专利名称：一种宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法
技术领域：
本发明涉及一种高效的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法。
背景技术：
宽叶香蒲是一种天然存在于池塘，湖泊和沼泽的大型植物。它广泛分布于热带和亚热带地区。它具有发达的根系和高效的光合作用系统，一次能够高效利用非结构态碳水化合物。因此，香蒲广泛用于自然或人工湿地污水处理系统中，用于处理城市生活污水、工业废水、农田污水、开矿污水等。更重要的是宽叶香蒲对重金属如镉，砷，锌以及铅等有较高的耐受性。这些重金属能够在宽叶香蒲的根部进行富集，却不会造成明显的伤害。有研究者通过快速培养宽叶香蒲的根去除重金属的污染。由于重金属蓄积在根部而难以从根部转移到香蒲茎、叶。所以，培养根这个过程显然是高能耗、高成本的过程，要利用宽叶香蒲来治理重金属污染，只能通过转基因的方式才能够解决。所以构建高效的宽叶香蒲转化体系十分重要。Rogers 等(Rogers et al.，1998)开发了一种宽叶香蒲愈伤组织分化成苗的方法。其用于诱导愈伤组织的外植体材料是成熟种子生成的幼苗。原因在于宽叶香蒲的种子过小，难以去壳和分离出胚。不能像其他单子叶植物一样从胚进行诱导愈伤组织(Valk et al. ,1992； Schaik et al. ,1996 ；Rogers et al. , 1998 ；Thomas and Yoichiro,2011 ；Perez~N/ unez et al.，2009)。所以，根和芽是较好用于诱导愈伤组织的外植体材料。然而对于通常的单子叶植物来说，从根尖诱导愈伤组织比从芽诱导要难(Kerbauy，1984)。近年有报道从 Orchidaceae (Park et al. ,2003)和 Doritaenopsis(Flachsland et al. ,2011 ；Kerbauy, 1984)的根尖成功诱导出愈伤组织。宽叶香蒲的根部十分发达，当种子在培养基中萌发10 天后，根的数量远多于苗的数量。这为从根尖诱导愈伤组织提供了便利。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，以提供更为高效的愈伤组织诱导、分化系统。即从根尖诱导愈伤组织的形成，并通过添加植物激素，提高愈伤组织形成效率，生长速度以及出苗效率和加快苗的生长速度。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，该方法包括如下步骤(I)将宽叶香蒲的种子干燥、消毒、发芽生根；(2)对步骤(I)生根后的根尖诱导愈伤组织并分化成苗(2a)从步骤⑴中生根后的苗根上获取2_3mm的根尖，转接到愈伤组织诱导培养基上无光条件下培养9周；所述的愈伤组织诱导培养基是外加2g L-1植物凝胶、30g L-1 蔗糖和2. 5 20 ii M毒莠定的MS培养基；(2b)将步骤(2a)得到的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上，在25°C、连续光照、光照强度是30 u mol .m-2 -S-1的条件下分化培养4周；所述的愈伤组织分化培养基为添加了 2. 5 5mg L-1 细胞分裂素(BA)、0 2. 5mg L-1 激动素(kinetin)、0 0. 05mg L-1 萘乙酸(NAA)和0 0. 05mg L—1吲哚乙酸(IAA)的MS培养基；所述的愈伤组织分化培养基优选表I中的三种配方之一；表I愈伤组织分化培养基为MS培养基基础上添加的植物激素(mg L—1)
权利要求
1.一种宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)将宽叶香蒲的种子干燥、消毒、发芽生根；(2)对步骤(I)生根后的根尖诱导愈伤组织并分化成苗(2a)从步骤(I)中生根后的苗根上获取2-3mm的根尖，转接到愈伤组织诱导培养基上无光条件下培养9周；所述的愈伤组织诱导培养基是外加2g · L-1植物凝胶、30g · L-1蔗糖和2. 5 20 μ M毒莠定的MS培养基；(2b)将步骤(2a)得到的愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上，在25°C、连续光照、 光照强度是30 μ mol · πΓ2 · s—1的条件下分化培养4周；所述的愈伤组织分化培养基为添加了 2. 5 5mg · L—1细胞分裂素、O 2. 5mg · L—1激动素、O O. 05mg · L—1萘乙酸和O O.05mg · L-1吲哚乙酸的MS培养基；(2c)将步骤(2b)分化培养后得到的苗转接到生根培养基上培养4周；所述的生根培养基为添加了 2mg · L-1IBAdg · L—1植物凝胶和30g · L—1蔗糖的1/4MS基本培养基；(2d)将步骤(2c)生根培养后的苗转移到含有花肥的小花盆中，将苗置于25°C的温室中生长，在第一周的时候苗的上方要覆盖一层塑料薄膜，防止水分的蒸发，温室中的光照强度约为230 μ mol ·πΓ2 Μ—1』天浇水一次，培养40天后转移到更大的花盆中，花盆中含有花肥并保持3 5cm深度的水。
2.根据权利要求I所述的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的干燥条件为42°C下干燥24小时。
3.根据权利要求I所述的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的消毒，包括如下步骤(Ia)将种子用灭过菌的蒸馏水浸泡两次，每次浸泡5min，倒干水；(Ib)步骤(Ia)处理后的种子用75% (v/v)的乙醇溶液浸泡90秒，倾去乙醇溶液；(Ic)步骤(Ib)处理后的种子加入2. 5% (w/w)的次氯酸钠溶液中消毒15分钟，在消毒时不断摇晃，重复一次，倾去次氯酸钠溶液；(Id)步骤(Ic)处理后的种子用无菌水浸泡3次，每次浸泡5分钟，倒掉无菌水。
4.根据权利要求I所述的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，步骤(I)中所述的发芽生根，将种子转移到添加了 30g L-1的蔗糖、pH5.8的液体MS培养液中，置于25°C连续光照下2天发芽，然后将发芽的种子转接到生根培养基中生根培养 5 7天。
5.根据权利要求4所述的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，所述的生根培养基为添加了 2mg · L-1IBAdg · L—1植物凝胶和30g · L—1蔗糖的1/4MS基本培养基。
6.根据权利要求4所述的宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，其特征在于，生根后的苗的继代培养条件为将生根后的苗转接到固体MS培养基，培养3-5周。
全文摘要
本发明公开了一种宽叶香蒲根尖诱导愈伤组织并分化成苗的方法，将宽叶香蒲的种子干燥、消毒、发芽生根；对生根后的根尖诱导愈伤组织并分化成苗，具体方法为从生根后的苗根上获取2-3mm的根尖，转接到愈伤组织诱导培养基上无光条件下培养9周；将愈伤组织转接到愈伤组织分化培养基上，在25℃、连续光照的条件下分化培养4周；将分化培养后得到的苗转接到生根培养基上培养4周；将生根培养后的苗转移到含有花肥的小花盆中，将苗置于25℃的温室中生长，在第一周的时候苗的上方要覆盖一层塑料薄膜，防止水分的蒸发，3天浇水一次，培养40天后转移到更大的花盆中并保持3～5cm的水。
文档编号A01H4/00GK102577954SQ20121003364
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月15日 优先权日2012年2月15日
发明者刘露, 吕志刚, 张全兴, 杜宏伟, 杨柳燕, 武俊, 肖 琳, 许超 申请人:南京大学