降低植物种子的饱和脂肪酸含量的制作方法

专利名称：降低植物种子的饱和脂肪酸含量的制作方法
降低植物种子的饱和脂肪酸含量
优先权要求
本申请是共同悬而未决的申请U. S. S. N. 11/576,750(其是2005年10月7日提交，指定美国，并在2006年4月20日以PCT国际公开文本NO.W02006/042049A2以英语公布的PCT国际专利申请NO.PCT/US05/36052的进入国家阶段)的部分继续。PCT国际专利申请No. PCT/US05/36052是2004年10月8日提交的美国临时专利申请No. 60/617，532的继续。本申请也是2010年6月24日提交的美国临时专利申请No. 61/358,314的继续。技术领域
一般而言，一些实施方案涉及某些delta-9去饱和酶酶、编码这些酶的核酸、和其在植物细胞中的表达方法。一些实施方案涉及利用某些delta-9去饱和酶酶的活性来降低植物材料(例如，种子)中饱和脂肪酸的百分比组成并增加ω-7脂肪酸的百分比组成。本文中还公开了通过具体实施方案中的方法生成的植物和植物材料。
发明背景
植物衍生的油已经逐渐替换动物衍生的油和脂肪作为饮食脂肪摄取的主要来源。 然而，大多数工业化国家的饱和脂肪摄取仍然占总热量消费的约15%至20%。致力于促进更健康的生活方式，美国农业部(USDA)最近已经推荐饱和脂肪占日常热量摄取的小于10%。 为了促进消费者意识，目前由USDA发布的标记准则现在要求每14g食物份(serving)小于1. Og的总饱和脂肪酸水平接受“低饱和”标签，而每14g食物份小于O. 5g的总饱和脂肪酸水平接受“无饱和”标签。这意味着植物油的饱和脂肪酸含量分别需要小于7%和3. 5%以接受“低饱和”(low-sat)或“无饱和”标签。由于这些准则的发布，消费者对“低饱和”和 “无饱和”油的需要已经有猛增。至今，此需要已经主要以芸苔(canola)油，以及少得多的程度以向日葵和红花油满足。
虽然不饱和脂肪(单不饱和的和多不饱和的)是有益的(尤其在适度消费时)，但是饱和的和反式的脂肪不然。饱和脂肪和反式脂肪提高血液中不想要的LDL胆固醇水平。 膳食胆固醇也提高LDL胆固醇，并且甚至可以在没有提高LDL的情况下促成心脏病。因此， 可取的是，选择饱和脂肪、反式脂肪、和胆固醇低的食物作为健康饮食的一部分。
无论是植物还是动物起源的油的特征主要由油分子中碳和氢原子`的数目，及脂肪酸链中包含的双键的数目和位置决定。自植物衍生的大多数油由不同量的棕榈酸(16:0)、 硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)脂肪酸构成。常规地，棕榈酸和硬脂酸称为“饱和的”，这是因为其碳链以氢原子饱和，并且因此没有双键；它们含有有可能的最大数目的氢原子。然而，油酸、亚油酸、和亚麻酸是其中分别具有一个、两个和三个双键的18碳脂肪酸链。通常认为油酸单不饱和脂肪酸，而认为亚油酸和亚麻酸是多不饱和脂肪酸。U.S.D.A.将“无饱和”油产品定义为那些具有小于3. 5%脂肪酸含量的产品，其以按重量计的组合饱和脂肪酸含量(与脂肪酸的总量相比)计算。
芸苔油具有所有植物油的最低水平饱和脂肪酸。“芸苔”指基于种子的总脂肪酸含量(优选地，至多O. 5% (按重量计)，且最优选地，基本上为0% (按重量计))具有至多2% (按重量计)的芥酸(C22:l)含量，并且在压碎后生成含有小于30 μ mol/g脱脂(oil-free)粗粉的风干粗粉的油菜籽(芸苔属(Brassica))。与更传统的物种品种比较，这些类型的油菜籽根据其可食性区别。
假定在含油种子中，脂肪酸合成主要在质体中发生。脂肪酸合成的主要产物是棕榈酸酯(16:0)，其似乎有效延长为硬脂酸酯(18:0)。虽然仍在质体中，但是饱和脂肪酸然后可以受到称为酰基-ACP delta-9去饱和酶的酶去饱和，以引入一个或多个碳_碳双键。 具体地,硬脂酸酯可以受到质体delta-9去饱和酶酶快速去饱和以产生油酸酯(18:1)。实际上，棕榈酸酯也可以被质体delta-9去饱和酶去饱和成棕榈油酸酯(16:1)，但是此脂肪酸在大多数植物油中仅以痕量(0-0. 2%)出现。如此，质体中脂肪酸合成的主要产物是棕榈酸酯、硬脂酸酯、和油酸酯。在大多数油中，油酸酯是合成的主要脂肪酸，因为饱和脂肪酸以低得多的比例存在。
新合成的脂肪酸从质体输出至细胞质。随后植物脂肪酸在细胞质中的去饱和似乎限于油酸酯，其可以被微粒体去饱和酶去饱和成亚油酸酯(18:2)和亚麻酸酯(18:3)，所述微粒体去饱和酶对酯化为磷脂酰胆碱(PC)的油酰基或亚油酰基底物起作用。另外，根据植物，油酸酯可以通过延长(至20:1、22:1、和/或24:1)，或者通过添加官能团进一步修饰。 然后，这些脂肪酸以及饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸酯在内网状膜中装配成甘油三酯。
植物酰基-ACP delta-9去饱和酶酶是可溶的。它位于质体基质中，并且使用酯化为ACP(主要是硬脂酰-ACP)的新合成的脂肪酸作为底物。这与其它delta-9去饱和酶酶形成对比，所述其它delta-9去饱和酶酶位于内质网状膜(ER，或线粒体)中，使用酯化为Co-A的脂肪酸作为底物，并饱和脂肪酸棕榈酸酯和硬脂酸酯两者去饱和。美国专利 5，723，595和6，706，950涉及植物去饱和酶。
已经将酵母delta-9去饱和酶基因自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分离，克隆，并测序。Stukey 等(1989) J. Biol. Chem. 264:16537-44; Stukey 等(1990) J. Biol. Chem. 265:20144-9。已经将此酵母基因导入烟草叶组织中(Polashcok等(1991)FASEB J. 5:A1157;Polashok 等(1992)Plant Physiol. 100:894-901)，并且在此组织中明显表达。 此外，在马铃薯中表达此酵母基因。见Wang等(1996) J. Agric. Food Chem. 44:3399-402; 及Wang等(2001)Phytochemistry58:227-32。虽然对使用此酵母delta-9去饱和酶基因的烟草和马铃薯两者报告了某些不饱和脂肪酸的一些增加及某些饱和脂肪酸的一些减少，但是烟草和马铃薯明显不是油类作物。也将此酵母基因导入油菜(Brassica napus)中。美国专利 5，777，201。
已经将来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的不同真菌酰基-CoA delta-9 去饱和酶导入芸苔中，由此实现含油种子中降低的饱和脂肪酸水平。美国专利申请公开文本US2008/0260933A1。构巢曲霉酰基-CoA delta-9去饱和酶在含油种子中对硬脂酸酯 (61-90%)比对更丰富的棕榈酸酯脂肪酸(36-49%)提供更大的消减。发明概述
本文中公开了新颖的真菌delta-9去饱和酶酶；包含编码此类去饱和酶的至少一种核苷酸序列的核酸；和包含前述物质之任一的植物、植物材料(例如，种子)、植物部分、和植物商品产品。一些实施方案的方面以自Magnaporthe grisea、颖枯小球腔菌 (Leptosphaeria nodorum)、和美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)分离的真菌 delta-9 去饱和酶酶例示。一些例子包括天然的和合成的delta-9去饱和酶，其对棕榈酸或硬脂酸具有底物偏爱。
一些实施方案包括编码包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列的 delta-9 去饱和酶酶的分离的核酸分子SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO:50, SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52, SEQ IDN0:72 JPSEQ ID N0:73。在具体的例子中，核酸分子包含与选自下组的序列至少60%相同的序列SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:5, SEQ IDNO:8, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:48JPSEQ ID NO:49。这些和其它实施方案可以包括包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列的分离的 delta-9去饱和酶多肽SEQ ID NO: 12,SEQID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 72 JPSEQ ID NO: 73。
还公开了在植物细胞中表达至少一种前述核酸和/或多肽的方法。具体的实施方案利用delta-9去饱和酶酶活性，使得饱和脂肪酸的百分比组成在自任何前述物质生成的植物、植物材料(例如，种子)、和/或包含植物细胞的植物部分、和/或植物商品产品中可以降低。在一些实施方案中，ω-7脂肪酸在植物、植物材料、植物部分、和/或植物商品产品中可以伴随增加。
一些实施方案包括用于减少植物、植物材料、植物部分、和/或植物商品产品中饱和脂肪酸量的方法，该方法包括用编码本发明的delta-9去饱和酶多肽的核酸分子转化植物细胞，使得细胞中的饱和脂肪酸量减少。一些实施方案包括用于创建遗传工程化植物的方法，所述遗传工程化植物与同一物种的野生型植物相比在植物中包含减少的饱和脂肪酸量。此类方法可以包括用编码本发明的delta-9去饱和酶多肽的核酸分子转化植物材料 (或植物细胞)，并培养经转化的植物材料(或植物细胞)以获得植物。在具体的例子中，可以用编码本发明的delta-9去饱和酶多肽的核酸分子转化来自拟南芥物种的植物细胞和/ 或植物材料。
前述和其它特征从几个实施方案的以下详细描述及参照进行的附图看会变得更加显而易见。
附图简述


图1包括对多种真菌去饱和酶蛋白质序列的示意性系统发生分析。将描绘的去饱和酶的完整蛋白质序列使用ClustalX比对，并使用MEGA展示。
图2(a_d)包括真菌delta-9去饱和酶基因序列的比对。大写字体代表此比对中的保守核苷酸。阴影字体代表此比对中的相同核苷酸。
图3 (a-b)包括真菌delta-9去饱和酶多肽的比对。
图4-18包括包含可用于一些实施方案的真菌delta-9去饱和酶多肽编码核苷酸序列的例示性质粒的质粒图。图4明确包括包含LnD9DS-2编码(图4a;pDAB110110)和 HzD9DS 编码(图 4b;pDAB110112)核苷酸序列且进一步包含 PvPhas5’UTR 和 PvPhas3’UTR 的例示性质粒的质粒图。
图19包括的数据显示了来自用某些例示性真菌delta-9去饱和酶基因序列转化的植物的例示性T2拟南芥种子的总饱和脂肪酸含量(%FAMEs)。
图20包括的数据显示了来自用某些例示性真菌delta-9去饱和酶基因序列转化的植物的例示性T2拟南芥种子的棕榈酸(C16:0)含量(%FAME)。
图21包括的数据显示了来自用某些例示性真菌delta-9去饱和酶基因序列转化的植物的例示性T2拟南芥种子的硬脂酸(C18:0)含量(%FAME)。
图22包括的数据显示了来自用某些例示性真菌delta-9去饱和酶基因序列转化的植物的例示性T2拟南芥种子的棕榈油酸(C16:l)含量(%FAME)。
图 23 包括来自用 pDAB7319(AnD9DS v3 和 LnD9DS_2 v2)或 pDAB7324(AnD9DS v3 和 HzD9DS v2)转化的芸苔植物的发育种子中HzD9DS和LnD9DS-2mRNA转录物(相对于AnD9DS 转录物)积累的图示。相对于肌动蛋白转录物水平测定每种基因的qRT-PCRA ACt，然后相对于每种样品中AnD9DS转录物的水平标准化HzD9DS和LnD9DS_2转录物的量。
序列表
所附序列表中列出的核酸序列使用如37C. F. R. §1. 822中限定的核苷酸碱基的标准字母缩写显示。仅显示每种核酸序列的一条链，但是互补链理解为通过对展示链的任意提及而包括在内。在所附序列表中
SEQ ID NO:1 显不了用于 PCR 扩增 Magnaporthe grisea 酸基-CoAdelta-9 去饱和酶基因(在一些地方称为MgD9DS)片段的正向引物。
SEQ ID NO: 2显示了用于PCR扩增M. grisea酰基-CoA delta-9去饱和酶基因 (在一些地方称为MgD9DS)片段的反向引物。
SEQ ID N0:3显示了通过PCR扩增的M. grisea酰基-CoA delta-9去饱和酶基因 (在一些地方称为MgD9DS)的例示性片段。
SEQ ID NO:4显示了例示性的无内含子的MgD9DS克隆。
SEQ ID NO:5显示了编码第一颖枯小球腔菌酰基-CoA delta-9去饱和酶(在一些地方称为LnD9DS-l)的例示性核酸序列。
SEQ ID N0:6和7显不了可以用于一些实施方案的引物序列。
SEQ ID N0:8显示了显示了编码第二例示性颖枯小球腔菌酰基-CoAdelta_9去饱和酶(在一些地方称为LnD9DS-2)的例示性核酸序列。
SEQ ID N0:9显示了来自M. grisea的例示性天然delta-9去饱和酶基因(标记为 MgD9DS vl)的编码区。
SEQ ID N0:10显示了来自美洲棉铃虫的例示性天然delta-9去饱和酶基因(标记为HzD9DS vl)的编码区。
SEQ ID N0:11显示了来自颖枯小球腔菌的例示性天然delta-9去饱和酶 (LnD9DS-2vl)基因的编码区。
SEQ ID NO: 12显示了来自M. grisea的例示性天然delta-9去饱和酶(MgD9DS)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 13显示了来自美洲棉铃虫的例示性天然delta-9去饱和酶(HzD9DS) 的氨基酸序列.
SEQ ID NO: 14显示了来自颖枯小球腔菌的例示性天然delta-9去饱和酶 (LnD9DS-2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 15显示了例示性的经芸苔优化的来自M. grisea的delta-9去饱和酶基因(MgD9DS v2)的序列。
SEQ ID NO: 16显示了例示性的经芸苔优化的来自美洲棉铃虫的delta-9去饱和酶基因(HzD9DS v2)的序列。
SEQ ID NO: 17显示了例示性的经芸苔优化的来自颖枯小球腔菌的delta-9去饱和酶基因(LnD9DS-2 v2)的序列。
SEQ ID NO: 18-39显示了可以用于一些实施方案的引物和探针的序列。
SEQ ID N0:40_43显不了可以在一些实施方案中用于提高表达的例不性备选 Kozak序列ο
SEQ ID N0:44显示了别的例示性的经芸苔优化的来自颖枯小球腔菌的delta-9去饱和酶基因(LnD9DS-2 v3)的序列。
SEQ ID N0:45显示了别的例示性的经芸苔优化的来自美洲棉铃虫的delta-9去饱和酶基因(HzD9DS v3)的序列。
SEQ ID NO:46显示了 Myc标签的氨基酸序列。
SEQ ID NO:47显示了 HA标签的氨基酸序列。
SEQ ID N0:48显示了编码构巢曲霉delta-9去饱和酶(在一些地方称为AnD9DS v2)的例示性核酸序列。
SEQ ID N0:49显示了编码构巢曲霉delta-9去饱和酶(在一些地方称为AnD9DS v3)的第二种例示性核酸序列。N0:50显示了如以SEQ ID N0:48_49 (AnD9DS)例示的核酸编码的氨基酸序NO: 51显示了另一种例示性AnD9DS去饱和酶的氨基酸序列。NO:52显示了来自酿酒酵母的例示性天然delta-9去饱和酶(ScOLEl)的NO:53-66显不了可以用于一些实施方案的质粒。NO :67-71包括可以用于一些实施方案的几种核酸调节控制元件。NO: 72显示了例示性AnD9DS去饱和酶的N端68个残基(1_68)。NO: 73显示了例示性AnD9DS去饱和酶的C端175个残基(281-455)。NO:74显示了质粒pDABllOllO的图。NO:75显示了质粒pDAB110112的图。N0:76显示了编码例示性M. grisea酰基-CoA delta-9去饱和酶(在一些地方称为MgD9DS)的例示性核酸序列。
SEQ ID NO:77显示了来自颖枯小球腔菌的例示性天然delta-9去饱和酶SEQ ID NO: 14内包含的氨基酸序列。
SEQ ID NO:78显示了来自美洲棉铃虫的例示性天然delta-9去饱和酶SEQ ID NO: 13内包含的氨基酸序列。
发明详述`
1.几个实施方案的概述
我们先前将来自构巢曲霉的真菌酰基-CoA delta-9去饱和酶导入芸苔中，由此实现种子油中降低的饱和脂肪酸水平。美国专利申请公开文本US2008/0260933A1。构巢曲霉delta-9去饱和酶在种子油中对硬脂酸酯￠1-90%)比对更丰富的棕榈酸酯脂肪酸
SEQID列。
SEQID
SEQID氨基酸序列。
SEQID
SEQID
SEQID
SEQID
SEQID
SEQID
SEQID(36-49%)提供更大的消减。因此，优先对棕榈酸酯饱和物起作用的delta-9去饱和酶的共导入会通过互补构巢曲霉delta-9去饱和酶的硬脂酸酯优选活性来实现总饱和物的进一步降低。在本发明的一些实施方案中，公开了具有一定底物特异性范围的真菌delta-9去饱和酶多肽。具体的实施方案包括棕榈酸酯优选性delta-9去饱和酶(例如，如本文中公开的天然真菌酶，或其功能性等同物；和设计为具有棕榈酸底物偏爱的合成多肽)。
本文中公开了编码delta-9去饱和酶多肽的核酸分子，其包含与选自下组的序列至少 60% 相同的核苷酸序列SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ IDN0:15, SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQID NO:48和SEQ ID NO:49。在一些实施方案中，核酸分子可以进一步包含与delta-9去饱和酶多肽编码序列可操作连接的基因调节元件。在具体的实施方案中，基因调节元件可以是菜豆蛋白启动子、菜豆蛋白5’非翻译区、菜豆蛋白3’非翻译区、 根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)ORFl 3’非翻译区、木薯叶脉花叶病毒启动子、烟草(Nicotiana tabacum) RB7基质附着区、T链边界序列、LfKCS3启动子、和FAEl启动子。
还公开了 delta-9去饱和酶多肽及编码此类delta-9去饱和酶多肽的核酸分子， 所述delta-9去饱和酶多肽包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:50，SEQ IDNO:52，SEQ ID NO:72和SEQ ID N0:73。
在一些实施方案中，可以在植物材料、细胞、组织、或全植物中表达核酸分子和 delta-9去饱和酶多肽，以相对于同一物种的野生型植物中观察到的量,减少植物材料、细胞、组织、或全植物中饱和脂肪酸的量。本发明的备选实施方案包括用于减少植物材料、细胞、组织、或全植物中饱和脂肪酸量的方法。此类方法可以包括用至少一种前述核酸分子转化植物材料、细胞、组织、或全植物，使得植物材料、细胞、组织、或全植物中饱和脂肪酸的量减少。具体的实施方案包括用于优先减少植物材料、细胞、组织、或全植物中棕榈酸和/或硬脂酸脂肪酸的方法。
例如，可以对植物、或自植物衍生的植物材料(例如，拟南芥属的植物，或芸苔) 实施本文中所公开的方法。一个具体的实施方案涉及用于创建或再生遗传工程化植物的方法，所述遗传工程化植物与同一物种的野生型植物相比在植物中包含减少的饱和脂肪酸量，所述方法包括用至少一种前述核酸分子转化植物细胞或材料；并培养经转化的植物材料以获得植物。还公开了通过任何前述方法获得的植物、植物材料、植物细胞、和种子。
I1.缩写
ΧγΔζ含有X个碳和从羧基端开始数起第
ACP酰基载体蛋白
COA辅酶A
FA脂肪酸`
FAM荧光素
FAS脂肪酸合成
FAME脂肪酸甲酯
KASIIβ -酮脂酰-ACP合酶II
MUFA 单不饱和脂肪酸
WT野生型
II1.术语
脂肪酸如本文中使用的，术语“脂肪酸”指例如从约C12至C22的不同链长的长链脂肪族酸(链烷酸)，尽管更长和更短链长的酸两者是已知的。脂肪酸的结构以符号x:yAz 表示，其中“X”是特定脂肪酸中碳(C)原子的总数，且“y”是碳链中如从该酸的羧基端开始数起的第“z”位中的双键数目。
代谢途径术语“代谢途径”指细胞内存在的、由酶催化以实现代谢产物转化或另一代谢途径启动的一系列化学反应。代谢途径可以牵涉几个或许多步骤，并且可以与不同代谢途径竞争特定反应底物。类似地，一种代谢途径的产物可以是又一代谢途径的底物。
代谢工程出于本发明的目的，“代谢工程”指改变细胞中的一种或多种代谢途径， 使得在细胞中运行的总代谢途径的总体方案内实现将初始底物逐步修饰为具有期望的精确化学结构的产物的理性策略设计。
去饱和酶如本文中使用的，术语“去饱和酶”指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即，引入双键)以生成感兴趣的脂肪酸或前体的多肽。植物可溶性脂肪酸去饱和酶酶可以将双键区域专一性引入饱和的酰基-ACP底物中。酰基-CoA去饱和酶将双键区域专一性引入饱和的脂肪酰基-CoA底物中。该反应牵涉通过由形成去饱和酶构造核心的四螺旋束配位的两电子还原性二铁中心活化分子氧。一些实施方案中特别感兴趣的是酰基-CoA delta-9去饱和酶。
delta-9-18 IO1-ACP去饱和酶是所有植物维持膜流动性需要的。虽然此酶主要使硬脂酰-ACP去饱和，但是它在棕榈酰-ACP的情况中也在微小的程度上有活性。
变体去饱和酶如本文中使用的，术语“变体去饱和酶”涵盖展现出与在生成不常见的脂肪酸中的作用一致的比活谱的那些去饱和酶。变体去饱和酶可以自生物体分离，经由定向进化程序来工程化改造，或者工程化改造为掺入来自一种或多种表征过的去饱和酶的保守氨基酸的合成去饱和酶。
后代植物出于本发明的目的，“后代植物”指可以通过植物育种方法获得的任何植物，或自其获得的植物材料。植物育种方法是本领域中公知的，并且包括天然育种、人工育种、牵涉DNA分子标志分析的选择育种、转基因学、和商业育种。
植物材料如本文中使用的，术语“植物材料”指自植物获得的任何细胞或组织。
核酸分子核苷酸的聚合形式，其可以包括RNA的有义和反义链两者、cDNA、基因组DNA、和上述物质的合成形式和混合的聚合物。核苷酸指核糖核苷酸、脱氧核苷酸、或任一类核苷酸的经修饰形式。如本文中使用的，“核酸分子”与“核酸”和“多核苷酸”是同义的。 该术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括通过天然存在的和/或非天然存在的核苷酸联接连接在一起的天然存在的和经修饰的核苷酸之任一或两者。
核酸分子可以经过化学或生物化学修饰，或者可以含有非天然的或衍生化的核苷酸碱基，如本领域普通技术人员容易领会`的。此类修饰包括例如标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰，诸如不带电荷的连接(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯，等等)、带电荷的连接(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯，等等)、悬垂的模块(moiety)(例如，`肽)、插入剂(例如，吖啶、补骨脂素，等等)、螯合剂、烧化剂(alkylator)、和经修饰的连接(例如,alpha异头核酸,等等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑学构象，包括单链、双链，部分双链体、三联体、发夹、环形和挂锁构象。
可操作连接的当第一核酸序列在与第二核酸序列的功能性关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作连接。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作连接。在重组生成时，可操作连接的核酸序列一般是连续的，且在必需连接两个蛋白质编码区时，在同一阅读框中。然而，核酸为了可操作连接不需要是连续的。
调节元件如本文中使用的，术语“调节元件”指具有基因调节活性的核酸分子； 即具有影响可操作连接的可转录核酸分子的转录或翻译的能力的核酸分子。调节元件诸如启动子、前导物、内含子和转录终止区是具有基因调节活性的非编码核酸分子，其在活细胞的总体基因表达中发挥不可或缺的作用。因此，在植物中发挥功能的分离的调节元件可用于经由分子工程化技术修饰植物表型。“调节元件”意指决定是否表达特定基因、何时表达特定基因、及以何种水平表达特定基因的一系列核苷酸。调节DNA序列与调节蛋白或其它蛋白质特异性相互作用。
如本文中使用的，术语“基因调节活性”指能够影响可操作连接的核酸分子的转录或翻译的核酸分子。具有基因调节活性的分离的核酸分子可以提供可操作连接的核酸分子的时间或空间表达或调控表达水平和速率。具有基因调节活性的分离的核酸分子可以包括启动子、内含子、前导物、或3’转录终止区。
启动子如本文中使用的，术语“启动子”指牵涉RNA聚合酶II或其它蛋白质诸如转录因子(调节转录的反式作用蛋白因子)的识别和结合以启动可操作连接的基因转录的核酸分子。启动子可以自身含有招致可操作连接的基因转录的亚元件诸如顺式元件或者增强子域。“植物启动子”是在植物细胞中功能性的天然的或非天然的启动子。可以使用植物启动子作为5’调节元件以调控一种或多种可操作连接的基因表达。植物启动子可以以其时间、空间、或发育表达模式限定。本文中所描述的核酸分子可以包含含有启动子的核酸序列。
序列同一性如本文中在两种核酸或多肽序列的背景中所使用的，术语“序列同一性”或“同一性”可以指两种序列中在规定的比较窗里为 了实现最大对应性而比对时相同的残基。
两种核酸序列间或两种氨基酸序列间的相似性按照序列间共享的序列同一性水平表示。序列同一性通常按照百分比同一性表示；百分比越高，两种序列越相似。用于比对比较序列的方法在下文详细描述。
在提及蛋白质使用序列同一性百分比时，认可的是，不相同的残基位置经常相差保守的氨基酸取代，其中氨基酸残基用具有类似化学特性(例如，电荷、疏水性或空间效应)的其它氨基酸残基取代，并且因此不改变分子的功能特性。
因此，在序列相差保守取代时，百分比序列同一性可以向上调节以校正不相同残基位点处取代的保守性质。相差此类保守取代的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行此调节的技术是本领域普通技术人员公知的。通常，此类技术牵涉将保守取代评分为部分的，而不是完全的匹配，由此增加百分比序列同一性。例如，在对相同的氨基酸给予0-1的得分，而对非保守取代给予O得分的情况中，对保守取代给予0-1的得分。可以计算保守取代的得分，例如如程序PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, CA)中执行的。
如本文中所使用的，术语“序列同一性百分比”可以指在比对窗里比较两个最佳比对序列时测定的数值，其中为了两个序列的最佳比对，比较窗中序列的部分与参照序列 (其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通过测定两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比来计算百分比。
氨基酸序列中的类似位置可以通过前述段落中所描述的方法比对核酸和氨基酸序列。在比对时，若各位置在共有序列内是相同的，则一个序列中的位置与比对序列中的位置在“类似位置”中。
用于比对比较序列的方法是本领域中公知的。各种程序和比对算法记载于Smith 和 Waterman, Adv. Appl. math. 2 : 482，1981; Needleman 和 Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970;Pearson 和 Lipman, Proc. Natl. Acad. Sc1. USA85:2444, 1988;Higgins 和 Sharp, Gene73:237-44, 1988;Higgins 和 Sharp, CABI0S5:151-3，1989;Corpet 等，Nucleic Acids Re search16: 10881-10890，1988;Huang,等，Computer Applications in the Biosciences8:155-65， 1992;Pearson 等，Methods in Molecular Biology24:307-31, 1994;Tatiana等，FEMS Microbiol. Lett. , 174:247-50，1990. Altschul 等，J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990 (详细考虑序列比对方法和同源性计算)。
国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information, NCBI)基本局部比对搜索工具(BLAST)在因特网上可获得(于blast, ncb1. nlm. nih. gov/Blast. cgi),其与序列分析程序,例如blastp和blastn结合使用。关于如何使用此程序测定序列同一'I"生的描述在因特网上经由NCBI于blast, ncb1. nlm. nih. gov/ Blast. cgi CMD=ffeb&PAGE_TYPE=BlastDocs 可获得。
为了比较氨基酸序列 ，使用缺省参数采用BLAST程序的“Blast2种序列 (Blast2sequence) ”功能(bl2seq)。特定参数可以在本领域技术人员的判断内调节，以例如提供错配罚分或匹配奖励。
经转化的如本文中使用的，术语“经转化的”指已经接受外来核酸分子，诸如构建体导入的细胞、组织、器官、或生物体。可以将导入的核酸分子整合入接受细胞、组织、器官或生物体的基因组DNA中，使得导入的多核苷酸分子得到后续后代继承。“转基因”或“经转化”细胞或生物体还包括所述细胞或生物体的后代和自在例如杂交中采用此类转基因植物作为亲本的育种程序生成并展现出源自存在外来核酸分子的改变的表型的后代。
IV.减少宿主细胞、组织、或生物体中饱和脂肪酸的代谢工程方法
A.概述
本发明的一个实施方案包括在植物种子中弓丨入具有特定酰基-CoA偏爱(例如，对于棕榈酸或硬脂酸)的delta-9去饱和酶。delta-9去饱和酶的特定酰基-CoA偏爱实现对某些特定饱和脂肪酸集合(例如，棕榈酸酯，用于转化成单不饱和产物)的靶向。选择酰基-CoA delta-9去饱和酶来降低植物中的饱和脂肪酸含量，因为它们通常不以任何可察觉的程度在植物系统中生成。
B.多肽
依照本发明的一些实施方案的多肽包含如下的氨基酸序列，其在与选自下组的序列比对时显示增加的百分比同一性SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:72和SEQ IDNO:73 这些和其它实施方案内的特定氨基酸序列可以包含与前述序列具有例如至少约70%，约75%，约80%，81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%96%，97%, 98%, 99% 或 100% 同一性的序列。在许多实施方案中，在与前述序列比对时具有前述序列同一性的氨基酸序列编码具有delta-9-18:0-ACP去饱和酶酶促活性的肽，或此类肽的部分。C.核酸—些实施方案包括编码上文所描述的多肽的核酸分子。例如，一些实施方案中的核酸序列在与选自下组的序列比对是显示增加的百分比同一性SEQ ID NO:3, SEQID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ IDNO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID N0:48和SEQ IDN0:49。这些和其它实施方案内的特定核酸序列可以包含与选自下组的序列具有例如至少约 60%,约 65%,约 70%,约 75%,约 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%96%，97%, 98%, 99%或 100% 同一性的序列SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQID NO:5，SEQ ID NO:8，SEQID NO:9，SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:15，SEQ IDNO: 16，SEQID NO: 17，SEQ ID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:48 和 SEQ ID NO:49。本领域普通技术人员理解的是，可以 例如通过依照密码子简并性引入可允许的核苷酸取代在不实质性改变编码多肽的氨基酸序列的情况中修饰核酸分子。在一些实施方案中，本发明的核酸分子包含基因调节元件(例如，启动子)。启动子可以基于会接受载体构建体插入的细胞类型选择。在细菌、酵母和植物中发挥功能的启动子是本领域中公知的。启动子也可以基于其调节特征进行选择。此类特征的例子包括增强转录活性、可诱导性、组织特异性、和发育阶段特异性。在植物中，已经描述了病毒或合成起源的诱导型、组成性活性、时间调节性、和空间调节性启动子。见例如Poszkowski 等(1989)EMBO J. 3:2719;Odell 等(1985)Nature313:810;及 Chau 等(1989)Science244:174-81)。有用的诱导型启动子包括例如由通过应用安全剂(取代的苯磺酰胺除草剂)诱导的水杨酸或聚丙烯酸诱导的启动子、热休克启动子、自菠菜硝酸盐还原酶可转录核酸分子序列衍生的硝酸盐诱导型启动子、激素诱导型启动子、和与RuBP羧化酶的小亚基和LHCP家族结合的光诱导型启动子。有用的组织特异性、发育调节性启动子的例子包括￠-伴大豆球蛋白(conglycinin)7Sa启动子和种子特异性启动子。可用于在种子质体中优先表达的植物功能性启动子包括那些来自牵涉含油种子中脂肪酸生物合成的蛋白质和来自植物储存蛋白的。此类启动子的例子包括来自可转录核酸分子序列诸如菜豆蛋白、油菜籽蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、ACP、硬脂酰-ACP去饱和酶、和油质蛋白的5’调节区。另一种例示性的组织特异性启动子是种子组织特异性的凝集素启动子。其它有用的启动子包括胭脂氨酸合酶、甘露氨酸合酶、和章鱼碱合酶启动子(其在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导质粒上携带)；花椰菜花叶病毒(CaMV) 19S和35S启动子；增强型CaMV35S启动子；玄参花叶病毒35S启动子；来自核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)小亚基的光诱导型启动子；来自烟草的EIF-4A启动子(Mandel等,(1995) Plant Mol. Biol. 29:995-1004);玉米鹿糖合成酶；玉米醇脱氢酶I ;玉米光收获复合物(light harvesting compolex);玉米热休克蛋白；来自拟南芥的几丁质酶启动子；LTP(脂质转移蛋白)启动子；矮牵牛查耳酮异构酶；豆富含甘氨酸的蛋白I ;马铃薯patatin ;泛素启动子；和肌动蛋白启动子。优选地，有用的启动子是种子选择性的、组织选择性的、或诱导型的。种子特异性调节在例如EPO 255 378中有讨论。为了获得更高的异源基因表达，可以优选的是再工程化改造基因，使得它在表达宿主细胞(例如，植物细胞，例如，芸苔、稻、烟草、玉米、棉、和大豆)中更有效地表达。因此，设计植物表达的编码delta-9去饱和酶的基因中任选的额外步骤(即，在提供一种或多种基因调节元件外)是为了最佳表达而再工程化改造异源基因蛋白质编码区。具体的实施方案包括再设计的基因，其经过优化以提高在转基因芸苔植物细胞或拟南芥植物细胞中，而不是在用天然存在的异源基因序列转化的芸苔植物细胞或拟南芥植物细胞中的表达水平(即，生成更多蛋白质)。由于由遗传密码的冗余性/简并性提供的可塑性(即，一些氨基酸由超过一种密码子规定)，不同生物体或生物体类中的基因组进化已经导致同义密码子的差别选择。此“密码子偏爱”在蛋白质编码区的平均碱基组成中得到反映。例如，具有含相当较低G+C含量的基因组的生物体利用更多的在同义密码子的第三位具有A或T的密码子，而那些具有较高G+C含量的生物体利用更多的在第三位具有G或C的密码子。此外，认为mRNA内“次要”密码子的存在可以降低 所述mRNA的绝对翻译速率，尤其在与次要密码子对应的带电荷的tRNA的相对丰度较低时。此推理的延伸是通过个别次要密码子降低翻译速率对于多种次要密码子至少会是叠加的。因此，在特定表达宿主中具有相对较高次要密码子含量的mRNA会具有相应较低的翻译速率。此速率可以通过编码蛋白质的相应低水平反映。在工程化改造编码delta-9去饱和酶的优化基因以在芸苔或拟南芥(或其它植物，诸如稻、烟草、玉米、棉或大豆)中表达中，若已经测定预期的宿主植物的密码子偏爱，则其是有帮助的。存在多种公众可用的DNA序列数据库，其中可以寻找关于植物基因组的密码子分布或各种植物基因的蛋白质编码区的信息。密码子偏爱是表达宿主(例如，植物，诸如芸苔或拟南芥)使用以编码其蛋白质的氨基酸的密码子的统计学分布。密码子偏爱可以以单一密码子相对所有氨基酸的密码子的使用频率计算。或者，密码子偏爱可以以单一密码子用于编码特定氨基酸，相对于所述氨基酸的所有其它密码子(同义密码子)的频率计算。在为delta-9去饱和酶基因的植物表达设计优化的编码区中，应当确定植物优选的主要(“第一选择”)密码子，及优选密码子的第二、第三、第四选择等等(在存在多种选择时)。然后，可以设计新的编码delta-9去饱和酶基因氨基酸序列的DNA序列，其中新的DNA序列与天然DNA序列(编码去饱和酶)不同之处在于取代编码宿主优选性(第一优选性、第二优选性、第三优选性、或第四优选性，等等)密码子以规定氨基酸序列内每个位置处的氨基酸。然后，对新的序列分析限制酶位点，其可以已经通过修饰创建。通过将这些密码子用下一优选性密码子替换来进一步修饰鉴定的推定限制性位点以除去限制性位点。序列中可以影响异源序列的转录或翻译的其它位点是外显子内含子接合(5’或3’)、多聚-A添加信号、和/或RNA聚合酶终止信号。可以进一步分析序列，并将其进行修饰以降低TA或CG双联体的频率。在这些双联体外，具有相同的超过约6个G或C核苷酸的序列区组也可以不利地影响序列的转录或翻译。因此，有利地，通过将第一或第二选择的密码子，等等用选择的下一优选性密码子替换来修饰这些区组。上文所描述的方法使本领域技术人员能够修饰对于特定植物而言外来的基因，使得基因在植物中最佳地表达。所述方法在PCT申请W097/13402中进一步例示。如此，可以使用与一些实施方案的去饱和酶/基因在功能上等同的经优化的合成基因来转化宿主，包括植物。关于生成合成基因的更多指导可以参见例如美国专利5，380，831。一旦在纸上或在计算机芯片中设计出经植物优化的DNA序列，可以在实验室中合成实际的DNA分子以在序列上精确对应于设计的序列。可以将此类合成的DNA分子克隆，并以其它方式操作，完全就像它们源自自然或天然来源那样。D.用于遗传转化植物材料的方法一些实施方案涉及生成包含一种或多种核酸分子的经转化的细胞的方法，所述核酸分子包含与选自下组的序列至少60%相同的核酸序列SEQ IDNO :3, SEQ ID NO :4, SEQID NO:5，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ IDNO:10, SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:15，SEQ IDNO: 16，SEQ ID NO: 17，SEQID NO:44，SEQ ID NO:45，SEQ ID NO:48 和 SEQ ID NO:49。此类核酸分子还可以包含例如非编码调节元件，诸如启动子。也可以将其它序列与非编码调节元件和可转录核酸分子序列一起导入细胞中。这些其它序列可以包含3’转录终止子、3’多聚腺苷酸化信号、其它非翻译序列、转运或靶向序列、选择标志、增强子、和操纵基因。一般地，转化方法包括下列步骤选择合适的宿主细胞，用重组载体转化宿主细胞，并获得经转化的宿主细胞。用于将DNA导入细胞中的技术是本领域技术人员公知的。一般地，这些方法可以分成5类(I)化学方法(Graham和Van der Eb (1973)Virology54(2):536-9;Zatloukal 等(1992)Ann. N. Y. Acad. Sc1. 660:136-53); (2)物理方法，诸如微注射(Capechi (1980) Cel 122 (2) :479-88)、电穿孔(Wong 和 Neumann (1982)Biochim. Biophys. Res. Commun. 107(2):584-7;Fromm 等(1985)Proc. Natl. Acad. Sc1.USA82 (17) : 5824-8;美国专利 5，384，253)、和颗粒加速(Johnston 和 Tang (1994) MethodsCell Biol. 43 (A) : 353-65; Fynan 等(1993) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA90 (24) : 11478-82; (3)病毒载体(Clapp(1993)Clin. Perinatol. 20(1) : 155-68;Lu 等(1993)J.Exp.Med. 178(6):2089-96;Eglitis 和 Anderson(1988)Biotechniques6(7):608-14) ;(4)受体介导的机制(Curiel 等(1992)Hum. Gen. Ther. 3 (2) : 147-54; Wagner 等(1992)Proc. Natl.Acad. Sc1. USA89 (13) :6099-103);和(5)细菌介导的机制，诸如用土壤杆菌。或者，可以通过直接注射植物的生殖器官来将核酸直接导入花粉中。Zhou等(1983)Methods inEnzymologylOl:433;Hess(1987)Intern. Rev. Cytol. 107:367;Luo 等(1988)Plant Mol.Biol. Reporter6:165;Pena等(1987)Nature325:274。其它转化方法包括例如原生质体转化，如美国专利5，508, 184中例示的。也可以将核酸分子注射入未成熟的胚中。Neuhaus等(1987)Theor. Appl. Genet. 75:30。最常使用的用于转化植物细胞的方法是土壤杆菌介导的DNA转移方法(Fraley 等(1983)Proc. Natl. Acad. Sc1. USA80:4803)(如美国专利 5, 824, 877;美国专利5，591，616;美国专利5，981，840;和美国专利6，384，301中例示的)和生物射弹或微粒轰击介导的方法(即，基因枪)(诸如记载于美国专利5，550,318;美国专利5，538,880;美国专利6，160，208;美国专利6，399,861;和美国专利6，403，865)。通常，核转化是期望的，但是在期望特异性转化质体，诸如叶绿体或造粉体的情况中，可以对某些植物物种诸如拟南芥、烟草、马铃薯和芸苔物种利用期望的核酸分子的微粒介导的递送来转化植物质体。经由使用属于土壤杆菌属的遗传工程化土壤细菌实现土壤杆菌介导的转化。几种土壤杆菌物种介导转移称为“T-DNA”的特定DNA，其可以遗传工程化改造为将任何期望的DNA部分携带入许多植物物种中。标记T-DNA介导的发病机制过程的主要事件是诱导毒力基因、和加工并转移TDNA。此过程是许多综述的主题。见例如Ream(1989)Ann. Rev.Phytopathol. 27:583-618;Howard 和 Citovsky(1990)Bioassaysl2:103-8;Kado (1991)Crit. Rev. Plant Sc1. 10:1-32;Zambryski(1992)Annual Rev. Plant Physiol.Plant Mol.Biol. 43:465-90;Gelvin(1993)于Transgenic Plants, Kung和Wu编，Academic Press, SanDiego, CA,第 49 页-第 87 页；Binns 和 Howitz (1994)于 Bacterical Pathogenesisof Plants and Animals, Dang 编，Berlin:Springer Verlag.，第 119-38 页;Hooykaas和 Beijersbergen(1994)Ann. Rev. Phytopathol. 32:157-79;Lessl 和 Lanka(1994)Cell77:321-4;及 Zupan 和 Zambryski(1995)Annual Rev. Phytopathol. 27:583-618。为了对经转化的植物细胞选择或评分(不管转化方法如何)，导入细胞中的DNA可以含有在可再生的植物组织中发挥功能以生成化合物的基因，所述化合物对植物组织赋予对否则有毒性的化合物的抗性。作为选择、筛选、或评分标准物使用的感兴趣的基因包括但不限于￠-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、绿色荧光蛋白(GFP)、萤光素酶、和抗生素或除草剂耐受性基因。抗生素抗性基因的例子包括赋予对青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博来霉素)； 甲氨蝶呤(和甲氧苄啶)；氯霉素；和四环素的抗性的基因。例如，草甘膦(glyphosate)抗性可以由除草剂抗性基因赋予。Della-Cioppa等(1987)Bio/Technology5:579_84。也可以执行其它选择装置，包括例如但不限于对膦丝菌素(phosphinothricin)、双丙氨磷和正向选择机制的耐受性(Joersbro等(1998)Mol.Breed. 4:111-7)，并且认为在本发明的实施方案的范围内。然后，可以容许通过选择或筛选鉴定并在支持再生的合适培养基中培养的经转化的细胞成熟成植物。目前公开的方法可以与任何可转化的植物细胞或组织一起使用。如本文中使用的，可转化的细胞和组织包括但不限于能够进一步增殖以产生植物的那些细胞或组织。本领域技术人员认可许多植物细胞或组织是可转化的，其中在插入外源DNA和适当的培养条件后植物细胞或组织可以形成分化的植物。适合于这些目的的组织可以包括但不限于未成熟的胚、小盾(scutellar)组织、悬浮细胞培养物、未成熟的花序、枝分生组织、节外植体、愈伤组织、下胚轴组织、子叶、根、和叶。自经转化的植物原生质体或外植体再生、发育、和培养植物是本领域中已知的。Weissbach 和 Weissbach(1988)Methods for Plant Molecular Biology,(编)AcademicPress, Inc. , San Diego, CA;Horsch 等(1985) Science227:1229-31。此再生和生长方法通常包括下列步骤选择经转化的细胞，并将那些细胞培养到胚发育的通常阶段到生根的小植物阶段。类似地，再生转基因的胚和种子。在此方法中，一般将转化体在存在选择培养基的情况中培养，所述选择培养基选择成功转化的细胞并诱导植物幼芽(shoot)的再生。Fraley 等(1993)Proc. Natl. Acad. Sc1. USA80:4803。这些幼芽通常在 2 至 4 个月内获得。此后，将所得的转基因生根幼芽在合适的植物生长培养基诸如土壤中种植。可以将幸免于暴露于选择剂的细胞，或已经在筛选测定法中得分为正的细胞在支持植物再生的培养基中培养。然后，可以将幼芽转移至合适的根诱导培养基中，所述根诱导培养基含有选择剂和防止细菌生长的抗生素。许多幼芽会形成根。然后，将这些移植至土壤或其它培养基以容许根的继续发育。一般地，如上文概述的方法会根据采用的特定植物品系而不同，并且因此，方法的细节在本领域技术人员的判断内。再生的转基因植物可以自花传粉以提供纯合转基因植物。或者，可以将自再生的转基因植物获得的花粉与非转基因植物，优选地，农艺学重要的物种的近交系杂交。相反，可以使用来自非转基因植物的花粉来给再生的转基因植物传粉。转基因植物可以将转化的核酸序列传递给其后代。优选地，转基因植物是在转化的核酸序列方面是纯合的，并在有性繁殖后且由于有性繁殖而将所述序列遗传给所有其后代。可以自由转基因植物生成的种子培养后代。然后，可以将这些其它植物自花传粉以生成真正的植物育种系。可以对来自这些植物的后代评估基因表达，等等。可以通过几种常见的方法诸如Western印迹、Northern印迹、免疫沉淀、和ELISA(酶联免疫吸附测定法)检测基因表达。也可以对经转化的植物分析导入的DNA的存在和由本发明的核酸分子和氨基酸分子赋予的表达水平和/或脂肪酸谱。本领域技术人员知道可用于分析经转化的植物的许多方法。例如，用于植物分析的方法包括但不限于Southern印迹或Northern印迹、基于PCR的方法、生物化学测定法、表型筛 选法、田间评估、和免疫诊断测定法。用于特异性转化双子叶植物的方法是本领域技术人员公知的。已经对许多作物，包括但不限于拟南芥属的成员、棉(棉(Gossypium hirsutum))、大豆(大豆(Glycine max))、花生(落花生(Arachis hypogaea))、和芸苔属的成员描述了使用这些方法的转化和植物再生。已经对棉(美国专利5，004，863;美国专利5，159，135;美国专利 5, 518, 908);大豆(美国专利 5, 569, 834;美国专利 5，416，011; McCabe 等(1988)Biotechnology6:923;Christou 等(1988)Plant Physiol. 87:671-4);(美国专利5, 463, 174);花生(Cheng 等(1996)Plant Cell R印 15:653-7;McKently 等(1995)PlantCell Rep. 14:699-703);蕃木瓜；和豌豆(Grant等(1995)Plant Cell Rep. 15:254-8)发表了主要通过使用根癌土壤杆菌转化双子叶植物并获得转基因植物的方法。用于转化单子叶植物的方法也是本领域中公知的。已经对许多作物，包括但不限于大麦(大麦(Hordeum vuIgarae));玉蜀黍(玉蜀黍(Zea mays));燕麦(燕麦(Avenasativa));野茅(野茅(Dactylis glomerata));稻(稻(Oryza sativa),包括印度和日本变种)；高粱(高粱(Sorghum bicolor));甘鹿(甘鹿(Saccharum sp));華状羊茅(華状羊茅(Festuca arundinacea));草地草(turfgrass)物种(例如，匍莖剪股颖(Agrostisstolonifera)、草地早熟禾(Poa pratensis)、维穗纯叶草(Stenotaphrum secundatum))；小麦(小麦(Triticum aestivum));和苜猜(苜猜(Medicago sativa))描述了使用这些方法的转化和植物再生。对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用并修改许多转化方法以对许多感兴趣的目标作物生成稳定的转基因植物。可以选择任何植物在目前公开的方法中使用。依照本发明修饰的优选的植物包括例如但不限于含有种子植物、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、琉璃苣(琉璃苣属(Borago)物种)、芸苔(Canola)(芸苔(Brassica)物种)、蓖麻(蓖麻(Ricinuscommunis))、可可豆(可可(Theobroma cacao))、玉米(玉蜀黍)、棉(棉属(Gossypium)物种)、两节莽属(Crambe)物种、萼距花属(Cuphea)物种、亚麻亚麻物种)、小滨菊属(Lesquerella)和鲸油草(Limnanthes)物种、Linola、旱金莲(旱金莲属(Tropaeolum)物种)、月见草属(Oenothera)物种、橄榄(olive)(木樨榄属(Olea)物种)、棕榈(油棕属(Elaeis)物种)、花生(花生属(Arachis)物种)、油菜籽(rapeseed)、红花(红花属(Carthamus)物种)、大豆(大豆属(Glycine)和野生大豆(Soja)物种)、向日葵(向日葵属(Helianthus)物种)、烟草(烟草属(Nicotiana)物种)、斑鸠菊属(Vernonia)物种、小麦(小麦属(Triticum)物种)、大麦(大麦属(Hordeum)物种)、稻(稻属(Oryza)物种)、燕麦(燕麦属(Avena)物种)、高粱(高粱属(Sorghum)物种)、和黑麦(黑麦属(Secale)物种)或禾本科(Gramineae)的其它成员。对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用并修改许多转化方法以对许多感兴趣的目标作物生成稳定的转基因植物。E.转基因种子在一些实施方案中，转基因种子可以包含delta-9去饱和酶多肽，其包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列SEQ ID NO: 12，SEQ IDN0:13, SEQ ID NO: 14，SEQ IDNO: 50，SEQ ID NO: 51，SEQ ID NO: 52，SEQID NO: 72 和 SEQ ID NO: 73。在这些和其它实施方案中，转基因种子可以包含与 选自下组的序列至少60%相同的核酸序列SEQ ID NO:3, SEQID NO:4，SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，SEQ IDNO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:44，SEQ IDNO:45，SEQ ID NO:48和SEQ IDN0:49。在一些实施方案中，转基因种子可以展现出降低的饱和脂肪酸(例如，棕榈酸脂肪酸和/或硬脂酸脂肪酸)水平。可以自能育转基因植物收获种子，并可以用于培养经转化植物的后代世代，包括包含如上文所列的至少一种核酸序列，和任选地至少一种别的感兴趣的基因或核酸构建体的杂种植物系。提供以下实施例来例示某些具体的特征和/或实施方案。这些实施例不应解释为将本发明限于所描述的具体特征或实施方案。
实施例实施例1 :酰基-Cok delta-9去饱和酶的克隆和在olel缺陷型酵母中的功能性表征Magnaporthe grisea -CoA delta_9 去t包矛口IS白勺克 1 :使用引物自基因组DNA分离Magnaporthe grisea酸基-CoA delta-9去饱和酶基因(MgD9DS)，所述引物基于最初注释为“假设的蛋白质”，并且在核苷酸水平与酿酒酵母酰基-CoA delta-9去饱和酶(即，0LE1)具有55. 4%同一性的发表的NCBI/Broad研究所序列。设计正向和反向引物，长度各为41个碱基对。正向引物MgA9F(SEQ ID NO:1)包括5’端的EcoRI位点。反向引物Mg9AR(SEQ ID NO: 2)含有三个阅读框之每个中的终止密码子和末端XhoI位点。使用Takara EZ Taq PCR试剂盒(Takara Bio Inc.，Otsu, Shiga, Japan)遵循制造商的方案PCR扩增MgD9DS基因。扩增条件是94° C达I分钟，接着是94° C达30秒、60° C达60秒、和于72。C延伸90秒的30个循环。于72。C实施最终的延伸步骤达10分钟。自琼脂糖凝胶切出预期的1，425个碱基对PCR产物，并使用Montage旋转柱按照制造商的推荐(Millipore，Billerica，MA)纯化。将纯化的片段克隆入.pCR:R'2.1 TOPO 克隆载体(Invitrogen, Carlsbad, CA)中。按照供应商条件将TOPO反应转化入化学感受态ToplO大肠杆菌细胞中。将含有推定的克隆的细菌菌落分离。用Macherey-Nagel NucleospinDNA 分离试剂盒(Machery-NageI，Neumann-Neander-Strasse, Diiren, Germany)实施微量质粒制备，并用EcoRI和XhoI限制性酶消化DNA。鉴定含有预期的1，425bp MgD9DS基因片段的阳性克隆。经由测序反应获得核苷酸序列。PCR扩增片段的序列以SEQ ID N0:3列出。序列分析揭示位于MgD9DS基因的5’端中的小的(90bp)内含子。使用剪接重叠延伸(Splice Overlap Extension)PCR除去内含子。将所得的PCR扩增子进行凝胶纯化，
克隆入pCRR2.1「OPO 克隆载体中，并转化入ToplO大肠杆菌细胞中。经由分析来自单
一转化体菌落的纯化的DNA的限制酶消化物来鉴定几个克隆。对这些克隆测序以确认无内含子的MgD9DS克隆的存在。所得的序列以SEQ ID N0:4列出。将具有和没有内含子的MgD9DS基因各自以EcoRI/XhoI片段亚克隆入酵母表达载体中。此酵母表达载体含有构巢曲霉delta-9去饱和酶(AnD9DS)基因，其侧翼有酿酒酵母delta-9去饱和酶启动子和delta-9去饱和酶3’UTR/终止子。将构巢曲霉delta-9去饱和酶基因在EcoRI/XhoI片段上切除，所述EcoRI/XhoI片段用含有MgD9DS基因的片段或含有无内含子的MgD9DS基因的片段替换。将含有MgD9DS基因的两种克隆(一种具有内含子，而一种没有内含子)进行酿酒酵母转化。
`
使用碱-阳离子酵母转化试剂盒(Qbiogene, Montreal, Canada)转化delta-9去饱和酶缺陷型酿酒酵母菌株(0FY093)，其在具有了^^丨/ 80的酵母蛋白胨右旋糖(YPD)培养基上维持。根据在不含Tween '80 (单不饱和脂肪酸补充物)或尿嘧啶的培养基(具有琼脂的Dropout Base及SC-URA)上生长鉴定互补菌株。将互补菌株在选择培养基上单菌落纯化三次。通过delta-9去饱和酶基因的PCR扩增，及对PCR产物的测序进一步确认互补菌株。另外，如下将含有MgD9DS克隆的菌株恢复成脂肪酸和尿嘧啶依赖性，即将菌株在YPD+Tween 80 :培养基上传代至少三次，然后将菌株补到不含Tween 80的D0BASC-URA培养基。含有内含子的MgD9DS编码序列的表达未获成功，指示酵母机器没有剪接内含子。通过FAME分析进一步表征含有无内含子的MgD9DS编码序列的酵母菌株的底物特异性。颖枯小球腔菌酰基-CoA delta-9去饱和酶的克隆通过使用BlastN搜索自颖枯小球腔菌EST集合将两种颖枯小球腔菌EST序列(分别为1，246和429个碱基对)鉴定为与酿酒酵母酰基-Cok delta-9去饱和酶(0LE1)共享高水平序列同一性(分别为54. 0%和54. 2%)。在比对时，这些序列彼此是64. 6%相同的，提示两种独特的颖枯小球腔菌酰基-CoA delta-9去饱和酶的存在。通过用1，246bp基因探针筛选颖枯小球腔菌cDNA文库分离LnD9DS-l基因(SEQ ID N0:5)。获得此基因的序列，并分离编码序列。通过首先用429bp EST序列BLAST搜索发表的Broad研究所颖枯小球腔菌基因组序列来分离LnD9DS-2基因的整个序列。此搜索将超重叠群(Supercontig) Lnl. 4鉴定为含有与429bp片段具有100%同源性的基因，该基因注释为编码“假设的蛋白质”。接着，使用基于Lnl. 4超重叠群序列的PCR引物自颖枯小球腔菌cDNA文库克隆LnD9DS_2基因。使用的引物序列是Lnd9FAD2F(SEQ IDNO:6)和Lnd9FAD2R(SEQ ID NO: 7) 正向引物设计为具有5’ BamHI位点，而反向引物含有三个阅读框中的终止密码子和末端NcOI位点。将颖枯小球腔菌cDNA文库的等分试样以1/10稀释以为PCR反应提供400ng模板DNA。使用Takara EZ Taq PCR试剂盒遵循推荐的扩增条件实施PCR扩增，所述推荐的扩增条件为94° C达I分钟，接着是94° C达30秒、60° C达60秒、和于72° C延伸90秒的30个循环。于72° C实施最终的延伸步骤达10分钟。自琼脂糖凝胶切出预期的1，370个碱基对产物，并使用Montage旋转柱按照制造商的推荐纯化。将纯化的片段克隆入pCRR2.1 TOPOr克隆载体中。依照制造商的推荐方案将连接反应转化入化学感受态ToplO大肠杆菌细胞中。将含有推定克隆的菌落分离。用Macherey-Nagel Nucleospin柱实施微量质粒制备，并用BamHI和NcoI限制酶消化DNA。将推定的LnD9DS_2克隆鉴定并测序。测序后，通过 与“假定的蛋白质”序列比较确认LnD9DS-2(SEQ ID N0:8)克隆。鉴定LnD9DS-2序列中的保守变化。通过在碱基位置271处用腺嘌呤替换胸苷将密码子IGC (半胱氨酸)改变为AGC(丝氨酸)，该密码子翻译成发表序列的氨基酸89。这是保守的变化，并且发现半胱氨酸不是多种丝状真菌间高度保守的氨基酸，因此未尝试改正。将分别为SEQ ID勵:5和8的1^0905-1和1^0905-2基因克隆入酵母表达载体中。通过限制酶分析和DNA测序确认含有LnD9DS-l和LnD9DS_2编码序列之任一的克隆。使用来自Qbiogene的碱-阳离子酵母转化试剂盒转化delta-9去饱和酶缺陷型酿酒酵母菌株(0FY093)，其在具有Tween 80的Yro培养基上维持。根据在不含Tween 80 (单不饱和脂肪酸补充物)或尿嘧啶的培养基(DOBAsc-Ura)上生长鉴定互补菌株。将互补菌株在选择培养基上单菌落纯化三次。通过delta-9去饱和酶基因的PCR扩增，及对PCR产物的测序进一步确认互补菌株。另外，如下将含有LnD9DS-2克隆的菌株恢复成脂肪酸和尿嘧啶依赖性，即将菌株在YPD+Tween 80k'培养基上传代至少三次，然后将菌株补到不含Tween k 80的DOBA SC-URA培养基。通过FAME分析进一步表征含有LnD9DS_l或LnD9DS_2编码序列之任一的酵母菌株的底物特异性。HzDQDS基因的克隆和对Delta-9去饱和酶缺陷型酿酒酵母的转化自DASPIC089(下文描述)在BamHI/XhoI片段上切出植物优化的编码美洲棉铃虫酸基 _CoA delta-9 去饱和酶(HzD9DS)(在 Rosenfield 等(2001) Insect Biochem. Mol.Biol. 31 (10) :949-64中鉴定为HzP⑶S2)的合成基因，并使用Montage旋转柱进行凝胶纯化。将此片段连接入先前描述的酵母表达载体的相应限制酶位点中，并使用标准的分子生物学技术和供应商的方案(Invitrogen, Carlsbad, CA)转化入大肠杆菌菌株DH5 a中。在限制性 分析和DNA测序后，选择含有HzD9DS基因的克隆来转化入delta-9去饱和酶缺陷型酿酒酵母菌株0FY093中。使用来自Qbiogene的碱-阳离子酵母转化试剂盒转化0FY093菌株，其在具有Tween 80的YPD培养基上维持。根据在不含Tweenf 80 (脂肪酸补充物)和尿嘧啶的培养基(D0BASC-URA)上的生长鉴定互补菌株。将推定的互补菌株在选择培养基上单菌落纯化三次。如下进一步确认互补菌株i)使用Qbiogene酵母质粒纯化试剂盒提取质粒DNA，接着使用HzD9DS基因特异性引物进行PCR扩增；ii)对HzD9DS基因特异性PCR产物测序；及iii)通过将菌株在YPD+Tween 8(f.培养基上传代至少三次，然后将菌株补到不含Tweerv 80的DOBA SC-URA培养基将菌株恢复成脂肪酸和URA-3依赖性。通过FAME分析进一步表征一种确认的互补HzD9DS酵母菌株的底物特异性。分析OLEl缺陷型酵母菌株中表汰的LnD9DS-l, LnD9DS~2. MgD9DS和HzD9DS如上文所列的，自植物病原性真菌Magnaporthe grisea(MgD9DS)和颖枯小球腔菌(LnD9DS-l和LnD9DS-2)克隆三种例示性酰基-CoA delta-9去饱和酶(D9DS)基因。三种基因及其编码的蛋白质先前尚未表征。酰基-CoA delta-9去饱和酶催化辅酶A的饱和14-、16-、和18-碳脂肪酰基硫酯的碳原子9和10间的顺式双键形成，导致分别生成肉豆蘧脑酸(14:1)、棕榈油酸(16:1)、或油酸(18:1)。通过消除相同生物学背景中不同真菌酰基-CoAdelta-9去饱和酶基因来消除涉及生物体特异性生物学的效应。因此，使用棕榈酰基-硬脂酰基CoA去饱和酶(OLEl)缺陷型0FY093酵母菌株内的内源olel基因启动子驱动真菌酰基-CoA delta-9去饱和酶基因的表达。如此，对此系统中脂肪酸底物特异性观察到的差异可归因于互补酿酒酵母菌株中表达的特定真菌delta-9去饱和酶。将互补0YF093菌株中表达的MgD9DS、LnD9DS_l和LnD9DS_2CoA去饱和酶的底物特异性表征，并与W0/1999/050430中描述的与AnD9DS(sdeA)互补的0FY093比较。使用上文所描述的方案将含有AnD9DS基因(其表达由olel基因启动子驱动)的酵母表达构建体转化入酿酒酵母0FY093菌株中并表达。

将互补酿酒酵母菌株在没有脂肪酸补充的极限培养基中于30° C培养24小时。对清洗过的且冻干的细胞团粒实施定量FAME分析。表I中显示了此分析的结果。LnD9DS-2促进C14:1和C16:1的形成，而LnD9DS-l和MgD9DS对C18:0具有偏爱，如根据酵母脂肪酸组成分析中C16:1/18:1脂肪酸的比率指示的。
权利要求
1.一种分离的核酸分子，其编码包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列的酶 delta-9 去饱和酶SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ IDN0:14、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 72 JPSEQ ID NO: 73。
2.权利要求1的核酸分子，其中所述核酸分子包含与选自下组的序列至少60%相同的核苷酸序列SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID N0:44JPSEQ ID N0:45。
3.权利要求1的核酸分子，其进一步包含基因调节元件。
4.权利要求3的核酸分子，其中所述基因调节元件选自下组酿酒酵母delta-9去饱和酶启动子、delta-9去饱和酶3’ UTR/终止子、olel基因启动子、菜豆蛋白启动子、菜豆 (Phaseolus vulgaris)菜豆蛋白5’非翻译区、菜豆菜豆蛋白3’非翻译区、菜豆菜豆蛋白基质附着区、根癌土壤杆菌0RF23 3’非翻译区、木薯叶脉花叶病毒启动子、根癌土壤杆菌 ORFl 3’非翻译区、烟草(Nicotiana tabacum) RB7基质附着区、Overdrive、T链边界序列、 LfKCS3 启动子、FAEl 启动子、SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID N0:43、 Myc标签、和血凝素标签。
5.一种分离的酶delta-9去饱和酶，其包含与选自下组的序列至少80%相同的氨基酸序列SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ IDNO:50, SEQ ID NO:51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 72 JPSEQ ID NO: 73。
6.一种嵌合delta-9去饱和酶多肽，其包含SEQ ID NO:72和/或SEQ IDN0:73，其中所述多肽进一步包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID N0:77和SEQ ID N0:78。
7.一种用于降低细胞中饱和脂肪酸量的方法，该方法包括用权利要求1的核酸分子转化细胞，使得所述细胞中的饱和脂肪酸量降低。
8.依照权利要求7的方法，其中所述细胞是酵母细胞。
9.依照权利要求7的方法，其中所述细胞是植物细胞。
10.依照权利要求9的方法，包括用权利要求1的超过一种核酸分子转化所述植物细胞。
11.依照权利要求9的方法，其中转化所述植物细胞将用于降低所述植物细胞中 16:0-ACP水平的手段导入所述植物细胞中。
12.依照权利要求11的方法，其中所述用于降低植物细胞中16:0-ACP水平的手段 (mean)是质体外去饱和酶。
13.权利要求12的方法，其中所述质体外去饱和酶是选自下组的去饱和酶LnD9DS去饱和酶、AnD9DS去饱和酶、HzD9DS去饱和酶、和MgD9DS去饱和酶。
14.依照权利要求9的方法，其中所述植物细胞选自自下组选择的属拟南芥属(Arabidopsis)、琉璃苣属(Borago)、芸苔(Canola)、蓖麻属(Ricinus)、可可树属 (Theobroma)、玉蜀黍属(Zea)、棉属(Gossypium)、两节莽属(Crambe)、萼距花属(Cuphea)、 亚麻属(Linum)、小滨菊属(Lesquerella)、鲸油草(Limnanthes)、Linola、旱金莲属 (Tropaeolum)、月见草属(Oenothera)、木樨榄属(Olea)、油棕属(Elaeis)、落花生属 (Arachis)、油菜籽(rapeseed)、红花属(Carthamus)、大豆属(Glycine)、野生大豆(Soja)、 向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、斑鸠菊属(Vernonia)、小麦属(Triticum)、大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、黑麦属(Secale)JP 禾本科(Gramineae)的其它成员。
15.—种含油种子植物，其包含权利要求1的核酸序列。
16.一种植物种子，其表达选自下组的质体外去饱和酶SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51JPSEQ IDNO: 52
17.—种转基因油菜(Brassica napus)系的种子，所述种子相对于所述转基因油菜系的等基因型式具有降低的16:0水平。
18.一种用于创建遗传工程化植物的方法，所述遗传工程化植物与野生型植物相比在所述植物中包含降低的饱和脂肪酸量，所述方法包括用权利要求1的核酸分子转化植物材料；并培养经转化的植物材料以获得植物。
19.依照权利要求18的方法，其中所述植物选自自下组选择的属拟南芥属 (Arabidopsis)、琉璃苣属(Borago)、芸苔(Canola)、蓖麻属(Ricinus)、可可树属 (Theobroma)、玉蜀黍属(Zea)、棉属(Gossypium)、两节莽属(Crambe)、萼距花属(Cuphea)、 亚麻属(Linum)、小滨菊属(Lesquerella)、鲸油草属(Limnanthes)、Linola、旱金莲属 (Tropaeolum)、月见草属(Oenothera)、木樨榄属(Olea)、油棕属(Elaeis)、落花生属 (Arachis)、油菜籽(rapeseed)、红花属(Carthamus)、大豆属(Glycine)、野生大豆(Soja)、 向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、斑鸠菊属(Vernonia)、小麦属(Triticum)、 大麦属(Hordeum)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、黑麦属(Secale)JP 禾本科(Gramineae)的其它成员。
20.通过权利要求18的方法获得的植物。
21.自权利要求20的植物获得的植物材料。
22.权利要求21的植物材料，其中所述植物材料是种子。
全文摘要
组合物和方法包括在植物细胞中遗传编码和表达新颖的delta-9去饱和酶。在一些实施方案中，在植物细胞中表达核酸以利用delta-9去饱和酶酶活性，使得植物种子中饱和脂肪酸的百分比组成降低，而且有伴随的ω-7脂肪酸增加的方法。在其它实施方案中，氨基酸序列具有delta-9去饱和酶活性。为了增加全植物、植物种子、和植物材料，例如种子中不常见脂肪酸的量,方法可以牵涉在植物细胞、植物材料、和全植物中表达delta-9去饱和酶。
文档编号A01H5/10GK103068986SQ201180040626
公开日2013年4月24日 申请日期2011年6月24日 优先权日2010年6月24日
发明者A.O.默洛, D.J.加科特, M.A.汤普森, T.A.沃尔什, S.贝文 申请人:陶氏益农公司