专利名称：促进甜叶菊生长的组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种促进甜叶菊生长的组合物及其制备方法。
背景技术：
甜叶菊(Stevia rebaudianum Bertoni)是一种原产于巴拉圭的菊科宿根多年生草本植物，其叶片中提取的甜菊糖是天然的强力甜味剂，其甜度为蔗糖的150-300倍。经过大量而长期的毒理及药理学研究，已经证明甜菊糖在体内没有潜在性、遗传性等危害，其安全性已经得到了 FAO和WHO等国际组织的认可，2004年世界联合卫生组织正式通过允许甜菊糖在世界范围内通用的决议，伴随着其安全性被世界认可，其经济效益进一步加大。近年来，人们对于健康饮食愈发重视，作为甜味剂，甜菊糖因其稳定性强，热量低(热量只相当于蔗糖的1/300)，无毒、无副作用等特点，成为人们尤其是肥胖病、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿病患者等青睐的食品，具有广泛而深远的发展前景。我国从二十世纪七十年代开始引进甜叶菊进行种植研究，80年代初向全国各地推广种植，生产的甜叶菊干叶主要出口日本。1985年卫生部批准甜菊糖在饮料、糕点和糖果中使用，而且没有对其用量进行限制，进一步促进了甜菊糖产业的发展。1996年我国甜菊糖产销量突破了千吨大关。目前，我国已成为世界上最大的甜菊糖生产国和出口国之一。甜叶菊作为一种多年生的经济作物，在我国具有广泛的种植面积，其带来的经济效益是显而易见的。目前，甜叶菊叶片是甜菊糖生产过程中的主要成本来源，近年来我国引进甜叶菊种植，虽然生产技术得到了长足的进步，但由于缺乏对甜叶菊科学的技术管理，对于甜叶菊生理、代谢特性的研究不够明晰，同时市场上罕有甜叶菊专用的生长促进肥料，广大菊农一般都是依赖使用普通的化学肥料和农药。大量化学肥料的使用不仅对环境产生严重的污染，也不利于甜叶菊叶片品质的提升。近年来种植的甜叶菊，每亩甜叶菊干叶产量只有 250-350公斤，与国外产量相比具有很大的差距。事实证明甜叶菊种植大量使用化学肥料， 不但达不到可持续、无污染、高质量、高产量、高增效的目的，反而会造成甜叶菊产品的污染和安全问题，将直接影响我国甜叶菊种植业产业化的发展。专用生长调节剂的开发与研究是近年来来农业发展的一个热门话题，过量的施用化学肥料，对可持续发展、维持生态平衡和环境保护不利，而生长调节剂有作用时效长、无毒副作用、不污染环境、节约能源、成本低廉等特点，是现代农业可持续发展的一个重要突破口，受到国内外的普遍关注。将适当浓度的生长调节剂直接喷施在作物的叶片表面，通过叶片吸收，将养分运输到植物体内各部位，其突出特点是针对性强，吸收转运快，可以快速补充植物所需物质， 充分发挥调节效果；同时可避免土壤对某些物质的固定化作用，提高调节剂的利用率；且施用量少，增产改质效果明显，具有显著的经济效益。而目前对于甜叶菊产业，市场上还未有统一的、专用的生长调节剂。
芽孢杆菌(Bacillus sp. ) Y-25CGMCC 4092分离自秸秆堆肥，为木质素降解菌，具有液化褐煤的能力。该菌种保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCCJia 北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)， 保藏号CGMCC No. 4092，保存时间2010年08月18日。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种促进甜叶菊生长的组合物。本发明提供的组合物，由发酵产物、磷酸二氢钾、磷酸二铵和微量元素复合剂组成；上述发酵产物按照如下方法制备将芽孢杆菌(Bacillus sp. ) Y-25CGMCC 4092、 褐煤、麦麸、秸秆和水混勻，发酵，收集产物，即得到发酵产物。上述组合物中的微量元素复合剂为将如下质量份数比的物质混勻得到10份硫酸锌、5份-8份硫酸亚铁、2份-5份硫酸锰、0. 5份-2份钼酸铵和5份-10份硼酸钠。上述的组合物中，所述发酵产物、所述磷酸二氢钾、所述磷酸二铵和所述微量元素复合剂的质量比为75-85 5-10 5-10 5 ；上述组合物中，所述发酵产物、所述磷酸二氢钾、所述磷酸二铵和所述微量元素复合剂的质量比具体为75、80或85 5、8或10 5、8或10 5 ；上述组合物中的所述微量元素复合剂具体为将如下质量份数比的物质混勻得到 10份硫酸锌、5、6. 5或8份硫酸亚铁、2、2. 5或5份硫酸锰、0. 5、1或2份钼酸铵、5、8. 5或 10份硼酸钠；在上述发酵产物的制备方法中，所述芽孢杆菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、 所述褐煤、所述麦麸、所述秸秆和所述水的配比为IX IO12Cfu :9kg-12kg 4kg-6kg 4kg_6 kg 5kg-8kg ；在上述发酵产物的制备方法中，采用的发酵温度为观！，发酵的时间为7天-15 天，发酵为好氧发酵。在上述发酵产物的制备方法中，在所述发酵的步骤后还包括将所述产物依次进行稀释、离心收集上清液和干燥所述上清液得到发酵产物的步骤；上述稀释为将所述产物用水稀释，所述产物与所述水的体积比为1 10;上述离心的转速为5000rpm，所述离心半径为11. 5cm,所述离心的时间为 10min-15mino 上述干燥所述上清液为自然风干。在上述发酵产物的制备方法中，所述褐煤的有机质含量为70% -85% (质量百分含量)、腐植酸含量为60%-75% (质量百分含量)；上述促进甜叶菊生长为提高甜叶菊叶片的产量、提高甜菊糖苷含量、提高甜菊糖A 苷含量和/或降低甜菊糖C苷含量。本发明的另一个目的是提供上述的组合物的制备方法。本发明提供的制备方法，包括如下步骤将上述组合物中的所述发酵产物、所述磷酸二氢钾、所述磷酸二铵和所述微量元素复合剂按照所述质量比混勻，得到组合物。本发明的第三个目的是提供一种促进甜叶菊生长的产品。
本发明提供的产品，按照包括如下步骤的方法制备将上述组合物与水按照配比为Ikg 1000L-2000L混勻，得到产品;上述促进甜叶菊生长具体为提高甜叶菊叶片的产量、提高甜菊糖苷含量、提高甜菊糖A苷含量和/或降低甜菊糖C苷含量。本发明的第三个目的是提供一种上述产品的使用方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将上述的产品喷施甜叶菊叶片；所述喷施的量具体为50L-100L/亩。上述的组合物或上述的产品在促进甜叶菊生长中的应用也是本发明保护的范围；在上述的应用中，上述促进甜叶菊生长为提高甜叶菊叶片的产量、提高甜菊糖苷含量、提高甜菊糖A苷含量和/或降低甜菊糖C苷含量。本发明的实验证明，本发明制备了一种促进甜叶菊生长的组合物即为甜叶菊专用生物生长调节剂，通过适宜的施用方法，具有以下有益效果1、可以有效地改善甜叶菊的微生态环境，调控微生态平衡，改善养分供应状况其中发酵产物等有机小分子物质可直接通过甜叶菊叶片被吸收利用，作为调节剂、营养物质发挥其刺激植物生长、增强机体活力和代谢能力，提高植物的抗病力和抗逆能力的功能；其中的无机盐类等物质在提供氮、磷、钾等元素的同时，还可以维持细胞的完整性，保持膜的孔径和通透性，能防止细胞内的阳离子外渗，有利于磷、钾等元素的吸收；其中的微量元素则可以保障甜叶菊生长所必需的元素供应，为甜叶菊叶片中糖类的积累奠定基础，使其更加充分的利用营养物质达到增产的目的。2、与传统的调节剂及尿素等化学肥料相比，具有生产简便，成本低廉，水溶性好， 利用率高，调节效果明显等特点。3、与传统的尿素等化学肥料相比，具有养分全面的特点，本发明的产品不但可以良好高效的为甜叶菊提供磷、钾、钙等无机营养，还可以提供发酵产物等有机营养及调节剂，不仅为植株提供更全面的营养物质，使糖分和干物质积累增多，还可起到抗旱、抗病、促生、调理防病的作用。4、与传统的调节剂及尿素等化学肥料相比，本发明的产品安全可靠，无毒副作用， 利用率高，对甜叶菊作物、周围生态环境没有污染，有利于甜叶菊种植的可持续发展策略。5、按照本发明提供的使用方法喷施，可以显著的提高甜叶菊叶片产量及含糖量， 经过田间试验证明，施用本发明产品得甜叶菊，其叶片产量增加可达22%，甜菊糖苷含量提高可达90%以上，甜菊糖A苷含量提高可达80%以上，甜菊糖C苷含量降低达30%，叶片中口感优良的甜菊糖苷、甜菊糖A苷含量增加，口感苦涩的甜菊糖C苷含量降低，使得叶片整体品质得到了显著的提高，也为甜菊糖产业的进一步高速、高效的发展提供了技术支持。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、甜叶菊专用生长调节剂的制备方法一
1、发酵产物的制备1)培养将芽孢杆菌(Bacillus sp. ) Y-25CGMCC 4092按常规方法经过接种到种子罐培养 12小时，再接种到发酵罐37°C培养(培养基为LB培养基，配方为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/ L，氯化钠10g/L。)M小时后得到的培养液，菌浓度为2X108cfu/mL，备用；2)发酵按比例将褐煤(褐煤的有机质含量为78% (质量百分含量)、腐植酸含量为67% (质量百分含量)，来源于内蒙古自治区霍林河地区)、麦麸、秸秆、水加入发酵罐内，同时再将上述制备的芽孢杆菌培养液接入并充分混勻，在温度下好氧发酵15天，得到产物；上述发酵中，芽孢杆菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、褐煤、麦麸、秸秆和水的配比为 IXlO12Cfu 9kg 4kg 4kg 5kg。按产物水为1 10的比例将产物溶解稀释，收集溶解液；将溶解液5000rpm(离心半径为11. 5cm)离心IOmin后，上清液经过自然风干得到粉末状物质即为发酵产物。2、微量元素复合剂的制备取硫酸锌10kg、硫酸亚铁6. ^g、硫酸锰2. ^g、钼酸铵1kg、硼酸钠8. 5kg充分搅拌混合均勻，得到微量元素复合剂1。3、甜叶菊专用生物生长调节剂的制备取上述步骤1得到的发酵产物、磷酸二氢钾、磷酸二铵、步骤2得到的微量元素复合剂1按照质量份数比为75 :5:5: 5充分混合，得到甜叶菊专用生长调节剂(组合物)1。方法二1、发酵产物的制备与方法一基本相同，不同的是所述芽孢杆菌(Bacillus sp. ) Y-25CGMCC 4092、所述褐煤、所述麦麸、所述秸秆和所述水的配比为IXlO12Cfu :10kg 5kg 5kg 6kg;发酵的时间为10天，得到发酵产物；2、微量元素复合剂的制备取硫酸锌10kg、硫酸亚铁^g、硫酸锰^g、钼酸铵0. ^g、硼酸钠5kg充分搅拌混合均勻，得到微量元素复合剂2。3、甜叶菊专用生物生长调节剂的制备取上述步骤1得到的发酵产物、磷酸二氢钾、磷酸二铵、步骤2得到的微量元素复合剂2按照质量份数比为85 10 10 5充分混合，得到甜叶菊专用生长调节剂(组合物)2 ；方法三1、发酵产物的制备与方法一基本相同，不同的是所述芽孢杆菌(Bacillus sp. ) Y-25CGMCC 4092、所述褐煤、所述麦麸、所述秸秆和所述水的配比为IXlO12Cfu :12kg 6kg 6kg 8kg;发酵的时间为7天，得到发酵产物；2、微量元素复合剂的制备取硫酸锌10kg、硫酸亚铁^g、硫酸锰^g、钼酸铵^g、硼酸钠IOkg充分搅拌混合均勻，得到微量元素复合剂3。
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3、甜叶菊专用生物生长调节剂的制备取上述步骤1得到的发酵产物、磷酸二氢钾、磷酸二铵、步骤2得到的微量元素复合剂3按照质量份数比为80 :8:8: 5充分混合，得到甜叶菊专用生长调节剂(组合物)3。实施例2、甜叶菊专用生长调节剂的应用一、生长调节剂1的施用称取Ikg由实施例1得到的甜叶菊专用生长调节剂1，溶于1000L清水中，充分搅拌混合均勻，得到叶面肥稀释液，平均每亩甜叶菊专用生物生长调节剂稀释液用量为30L。在甜叶菊(Stevia rebaudiana Bertoni，来源于沈阳益华生态园发展有限公司) 移栽至大田约一个月时，每7天喷施1次，连续喷施2次；在甜叶菊移栽至大田约两个月时， 每7天喷施1次，连续喷施2次；在甜叶菊开花前约十五天时，每7天喷施1次，连续喷施2 次；喷施时主要喷洒于甜叶菊中、上部分叶片，以喷洒于叶片背面为主要方法；以不进行喷施甜叶菊专用生长调节剂的处理作为对照组。甜叶菊种植约3个月后检测甜叶菊的叶片中积累的糖类含量，具体检测方法如下叶片产量测定甜叶菊叶片自然风干后的质量，计算出单位面积的产量。甜叶菊叶片中糖苷的提取使用粉碎机将甜叶菊叶片粉碎，称取0. 25g粉碎后的叶片，与25ml的70%乙醇充分混勻，于70°C水浴摇床中震荡30min，转速为150rpm，取上述液体经0. 22 μ m有机滤膜过滤，收集滤液即为提取物，得到可用于HPLC检测的样品。将上述提取物采用高效液相色谱法(HPLC)测定甜叶菊叶片中的甜菊糖苷、甜菊糖A苷和甜菊糖C苷含量，HPLC检测方法为高效液相色谱仪为岛津公司LC-15C，色谱柱为菲罗门Lima氨基柱，柱温为25°C，流动相为乙腈-水(75 25V/V)，流速为lml/min，进样量为20tl，检测器为紫外检测器。以甜菊糖苷(纯度97%)、甜菊糖A苷(纯度98%)、甜菊糖C苷(纯度95%)为标准品，均购自沈阳益华生态园发展有限公司。标准品甜菊糖苷、标准品甜菊糖A苷和标准品甜菊糖C苷的保留时间分别为 5. 6min、7. 0min、6. Omin0结果如下实验组和对照组均得到保留时间分别为5. 6min、7. Omin,6. Omin的
峰，说明均有甜菊糖苷、甜菊糖A苷和甜菊糖C苷。实验组的叶片产量、甜菊糖苷含量、甜菊糖C苷含量、甜菊糖A苷含量分别为 216. 28kg/亩、3. 47%U. 69%,21. 65% ；对照组的叶片产量、甜菊糖苷含量、甜菊糖C苷含量、甜菊糖A苷含量分别为 194. 15kg/亩、2. 28% 2. 11% 13. 23% ；喷施过甜叶菊专用生长调节剂的实验组与对照组相比，叶片产量(是指叶片的干重提高了)提高了 11. 4 %，甜菊糖苷含量提高53 %，甜菊糖A苷含量提高达64 %，甜菊糖C 苷含量降低达20%，说明，叶片中积累的糖类质量得到了显著的提升。二、生长调节剂2的应用称取Ikg由实施例1得到的甜叶菊专用生长调节剂2，溶于1000L清水中，充分搅拌混合均勻，得到叶面肥稀释液，平均每亩甜叶菊专用生物生长调节剂稀释液用量为100L。在甜叶菊移栽至大田约一个月时，每7天喷施1次，连续喷施2次；在甜叶菊移栽至大田约两个月时，每7天喷施1次，连续喷施2次；在甜叶菊开花前约十五天时，每7天喷施1次，连续喷施2次；喷施时主要喷洒于甜叶菊中、上部分叶片，以喷洒于叶片背面为主要方法；以不进行喷施甜叶菊专用生长调节剂的处理作为对照组。甜叶菊种植约3个月后检测甜叶菊的叶片中积累的糖类质量检测方法同上， 结果如下实验组的叶片产量、甜菊糖苷含量、甜菊糖C苷含量、甜菊糖A苷含量分别为 222. 50kg/亩、3. 80%U. 54%,22. 57% ；对照组的叶片产量、甜菊糖苷含量、甜菊糖C苷含量、甜菊糖A苷含量分别为 194. 15kg/亩、2. 28% 2. 11% 13. 23% ；喷施过甜叶菊专用生长调节剂的实验组与对照组相比，叶片产量提高了 14. 6%， 甜菊糖苷含量提高67 %，甜菊糖A苷含量提高达71%，甜菊糖C苷含量降低达27 %，叶片中积累的糖类质量得到了显著的提升。三、生长调节剂3的应用称取Ikg由实施例1得到的甜叶菊专用生长调节剂3，溶于2000L清水中，充分搅拌混合均勻，得到叶面肥稀释液，平均每亩甜叶菊专用生物生长调节剂稀释液用量为50L。在甜叶菊移栽至大田约一个月时，每7天喷施1次，连续喷施2次；在甜叶菊移栽至大田约两个月时，每7天喷施1次，连续喷施2次；在甜叶菊开花前约十五天时，每7天喷施1次，连续喷施2次；喷施时主要喷洒于甜叶菊中、上部分叶片，以喷洒于叶片背面为主要方法；以不进行喷施甜叶菊专用生长调节剂的处理作为对照组。甜叶菊种植约3个月后检测甜叶菊的叶片中积累的糖类质量。检测方法同上，结果如下实验组的叶片产量、甜菊糖苷含量、甜菊糖C苷含量、甜菊糖 A 苷含量分别为 230. 46kg/亩、4. 06%U.46%,22. 89% ；对照组的叶片产量、甜菊糖苷含量、甜菊糖C苷含量、甜菊糖A苷含量分别为 194. 15kg/亩、2. 28% 2. 11% 13. 23% ；喷施过甜叶菊专用生长调节剂的实验组与对照组相比，叶片产量提高了 18. 7%， 甜菊糖苷含量提高78 %，甜菊糖A苷含量提高达73 %，甜菊糖C苷含量降低达31 %，叶片中积累的糖类质量得到了显著的提升。四、生长调节剂1的施用称取Ikg由实施例1得到的甜叶菊专用生长调节剂3，溶于2000L清水中，充分搅拌混合均勻，得到叶面肥稀释液，平均每亩甜叶菊专用生物生长调节剂稀释液用量为100L。在甜叶菊移栽至大田约一个月时，每7天喷施1次，连续喷施2次；在甜叶菊移栽至大田约两个月时，每7天喷施1次，连续喷施2次；在甜叶菊开花前约十五天时，每7天喷施1次，连续喷施2次；喷施时主要喷洒于甜叶菊中、上部分叶片，以喷洒于叶片背面为主要方法；以不进行喷施甜叶菊专用生长调节剂的处理作为对照组。甜叶菊种植约3个月后检测甜叶菊的叶片中积累的糖类质量。检测方法同上，结果如下实验组的叶片产量、甜菊糖苷含量、甜菊糖C苷含量、甜菊糖 A 苷含量分别为 238. 22kg/亩、4. 10%U. 29%,24. 08% ；
对照组的叶片产量、甜菊糖苷含量、甜菊糖C苷含量、甜菊糖A苷含量分别为 194. 15kg/亩、2. 28% 2. 11% 13. 23% ；喷施过甜叶菊专用生长调节剂的实验组与对照组相比，叶片产量提高了 22.7%， 甜菊糖苷含量提高94 %，甜菊糖A苷含量提高达82 %，甜菊糖C苷含量降低达39 %，叶片中积累的糖类质量得到了显著的提升。
权利要求
1.一种促进甜叶菊生长的组合物，由发酵产物、磷酸二氢钾、磷酸二铵和微量元素复合剂组成；所述发酵产物按照如下方法制备将芽孢杆菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、褐煤、 麦麸、秸秆和水混勻，发酵，收集产物，即得到发酵产物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述微量元素复合剂为将如下质量份数比的物质混勻得到10份硫酸锌、5份-8份硫酸亚铁、2份-5份硫酸锰、0. 5份-2份钼酸铵和5份-10份硼酸钠。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于所述发酵产物、所述磷酸二氢钾、所述磷酸二铵和所述微量元素复合剂的质量比为 75-85 5-10 5-10 5 ；所述发酵产物、所述磷酸二氢钾、所述磷酸二铵和所述微量元素复合剂的质量比具体为 75、80 或 85 5、8 或 10 5、8 或 10 5。
4.根据权利要求1-3任一所述的组合物，其特征在于所述芽孢杆菌(Bacillus sp. )Y-25CGMCC 4092、所述褐煤、所述麦麸、所述秸秆和所述水的配比为 IXlO12Cfu 9kg-12kg 4kg_6kg 4kg_6kg 5kg_8kg ；所述发酵的温度为^°C，所述发酵的时间为7天-15天；所述微量元素复合剂为将如下质量份数比的物质混勻得到10份硫酸锌、5、6. 5或8份硫酸亚铁、2、2. 5或5份硫酸锰、0. 5、1或2份钼酸铵、5、8. 5或10份硼酸钠。
5.根据权利要求1-4任一所述的组合物，其特征在于所述发酵产物的制备方法中，在所述发酵的步骤后还包括将所述产物依次进行稀释、 离心收集上清液和干燥所述上清液得到发酵产物的步骤；所述离心的转速为5000rpm，所述离心半径为11. 5cm，所述离心的时间为10-15min。
6.根据权利要求1-5任一所述的组合物，其特征在于所述促进甜叶菊生长为提高甜叶菊叶片的产量、提高甜菊糖苷含量、提高甜菊糖A苷含量和/或降低甜菊糖C苷含量。
7.权利要求1-6任一所述的组合物的制备方法，包括如下步骤将所述权利要求1-6 任一所述的组合物中的所述发酵产物、所述磷酸二氢钾、所述磷酸二铵和所述微量元素复合剂按照所述质量比混勻，得到组合物。
8.一种促进甜叶菊生长的产品，按照包括如下步骤的方法制备将权利要求1-6中任一所述组合物与水按照配比为Ikg 1000L-2000L混勻，得到产品；所述促进甜叶菊生长具体为提高甜叶菊叶片的产量、提高甜菊糖苷含量、提高甜菊糖A 苷含量和/或降低甜菊糖C苷含量。
9.一种权利要求8所述产品的使用方法，包括如下步骤将权利要求8所述的产品喷施甜叶菊叶片；所述喷施的量具体为50L-100L/亩。
10.权利要求1-6中任一所述的组合物或权利要求8所述的产品在促进甜叶菊生长中的应用；所述促进甜叶菊生长具体为提高甜叶菊叶片的产量、提高甜菊糖苷含量、提高甜菊糖A 苷含量和/或降低甜菊糖C苷含量。
全文摘要
本发明公开了一种促进甜叶菊生长的组合物及其制备方法。本发明提供本发明提供的组合物，由发酵产物、磷酸二氢钾、磷酸二铵和微量元素复合剂组成；上述发酵产物按照如下方法制备将芽孢杆菌(Bacillus sp.)和褐煤混匀，发酵，收集产物，即得到发酵产物。本发明的实验证明，本发明制备了甜叶菊专用生物生长调节剂，通过适宜的施用方法，具有以下等有益效果可以通过甜叶菊专用生长调节剂的施用，有效地改善甜叶菊的微生态环境，调控微生态平衡，改善养分供应状况。
文档编号A01C21/00GK102515926SQ201210001790
公开日2012年6月27日 申请日期2012年1月5日 优先权日2012年1月5日
发明者于学健, 袁红莉 申请人:中国农业大学