专利名称：一种诱导铁皮石斛试管开花的方法
技术领域：
本发明涉及一种铁皮石斛试管开花方法，属于农业植物生物技术领域。
背景技术：
铁皮石斛officinaleKimura i/Zgo)又称黑节草,属气生兰科草本植物。铁皮石斛是石斛中的极品，因其表皮呈铁绿色而得名，是著名的观赏兼药用兰花。因其对生境条件要求苛刻，难开花，在栽培条件下，从种子萌发到开花通常需要3 4 年[1]。而应用植物生物技术诱导铁皮石斛开花，具有操作简单、生长条件可控，重复性强，周期短的特点，并可为研究植物开花机理和生理研究，提供了更精准的研究手段和良好的实验系统。因此，铁皮石斛试管花的诱导对提高植物开花机理研究具有非常重要的意义。植物生长调节剂中，细胞分裂素既能促进花芽分化，又可促进营养芽分化，所以研究中通常应考虑使用不同种类和浓度的细胞分裂素。郑立明[2]、朱国兵M等人对兰花试管开花研究表明，6-BA可以诱导花芽形成，但是易产生畸形花。石斛属植物开花过程中内源激素变化，以及植物生长调节剂如GA，BA等对开花的诱导与调控等等亦有一些研究[4_13]。目前对于在对铁皮石斛试管开花的研究报道中，多采用6-BA、NAA等不同浓度激素，或添加一定量的PP333、TDZ等进行诱导，虽可获得一定的开花诱导率[1’14’15]，但是植株生长较弱， 叶片卷曲，花朵较小，且常出现花器官不完整的花朵。
发明内容
本发明提供了一种铁皮石斛试管开花的方法，诱导铁皮石斛开花，从而提高铁皮石斛成花率。本发明的目的是通过以下技术方案实现
本发明提供的一种铁皮石斛试管开花的方法，包括以下步骤
(1)壮苗培养阶段采用铁皮石斛茎段离体培养的原球茎为试验材料，以1/2MS为基本培养基，蔗糖3%，添加NAA0. 5-1. 0 mg/L和6-BA I. 5-2. 5 mg/L，采用LED光源，在光照强度 35 — 55//mo I. HT2. s—1，波长 600 690 nm，光照时间12 -16 h/d，培养温度 25±2°C 的条件下进行壮苗培养50-80 d ；
(2)诱导开花阶段I:培养基I为1/2 MS基本培养基+PP333 0 . 50 - I. 50 mg/L+ABA
0.5-1. 0 mg/L,另在培养基I中附加体积比为10%-20%的香蕉汁、0. 1%-0. 5%活性炭，采用 LED光源，在光照强度50 - 75// mol. m—2. s—1，波长600 690 nm，培养温度26±2°C的条件下，培养20-30 d ；
(3)诱导开花阶段II:诱导开花阶段I完成后，进入诱导开花阶段II，培养基II为 1/2 MS 基本培养基+TDZ 0. 05-1. 00 mg/L + 6-BA 0.5-1.0 mg/L,另在培养基 II 中附加体积比为10%-20%的香蕉汁、0. 1%-0. 5%活性炭，采用LED光源，在光照强度50 — 75// mol. nT2. s—1，波长490 590 nm，培养温度15±2°C的条件下，培养20_30d，进入诱导开花阶段I ;
所述1/2 MS基本培养基，指的是大量元素减半，其余含量不变；
3通过上述(2)与(3)即诱导开花阶段I-诱导开花阶段II-诱导开花阶段I的交替培养诱导后，进入开花培养阶段；
(4)开花培养阶段以MS为基本培养基，添加6-BA 0. 5-1.5 mg/L和马铃薯100-200 g/ L，采用LED光源，在光照强度65 — 85//mol. nT2. s—1，光照时间12 -16 h/d，波长600 690 nm，培养温度26±2°C的条件下进行开花培养。本发明的诱导铁皮石斛开花的方法，可以准确有效地诱导铁皮石斛花芽的形成，以及调控铁皮石斛试管开花率；在铁皮石斛花芽形成的最关键阶段，通过温度刺激、 以及PP333, ABA, TDZ和BA的共同协同调节作用，显著激活铁皮石斛试管苗开花的关键因子，从而提高铁皮石斛成花率。本发明的方法可诱导健壮植株，花型大，其开花诱导率为 90. 5%-96. 7%，花器官完整的花朵高达98. 5% — 100%。
具体实施例方式实施例I
首先以铁皮石斛茎段为外植体离体培养原球茎(MS+1.0 mg T1 6-BA+1. 0 mg T1 NAA+30 g L—1蔗糖+7. 0 g L—1琼脂，pH为5. 4的培养基，进行原球茎的诱导与增殖)，然后将原球茎进行如下培养与诱导
(I)壮苗培养阶段以1/2 MS为基本培养基，蔗糖3% (w/v)，添加NAA0. 5 mg/L和 6-BA 2. 0 mg/L的培养条件,在光照强度40//mol. m_2. s'波长600 nm，光照时间12 h/d,培养温度25°C的条件下进行壮苗培养60 d。(2)诱导开花阶段I :以1/2 MS为基本培养基，添加PP333L 00 mg/L+ABA 0. 5 mg/ L,在光照强度60// mol. m_2. s'波长600nm，培养温度26°C，附加香蕉汁14% (v/v)，活性炭0.15%的培养条件下，培养23 d后，进入诱导阶段II。(3)诱导开花阶段II :以1/2 MS为基本培养基，添加TDZ 0. 06 mg/L +BA 0.8 mg/ L,在光照强度65// mol. m_2. s-1，波长530 nm,培养温度15。。，附加香蕉汁13% (v/v)，活性炭0.35%的培养条件下，培养22 d后，进入诱导阶段I。通过上述(2)与(3)即诱导开花阶段I--诱导开花阶段II--诱导开花阶段I 的交替培养诱导后，进入开花培养阶段。(4)开花培养阶段以MS为基本培养基，添加6-BA 0. 55 mg/L和马铃薯120 g/L， 在光照强度75// mol. m_2. s'光照时间14 h/d,波长630 nm,培养温度26°C条件下进行开花培养。开花诱导率为93. 5%，花器官完整的花朵高达98. 5%。实施例2
采用铁皮石斛茎段离体培养的原球茎进行如下培养与诱导
(I)壮苗培养阶段以1/2 MS为基本培养基，蔗糖3% (w/v)，添加NAA0. 8 mg/L和 6-BA I. 7 mg/L的培养条件,在光照强度35//mol. m_2. s—1,波长650 nm，光照时间14 h/d,培养温度24°C的条件下进行壮苗培养55 d。(2)诱导开花阶段I :以1/2 MS为基本培养基，添加PP333O- 80 mg/L+ABA 0. 8 mg/ L,在光照强度55// mol. nT2. s—1，波长660 nm,培养温度25°C，附加香蕉汁10% (v/v)，活性炭0.3%的培养条件下，培养25 d后，进入诱导阶段II。(3)诱导开花阶段II :以1/2 MS为基本培养基，添加TDZ 0. 05mg/L +BA I. 0 mg/L,在光照强度55// mol. m_2. s-1，波长490 nm,培养温度14。。，附加香蕉汁20% (v/v)，活性炭0. 15%的培养条件下，培养25 d后，进入诱导阶段I。通过(2)、(3)交替培养诱导后，进入开花培养阶段。(4)开花培养阶段以MS为基本培养基，添加6-BA I. 0 mg/L和马铃薯150 g/L, 在光照强度68// mol. m_2. s'光照时间15 h/d,波长600 nm,培养温度28°C条件下进行开花培养。开花诱导率为95. 5%，花器官完整的花朵高达99. 5%。实施例3
采用铁皮石斛茎段离体培养的原球茎进行如下培养与诱导
(I)壮苗培养阶段以1/2 MS为基本培养基，蔗糖3% (w/v)，添加NAA1.0 mg/L和 6-BA 2. 5 mg/L的培养条件,在光照强度55//mol. m_2. s'波长690 nm，光照时间16 h/d,培养温度27°C的条件下进行壮苗培养80 d。(2)诱导开花阶段I :以1/2 MS为基本培养基，添加PP333I- 50 mg/L+ABA I. 0 mg/ L,在光照强度75// mol. nT2. s—1，波长690 nm,培养温度28°C，附加香蕉汁20% (v/v)，活性炭0.5%的培养条件下，培养30 d后，进入诱导阶段II。(3)诱导开花阶段II :以1/2 MS为基本培养基，添加TDZ 1.00 mg/L +BA 0.5 mg/ L，在光照强度75//mol. nT2. s—1，波长590 nm，培养温度16°C，附加香蕉汁15% (v/v)，活性炭0. 5%的培养条件下，培养28 d后，进入诱导阶段I。通过(2)、(3)交替培养诱导后，进入开花培养阶段。(4)开花培养阶段以MS为基本培养基，添加6-BA I. 5 mg/L和马铃薯200 g/L, 在光照强度85// mol. nT2. s—1，光照时间16 h/d,波长690 nm,培养温度24°C条件下进行开花培养。开花诱导率为96. 5%，花器官完整的花朵高达100%。参考文献
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1.一种铁皮石斛试管开花的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)壮苗培养阶段采用铁皮石斛茎段离体培养的原球茎为试验材料，以1/2MS为基本培养基，蔗糖3%，添加ΝΑΑ0. 5-1. O mg/L和6-BA I. 5-2. 5 mg/L，采用LED光源，在光照强度 35 — 55//mo I. πΓ2. s—1，波长 600 690 nm，光照时间12 -16 h/d，培养温度 25±2°C 的条件下进行壮苗培养50-80 d ；(2)诱导开花阶段I:培养基I为1/2 MS基本培养基+PP333 O. 50 一 I. 50 mg/L+ABA O. 5-1. O mg/L,另在培养基I中附加体积比为10%-20%的香蕉汁、O. 1%-0. 5%活性炭，采用 LED光源，在光照强度50 - 75// mol. πΓ2· s—1，波长600 690 nm，培养温度26±2°C的条件下，培养20-30 d ；(3)诱导开花阶段II:诱导开花阶段I完成后，进入诱导开花阶段II，培养基II为 1/2 MS 基本培养基+TDZ O. 05-1. 00 mg/L + 6-BA O. 5-1. O mg/L,另在培养基 II 中附加体积比为10%-20%的香蕉汁、O. 1%-0· 5%活性炭，采用LED光源，在光照强度50 — 75// mol. πΓ2. s—1，波长490 590 nm，培养温度15±2°C的条件下，培养20-30d，进入诱导开花阶段I ;其中1/2 MS，指的是大量元素减半，其余含量不变；通过上述(2)与(3)即诱导开花阶段I-诱导开花阶段II-诱导开花阶段I的交替培养诱导后，进入开花培养阶段；(4)开花培养阶段以MS为基本培养基，添加6-BAO. 5-1.5 mg/L和马铃薯100-200 g/ L，采用LED光源，在光照强度65 — 85//mol. πΓ2. s—1，光照时间12 -16 h/d，波长600 690 nm，培养温度26±2°C的条件下进行开花培养。
全文摘要
本发明涉及一种铁皮石斛试管开花方法，属于农业植物生物技术领域。该方法包括以下步骤采用铁皮石斛茎段离体培养的原球茎为试验材料，进行壮苗培养50-80d；再经过诱导开花阶段I--诱导开花阶段II--诱导开花阶段I的交替培养诱导后，进入开花培养阶段。本发明的诱导铁皮石斛开花的方法，可以准确有效地诱导铁皮石斛花芽的形成，以及调控铁皮石斛试管开花率；本发明的方法可诱导健壮植株，花型大，其开花诱导率为90.5%-96.7%，花器官完整的花朵高达98.5%-100%。
文档编号A01H4/00GK102577963SQ20121004925
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月29日 优先权日2012年2月29日
发明者刘狄, 刘生财, 吴高杰, 林玉玲, 赖钟雄, 陈发兴 申请人:福建农林大学