专利名称：采用病毒唑脱除马铃薯病毒的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种采用病毒抑制剂脱除植物病毒的方法，特别涉及一种采用病毒唑脱除几种常见的马铃薯病毒的方法。
背景技术：
马铃薯栽培分布较广，是世界上第四大栽培作物。中国则为马铃薯栽培面积最大的国家，马铃薯在我国的工农业生产中占有重要地位，发展我国的马铃薯种植业则具有重要的战略意义。然而，马铃薯作为无性繁殖作物，它易感染各种病毒。通过研究发现，危害马铃薯生长发育的病毒主要有30余种，其中在我国普遍存在而且危害严重的有马铃薯卷叶病毒(PLRV)，马铃薯Y病毒(PVY)，马铃薯X病毒(PVX)，马铃薯A病毒(PVA)，马铃薯S 病毒(PVS)，马铃薯M病毒(PVM)，马铃薯类病毒(PSTVd)等病毒或类病毒。马铃薯体内病毒的积累可使品系种性退化，品质与质量降低，对其生长造成严重危害。只有采用现代生物技术将种薯内的病毒去掉，恢复马铃薯品种本身的生理功能和生产特性，才能防止马铃薯的退化，使之达到育种家培育之初品种的商品性状和产量。目前，常用的马铃薯病毒脱除方法包括以下三种(I)物理方法。利用一些物理因素如X射线，紫外线，超短波和高温或冷冻处理等处理种薯使病毒钝化，可以达到脱除病毒获得脱毒种薯的目的。其中以热处理钝化病毒的方法最为有效，在35°C下处理56天，或在36°C处理39天，可以除去某些马铃薯品种块茎中的PLRV。其优点是操作简单，短时间内处理大批种薯。缺点是对大多数病毒不能根除，有很大的局限性，而且脱毒效果不理想，同时会造成材料干枯或者死亡。(2)茎尖分生组织脱毒技术。目前应用最广泛而且在农业生产和商业生产中取得巨大成功的植物脱毒技术，是生物技术中的植株茎尖分生组织培养脱毒技术。根据脱毒难易的程度可排列为PLRV < PVA < PVY < PAMV < PVM < PVX < PVS < PVTVd0但是该方法操作难度大，技术含量高。(3)化学方法。最近研究表明，一些化学药剂能有效地脱除正在生长的植物体内的病毒，其原理为病毒抑制剂在三磷酸状态下会阻止病毒RNA帽子结构形成，从而影响病毒RNA的复制，干扰病毒的正常生长，达到除去病毒的目的。目前常见的病毒抑制剂有三氮唑核苷(病毒唑)，5-二氢尿嘧啶(DHT)，双乙酰-二氢-5-氮尿嘧啶(DA-DHT)等。在实际应用中，人们往往将这些药物直接加到正常植株生长的培养基上，用以预防病毒感染植物本身。然而，这些病毒抑制剂的加入对植株本身也产生了毒害，即使在非常低的浓度条件下，植株的生长发育也会受到严重影响。因此，采用病毒抑制剂提前预防正常植株感染病毒的方法显得很不科学。
发明内容
鉴于现有技术的不足，发明人通过综合研究各种脱毒方法的优缺点，提供了一种采用病毒唑脱除马铃薯病毒的方法。该方法能有效脱除多种常见的马铃薯病毒，且脱毒植株内病毒含量长时间不会出现恢复现象，同时简单易行，操作方便，可广泛应用于马铃薯脱毒后的无毒种植与生产。本发明的目的是这样实现的一种采用病毒唑脱除马铃薯病毒的方法，其特征在于将感染病毒的马铃薯苗接种于含有病毒唑的培养基上培养45-135天，且病毒唑在所述培养基中的浓度为75-150mg/ L0优选地，所述采用病毒唑脱除马铃薯病毒的方法，将感染病毒的马铃薯苗接种于含有病毒唑的培养基上培养90-135天。优选地，所述采用病毒唑脱除马铃薯病毒的方法，病毒唑在所述培养基中的浓度为 75-100mg/L。优选地，所述采用病毒唑脱除马铃薯病毒的方法，所述培养基的成分为MS+病毒唑。优选地，所述采用病毒唑脱除马铃薯病毒的方法，所述的培养条件为光照强度为 50-80mol/m2/s，光照时间为16h/D，培养温度为20°C。进一步优选地，所述的病毒选自如下的一种或多种马铃薯卷叶病毒(PLRV)，马铃薯Y病毒(PVY)，马铃薯X病毒(PVX)，马铃薯A病毒(PVA)，马铃薯S病毒(PVS)，马铃薯 M病毒(PVM)和马铃薯类病毒(PSTVd)。与现有技术相比，本发明创造性地采用病毒唑脱除马铃薯病毒，通过大量试验摸索出了病毒唑的最佳使用浓度，可以大批量有效脱除几种常见的马铃薯病毒，病毒脱除率高，且脱毒植株内病毒含量长时间不会出现恢复现象，同时简单易行，操作方便，可广泛应用于马铃薯脱毒后的无毒种植与生产。
图IPVX病毒唑处理135天病毒含量及后期恢复情况PVX试管苗1、2、3表示经病毒唑处理135天及这3棵试管苗第一节接种到普通MS 培养基中继代培养3次后的马铃薯试管苗。图2PVM病毒唑处理135天及后期恢复病毒含量情况PVM试管苗1、2、3表示经病毒唑处理135天及这3棵试管苗第一节接种到普通MS 培养基中继代培养3次后的马铃薯试管苗。图3PVS病毒唑处理135天及后期恢复病毒含量情况PVS试管苗1、2、3表示经病毒唑处理135天及这3棵试管苗第一节接种到普通MS 培养基中继代培养3次后的马铃薯试管苗。图4PLRV病毒唑处理135天及后期恢复病毒含量情况PLRV试管苗1、2、3表示经病毒唑处理135天及这3棵试管苗第一节接种到普通 MS培养基中继代培养3次后的马铃薯试管苗。图5PVA病毒唑处理135天及后期恢复病毒含量情况PVA试管苗1、2、3表示经病毒唑处理135天及这3棵试管苗第一节接种到普通MS 培养基中继代培养3次后的马铃薯试管苗。
具体实施例方式以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。实施例I病毒唑脱除PVX将感染PVX的马铃薯试管苗接种到含一定浓度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/ L、200mg/L)的病毒唑的MS培养基中，在光照强度为50-80mol/m2/S，光照时间为16h/D，培养温度为20°C的培养室中进行培养，一个培养周期为45天，一周期后将植株顶端接种到下一同浓度培养基中进行下一周期的培养，剩下植株部分进行ELISA检测及植株株高、鲜重测定(结果见表I)。结果表明单独感染PVX的毒源植株在浓度为75mg/L-150mg/L时处理 90天，病毒脱除率可达到100% (结果见表6)。表I病毒唑处理侵染PVX的马铃薯试管苗不同浓度的株高、鲜重
处理株高平均数显著性差异鲜重平均数显著性差异(cm)0.05(g)0.050 mg/L8.8208a1.1738a75 mg/L3.8541b1.1125b100 mg/L3.5600b0.0804C150 mg/L2.9000b0.0585C200 mg/L2.2000b0.0530C标注表格中a、b、c用来表示各数据间的显著性差异。实施例2病毒唑脱除PVM将复合侵染MSY的马铃薯试管苗接种到含一定浓度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、 150mg/L、200mg/L)的病毒唑的MS培养基中，在光照强度为50-80mol/m2/s,光照时间为 16h/D，培养温度为20°C的培养室中进行培养，一个培养周期为45天，一周期后将植株顶端接种到下一同浓度培养基中进行下一周期的培养，剩下植株部分进行ELISA检测及植株株高、鲜重测定(结果见表2)。对于复合侵染MSY的马铃薯试管苗，处理45天时各浓度对PVM 的脱除率在50% -100%之间，对PVS、PVY的脱除率为0% ;处理90天时，各浓度对PVM的脱除率在50% -100%之间，对PVS的脱除率在40% -67%之间，对PVY的脱除率为0%;处理135天时，各浓度对PVM、PVS的脱除率为100%，对PVY的脱除率为33% (结果见表7)。表2病毒唑处理复合侵染YSM的马铃薯试管苗不同浓度的株高、鲜重处理株高平均数显著性差异鲜重平均数(g)显著性差异(cm)0.050.050 mg/L7.6407a0.1533a75 mg/L6.6414a0.1459ab100 mg/L5.4400b0.1110be150 mg/L2.5133C0.0871C200 mg/L1.9625C0.0568C标注表格中a、b、c用来表示各数据间的显著性差异。实施例3病毒唑脱除PVS将感染PVS的马铃薯试管苗接种到含一定浓度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/ L、200mg/L)的病毒唑的MS培养基中，在光照强度为50-80mol/m2/S，光照时间为16h/D，培养温度为20°C的培养室中进行培养，一个培养周期为45天，一周期后将植株顶端接种到下一同浓度培养基中进行下一周期的培养，剩下植株部分进行ELISA检测及植株株高、鲜重测定(结果见表3)。结果表明单独侵染处理90天时，其脱除率可达到75%以上；处理135 天时，各个浓度均可以将PVS完全脱除(结果见表6)。表3病毒唑处理侵染PVS的马铃薯试管苗不同浓度的株高、鲜重
处理株高平均数 (cm)显著性差异鲜重平均数(g)显著性差巳 升0.050.050 mg/L15.3381a0.3385a75 mg/L7.9750a1.1723b100 mg/L5.4046a0.1087C150 mg/L2.9000a0.0916C200 mg/L————————标注表格中a、b、c用来表示各数据间的显著性差异。实施例4病毒唑脱除PLRV将感染PLRV的马铃薯试管苗接种到含一定浓度(0mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/ L、200mg/L)病毒唑的MS培养基中，在光照强度为50-80mol/m2/s，光照时间为16h/D，培养温度为20°C的培养室中进行培养，一个培养周期为45天，一周期后将植株顶端接种到下一同浓度培养基中进行下一周期的培养，剩下植株部分进行ELISA检测及植株株高、鲜重测定(结果见表4)。结果表明单独侵染PLRV的毒源植株在处理90天时，浓度为75mg/L， 100mg/L的病毒唑对该病毒的病毒脱除率为33%，浓度为150mg/L可以完全脱除PLRV ;当处理135天时，75mg/L, 100mg/L的病毒唑对PLRV的脱除率达到100% (结果见表6)。表4病毒唑处理侵染PLRV的马铃薯试管苗不同浓度的株高、鲜重
权利要求
1.采用病毒唑脱除马铃薯病毒的方法，其特征在于将感染病毒的马铃薯苗接种于含有病毒唑的培养基上培养45-135天，且病毒唑在所述培养基中的浓度为75-150mg/L。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于将感染病毒的马铃薯苗接种于含有病毒唑的培养基上培养90-135天。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于病毒唑在所述培养基中的浓度为 75-lOOmg/L。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述培养基的成分为MS+病毒唑。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述的培养条件为光照强度为 50-80mol/m2/s，光照时间为16h/D，培养温度为20°C。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法,其特征在于所述的病毒选自如下的一种或多种PVX、PVY、PVM, PVS, PLRV、PSTVd 和 PVA0
全文摘要
采用病毒唑脱除马铃薯病毒的方法，本发明涉及一种采用病毒抑制剂脱除植物病毒的方法，包括将感染病毒的马铃薯苗接种于含有病毒唑的培养基上培养45-135天，且病毒唑在所述培养基中的浓度为75-150mg/L。本发明方法简单易行，操作方便，对常见的几种马铃薯病毒均具有极高的脱除效率，可以在生产过程中使用，便于大批量处理材料，是一种高效的马铃薯病毒脱除技术。
文档编号A01H4/00GK102599057SQ20121007817
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者宋波涛, 杨立杰, 柳俊 申请人:华中农业大学