因家族的几个保守区域上设计了 7个R2作图引物(表I)。与RsaI组合测试上述引物，RsaI在亲本和Fl扩大的DNA上的R2序列中进行频繁地切割。每一引物揭示了示出与群集体(bulk)中的抗性相关联的至少一个片段。在整个种群的个体上测试给出最大量多态性带的引物(R2ch4F4)。得到的NBS标记物R2ch4F4-Rsa(400bp的片段) 与对90128的抗性相联系，在45个个体中具有10个重组体( 20cM)。在种群的一个子集上进行使用PiAvr2的农杆菌渗入，且证实在40个Fl个体中PiAvr2应答与对90128的抗性共隔离(图2)。从而证实在ednl50-4中的R2簇中的染色体4上Rpi_edn(R2-样或 Rp1-ednl.1或两者)的存在。
Rpi_edn2定位在染色体9上
施加在亲本及24个Fl个体上的一组大约80个SSR的筛选得到与对IPO-C的抗性相关联的一个连接的标记物。该标记物Stm021 (表5)位于染色体9上(Bakker等,原稿在准备中)。通过116个个体中的17个重组体( 15cM)证实了与对IPO-C抗性的连锁。 我们提议称赋予对IPO-C的抗性的R基因位于染色体9长臂上的该基因为Rpi_edn2(图 3)。标记物Stm021位于染色体9上的两个已知R基因之间包含来自S. venturii的R基因的簇，Tm-22同源物(Foster等2009 ；Pel等2009);及包含Rpiicql的簇，也为Tm_22同源物(Smilde等2005 ;专利W02009013468)。Tm_22是来自番茄的R基因，位于染色体9的上臂上，且赋予对烟草花叶病毒的抗性(Lanfermei jer等2003)。需要更多的标记物以确定 Rp1-edn2是否可能定位于这些簇中的一个中。来自基因组那些区域的CAPS标记物的开发没有成功，因为测试的13个引物组合没有一个揭示出连锁(linkage)。因此，为了开发紧密连锁的标记物且确定R基因的确切位置，进行了 Tm-22基因家族的作图(profiling)。在亲本和Fl群集的DNA上与两种酶RsaI和MseI组合设计和测试了 12种Tm_22特异性引物(表 I)。两种引物/酶的组合揭示了群集DNA中与抗IPO-C的抗性之间的联系，但仅证实了一种标记物。标记物Tml9F-Mse连锁至Rpi_edn2，且在107个个体中有6个重组体( 6cM)。 从凝胶中切出示出与表型联系的70bp片段,并进行测序。该序列与Rp1-vntl和Rpi_mcql 的对比不能揭示标记物来源的簇。使用用于克隆Rp1-vntl的起始密码子和终止密码子引物的PCR反应没有在S. X edinense表 型的任一种上得到任意的扩增产物，表明该簇没有存在于两种edn基因型中。
使用候选基因/等位基因发掘途径的Rp1-edn2的克隆
迄今为止，典型地通过位置克隆策略进行R基因的克隆。一旦从特定地R基因座克隆功能基因，则可尝试从相同或不同品种克隆功能同源物以确定在给定基因座处的序列多样性。这里，我们证实基于定位位置且与候选基因发掘途径结合，可产生等位基因的特异性标记物，该特异性标记物可形成用于功能R基因克隆的起始位点。
本发明人采用了基于同源物的候选基因发掘策略以克隆Rp1-edn2。第一步骤为设计并入候选mcq I基因同源物的推定的起始和终止密码子的引物，即mcq-ATG-1 5’ -atggctgaaattcttcttac-3J,mcq-cl-终止 5’ -tcatattctgagctttgcaag-3J，mcq-c2_ 终止 5，-tcatactctcagttttgcaagtc-3，(表 5)。引物 mcq-ATG-1 与引物反向 2 组合扩增 mcq 中的功能基因。
当在两种定位种群的亲本基因型上测试时,使用引物组mcq-ATG和mcq-cl-终止没有产生期望大小的扩增子。然而当组合mcq-ATG-Ι和mcq-c2-终止时，在既具有抗性又易感的后代中均扩增出大约2. 4kb的单个扩增子。随后，对既易感又具有抗性的植物的 PCR 产物均进行使用限制酶 Msel、Hael 11、NlaII1、HpaI1、DpnI1、AIu1、Hha1、Hinf1、Dde1、HpychIV、Rsal或TaqI的限制性酶切。经过MseI酶切后,可看到大约600bp的特异的限制性片段，该大约600bp的特异的限制性片段在疫霉属抗性隔离的60种基因型中100%连锁。将具有抗性的植物的未经酶切的PCR产物克隆至PGEMk-T Easy载体中，且24个克隆进行MseI酶切。基于MseI酶切模式可区分出总共9种不同的类别。对所有9种类别的克隆进行测序。获得的序列彼此享有80 90%的相似性。基于MseI酶切模式，预测EDN61导致与Rp1-edn2共隔离的多态性。在初始的定位种群中为EDN61设计了特异性SCAR标记物EDNF5’ -gcatcatgtctgcacctatg-3’ 和 EDN R 5’ ctttgatgtggatggatggtg-3’(表 5)。当测试时，标记物与抗性共隔离，证实了 EDN61与Rp1-edn2在基因方面非常接近，且潜在地可能是Rp1-edn2的候选者。Rp1-edn2的基因结构Rp1-edn2的开放阅读框编码863个氨基酸的预测的肽。该基因没有内含子。Rp1-edn2的蛋白序列携带R蛋白的CC-NBS-LRR类别的几个保守基序(图8)。卷曲螺旋(CC)结构域位于蛋白的氨基酸I和153之间的N末端部分。在第一个153个残基中，可在Rp1-edn2中识别由疏水残基组成的三对推定的七肽基序。可在氨基酸延伸段(strech)残基153和444之间(Ploop ，激酶-2，GLPL)识别NB-ARC (核苷酸结合位点，凋亡，R 基因产物，CED-4)结构域(Van der Biezen 和 Jones 1998)。Rpi_edn2 的 C 末端一半包括可根据共有序列LxxLxxLxxLxLxxC/N/Sx (X) LxxLPxx对齐的一系列具有不规则大小的15个LRR基序，其中X是任意氨基酸，且其中L代表1、L或V (McHaIe等2006)。在蛋白水平上，Rp1-edn2享有与RpincqL I的80 %的氨基酸一致性，与Rp1-mcql. 2的77%的氨基酸一致性。而发现与Rp1-vntl (73% )和Tm-2_2具有较低的百分比的同源性，分别享有73%和72%的一致性，示出Rp1-edn2限定了 Tm-2_2基因家族的新的子类别。计算出的核苷酸一致性如下
权利要求
1.一种分离或重组的核酸序列，包括编码图4的氨基酸序列Rpi_edn2的核酸序列或该核酸序列的功能片段或功能同源物，所述氨基酸序列Rpi_edn2提供对卵菌感染的至少部分抗性，所述功能同源物为与图4的氨基酸序列Rp1-edn2具有超过80%—致性的氨基酸序列进行编码。
2.根据权利要求1所述的分离或重组的核酸序列，包括如图4中描述的核酸序列。
3.—种包括根据权利要求1 2中任一项所述的核酸序列的载体。
4.一种宿主细胞,包括根据权利要求1 2中任一项所述的核酸序列或根据权利要求3所述的载体，所述宿主细胞优选为农杆菌细胞或植物细胞。
5.一种植物细胞，包括根据权利要求1 2中任一项所述的核酸序列或根据权利要求3所述的载体，优选地，其中所述植物细胞是来自茄科的细胞，更优选地是来自马铃薯的细胞，更优选地是来自四倍体马铃薯的细胞。
6.一种包括根据权利要求5所述的细胞的转基因植物。
7.一种源自根据权利要求6所述的植物的一部分，更优选地，其中所述部分是块茎。
8.一种由根据权利要求1 2中任一项所述的分离或重组的核酸或它的功能片段或功能同源物编码的蛋白，优选地，其中所述蛋白具有如图4中描述的Rp1-edn2的氨基酸序列。
9.一种(特异性)结合根据权利要求8所述的蛋白的抗体。
10.一种用于在植物中提供抗卵菌感染的至少部分抗性或提高抗卵菌感染的抗性的方法，包括通过转化对植物或所述植物的一部分提供根据权利要求1 2中任一项所述的核酸，或根据权利要求3所述的载体，或根据权利要求4所述的宿主细胞；或者，为所述植物提供根据权利要求8所述的蛋白；优选地，其中所述植物是来自茄科的植物，更优选地是马铃薯。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述卵菌包括疫霉属，优选地包括致病疫霉。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中还为所述植物提供编码选自Rp1-blbl、Rpi_blb2、Rpi_blb3、Rpi_chql_l、Rpi_chql_2、Rpi_vntl、Rpi_chcl、Rpi_ednl、Rpi_edn3、Rp1-m c q I和它们的组合的组中的抗性蛋白的核酸。
13.—种能够特异性结合根据权利要求1 2中任一项所述的核酸或它的互补核酸的结合分子，优选地，其中所述结合分子是引物或探针，优选地是如下的引物选自表7中描述的Tm2-作图的引物的组，或选自表5中描述的染色体9的引物的组，或特异性结合如图4中描述的核苷酸序列或它的一部分。
14.一种用于选择植物或植物材料或它们的后代对卵菌感染的易感性或抗性的方法，所述方法包括以下步骤测试所述植物或植物材料或它们的后代的至少一部分存在或没有如权利要求1 2中任一项所述的核酸， 优选地，其中使用根据权利要求13所述引物或探针进行所述测试，或 其中所述测试包含检测选自表7中描述的Tm2-作图的引物的组，或选自表5中描述的染色体9的引物的组中的一种或多种标记物的存在，或 其中所述标记物包括如图4中描述的所述核苷酸序列的一部分。
15.一种用于培育具有抗性的四倍体植物的方法，包括 a.使用已经包含根据权利要求1 2中任一项所述的核酸序列的五倍体植物的配子与四倍体植物的配子杂交；以及C.选择存在所述核酸序列的所述杂交的后代。
16.一种用于在植物育种中进行标记物辅助的选择以获得抗卵菌抗性的标记物，其中所述标记物挑选自如下的标记物选自表7中描述的Tm2-作图的引物的组,或表5中描述的染色体9的引物的组中；其中所述标记物包括如图4中描述的所述核苷酸序列的一部分。
全文摘要
本发明涉及一种从S.x edinense分离的新的抗性基因，Rpi-edn2和它的功能同源物或功能片段。另外，本发明涉及所述抗性基因的应用，例如所述抗性基因在提高或赋予植物中对卵菌感染的至少部分抗性的方法中的应用。本发明提供了一种分离或重组的核酸序列，所述分离或重组的核酸序列包括编码图4的氨基酸序列之一的核酸序列或其功能片段或功能同源物。
文档编号A01N65/38GK103038350SQ201180027203
公开日2013年4月10日 申请日期2011年5月31日 优先权日2010年5月31日
发明者尼古拉斯·克莱门斯·玛丽亚·亨里克斯·德·韦滕, E·C·韦尔佐, 雅各布斯·胡贝图斯·福森, 汉德里克·里特曼, 维维安·赫尔特鲁达·安东尼亚·安娜·福勒斯浩瓦斯, 埃弗特·雅各布森, 理查德·杰拉尔德斯·弗朗西斯库斯·菲瑟 申请人:艾维贝合作公司