专利名称：一种无血清低温保护剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种无血清低温保护剂。
背景技术：
目前体外制备的动物细胞低温储存保护剂主要采用含血清的DMSO溶液，但经过这种低温保护剂储存的细胞制剂血清残留很难清除，而且血清成分复杂，限制了细胞制剂的用途。间充质干细胞与其它成体二倍体细胞不同，是一种具有自我更新和多向分化能力的细胞，具有广泛的医疗用途，其低温储存对配方有更高的要求，为了满足临床需要，低温保护剂最好不含有血清成分。无血清低温保护剂是间充质干细胞低温保护剂的发展方向，现有技术已经公开采用了 PEG或海藻糖作为低温保护剂，也披露了 IV型胶原蛋白在人胚胎干细胞低温储存中的作用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种无血清低温保护剂，在于解决现有技术中含血清的低温保护剂血清成份复杂、血清残留难清除的问题及无血清低温储存试剂成分不明确的问题。为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案—种无血清低温保护剂，包括细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，其特征在于所述细胞外保护剂由NaCl、KCl、Na2HPO4. 12H20、KH2PO4, PEG (400 2000)、D-海藻糖和胶原 IV (IV型胶原蛋白)组成，所述细胞内渗透保护剂为DMSO (二甲基亚砜)，所述PEG (400 2000)是聚乙二醇的分子量在400 2000之间。进一步的技术方案是，每IOOmL无血清低温保护剂中，所述细胞外保护剂组成成份的重量为NaCl 为 800mg、KCL 为 20mg、Na2HP04. 12H20 为 290mg、KH2P04 为 24mg、PEG(400 2000)为5 15g、D-海藻糖为3. 423g 6. 846g、胶原IV为IOOug lOOOug，所述细胞内渗透保护剂DMSO为5mL 15mL。一种制备无血清低温保护剂的方法，步骤一将NaCl、KCl、Na2HPO4. 12H20、KH2PO4, PEG (400 2000)和 D-海藻糖全溶于注射用水中，溶液40°C保温；步骤二 步骤一所述溶液降温至20°C后，加入胶原IV，溶液20°C保温；步骤三在无菌环境中将步骤二所述加入胶原IV后的20°C保温溶液过滤除菌；步骤四将无菌DMSO溶入到步骤三经过滤除菌的溶液中，得到无血清低温保护剂。进一步的技术方案是，每IOOmL的无血清低温保护剂中，所述步骤一的NaCl为 800mg、KCl 为 20mg、Na2HPO4. 12H20 为 290mg、KH2PO4 为 24mg、PEG(400 2000)为 5 15g、CN 102578077 A
D-海藻糖为3. 423g 6. 846g，所述的注射用水为60mL。进一步的技术方案是，每IOOmL的无血清低温保护剂中，所述步骤二胶原IV为 IOOug IOOOug,加入胶原IVlOOug IOOOug后的溶液定容至85mL 95mL。进一步的技术方案是，所述步骤三的过滤除菌，使用孔径为O. 22um的无菌亲水滤膜。进一步的技术方案是，每IOOmL的无血清低温保护剂中，所述步骤四的无菌DMSO 为 5mL 15mL。更进一步的技术方案是，所述的一种无血清低温保护剂，用于冻存间充质干细胞， 所述间充质干细胞包括人和动物的骨髓、肌肉、皮肤、肝脏、肾脏、心脏、骨骼、脑、肺脏、消化道、胎盘、羊膜、羊水、脐带、脐带血、外周血。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(I)本发明不含有任何来源的血清成分，在低温储存细胞时不会有血清成分残留。(2)本发明成分明确、简单，易于配制。(3)本发明可用于间充质干细胞的低温储存。
图I为实施例2的不同低温保护剂低温冻存人骨髓间充质干细胞后F-CFU和存活率的检测结果示意图。
具体实施例方式实施例一一种无血清低温保护剂，包括细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，每IOOmL的无血清低温保护剂中，所述细胞外保护剂的组成成份重量=NaCl为800mg、KCL为20mg、 Na2HPO4. 12H20 为 290mg、KH2PO4 为 24mg、PEG (400)为 5g、D-海藻糖为 3. 423g、胶原 IV 为 lOOOug，所述细胞内渗透保护剂为DMSO为5mL。一种制备无血清低温保护剂的方法，步骤一JfNaCl 800mg、KCL 20mg、Na2HPO4. 12H20 290mg、KH2P0424mg、PEG (400) 5g、 D-海藻糖3. 423g溶于60mL注射用水中，搅拌，直至全溶，溶液40°C保温；步骤二 将步骤一所述溶液降温至20°C，加入胶原IVlOOOug，搅拌，直至全溶，定容至95mL，溶液20°C保温；步骤三在无菌环境中将步骤二所述加入胶原IV后的20°C保温溶液经0. 22um无菌亲水滤膜过滤除菌；步骤四在使用前，将5mL无菌DMSO加入到步骤三经过滤除菌的溶液中，混匀，得到IOOmL的无血清低温保护剂。实施例二一种无血清低温保护剂，包括细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，每IOOmL的无血清低温保护剂中，所述细胞外保护剂的组成成份重量=NaCl为800mg、KCL为20mg、 Na2HPO4. 12H20 为 290mg、KH2PO4 为 24mg、PEG (2000)为 15g、D_ 海藻糖为 6. 846g、胶原 IV 为 lOOug，所述细胞内渗透保护剂为DMSO为15mL。
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一种制备无血清低温保护剂的方法，步骤一将NaCl 800mg、KCL 20mg、Na2HPO4. 12H20 290mg、KH2P0424mg、 PEG (2000) 15g、D-海藻糖6. 846g溶于60mL注射用水中，搅拌，直至全溶，溶液40°C保温；步骤二 将步骤一所述溶液降温至20°C，加入胶原IVlOOOug，搅拌，直至全溶，定容至85mL，溶液20°C保温；步骤三在无菌环境中将步骤二所述加入胶原IV后的20°C保温溶液经O. 22um无菌亲水滤膜过滤除菌；步骤四在使用前，将15mL无菌DMSO加入到步骤三经过滤除菌的溶液中，混匀，得到IOOmL的无血清低温保护剂。更进一步的技术方案是，所述的一种无血清低温保护剂，冻存人骨髓间充质干细胞。人骨髓间充质干细胞的低温冻存将ImL的IXlO7个/mL人骨髓间充质干细胞， 与ImL上述无血清低温保护剂混匀，转移到冻存管中，再将所述冻存管以程控降温仪降温， 1°C /分钟，直至_90°C，转移到液氮中冻存。取低温冻存前的人骨髓间充质干细胞，血清组、PEG组、D-海藻糖组和PEG+D-海藻糖组的低温冻存剂分别冻存后的人骨髓间充质干细胞，各10组，共50组，每组100个细胞， 进行人骨髓间充质干细胞存活率和F-CFU(克隆形成单位)检测，检测结果见表I和表2。上述PEG+D-海藻糖组是通过本实施例的无血清低温保护剂配方和制备方法制成，上述血清组、PEG组、D-海藻糖组的低温冻存剂配方仅是分别用血清、PEG、D-海藻糖等量替换了上述PEG+D海藻糖组配方中的PEG和D-海藻糖，其它成份和用量相同，制备方法与上述PEG+D-海藻糖组的制备方法相同。表I不同低温保护剂低温冻存人骨髓间充质干细胞后F-CFU的检测
权利要求
1.一种无血清低温保护剂，包括细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，其特征在于所述细胞外保护剂由 NaCl、KCl、Na2HP04. 12H20、KH2PO4、PEG (400 2000)、D-海藻糖和胶原 IV 组成，所述细胞内渗透保护剂为DMSO。
2.根据权利要求I所述的一种无血清低温保护剂，其特征在于每IOOmL无血清低温保护剂中，所述细胞外保护剂组成成份的重量为=NaCl为800mg、KCL为20mg、Na2HP04. 12H20 为 290mg、KH2PO4 为 24mg、PEG (400 2000)为 5 15g、D-海藻糖为 3. 423g 6. 846g、胶原IV为IOOug lOOOug，所述细胞内渗透保护剂DMSO为5mL 15mL。
3.一种制备权利要求I所述的无血清低温保护剂的方法，其特征在于步骤一将 NaCl、KCl、Na2HPO4. 12H20、KH2PO4, PEG (400 2000)和 D-海藻糖全溶于注射用水中，溶液40°C保温；步骤二 步骤一所述溶液降温至20°C后，加入胶原IV，溶液20°C保温；步骤三在无菌环境中将步骤二所述加入胶原IV后的20°C保温溶液过滤除菌；步骤四将无菌DMSO溶入到步骤三经过滤除菌的溶液中，得到无血清低温保护剂。
4.根据权利要求3所述一种制备无血清低温保护剂的方法，其特征在于每IOOmL的无血清低温保护剂中，所述步骤一的NaCl为800mg、KCl为20mg、Na2HPO4. 12H20为290mg、 KH2PO4 为 24mg、PEG (400 2000)为 5 15g、D-海藻糖为 3. 423g 6. 846g，所述的注射用水为60mL。
5.根据权利要求3所述一种制备无血清低温保护剂的方法，其特征在于每IOOmL的无血清低温保护剂中，所述步骤二胶原IV为IOOug lOOOug，加入胶原IVlOOug IOOOug 后的溶液定容至85mL 95mL。
6.根据权利要求3所述一种制备无血清低温保护剂的方法，其特征在于所述步骤三的过滤除菌，使用孔径为0. 22um的无菌亲水滤膜。
7.根据权利要求3所述一种制备无血清低温保护剂的方法，其特征在于每IOOmL的无血清低温保护剂中，所述步骤四的无菌DMSO为5mL 15mL。
全文摘要
本发明公开了一种无血清低温保护剂，包含细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，所述细胞外保护剂由NaCL、KCL、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、PEG(400-2000)、D-海藻糖和胶原IV组成，所述细胞内渗透保护剂为DMSO。本发明还公开了一种制备无血清低温保护剂的方法。本发明不含有任何来源的血清成分，在低温储存细胞时不会有血清成分残留，本发明成分明确、简单，易于配制，可用于间充质干细胞的低温储存。
文档编号A01N1/02GK102578077SQ20121001103
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月13日 优先权日2012年1月13日
发明者戴成祥, 苑春慧, 邓涛 申请人:成都美进生物科技有限公司