专利名称：一株乳酸菌Lactobacillus parafarraginis ZH1及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物应用和饲料调制加工领域，具体涉及一株乳酸菌Lactobacillus parafarraginis ZHl及其在青忙饲料调制中的应用。
背景技术：
青贮饲料颜色黄绿、气味酸香、柔软多汁、适口性好，在畜牧业生产中广泛应用，尤其在反刍动物饲养中，它已成为不可缺少的基础饲料。但青贮容器开封后，厌氧环境立即变成了有氧环境，好氧微生物开始增殖，从而使青贮饲料发生一系列的生物化学变化，常常导致青贮饲料发热、变质，即青贮饲料的好氧变质现象。通常情况下，好氧变质主要表现为温度上升和真菌菌斑的出现。对于不同的青贮饲料而言，好氧变质的速率不同。有的青贮饲料在开封后的数小时内则温度骤升，真菌菌斑产生；有的青贮饲料则能较长时间(I周或数 周)保持不变。青贮饲料一旦发生好氧变质，饲料中的营养物质被氧化分解，干物质损失严重甚至全部不得不废弃；另外，一些有害微生物的活动会产生大量的有毒物质，轻则影响家畜健康、降低生产能力，重则造成中毒死亡，对畜牧业生产危害重大。乳酸菌为革兰氏阳性菌，抗过氧化氢酶、厌氧、无孢子，无运动性，被认为是益生菌而广泛应用于青贮饲料生产当中。乳酸菌按发酵类型分为同型发酵乳酸菌和异型发酵乳酸菌。同型发酵乳酸菌利用水溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates, WSC)产生较多的乳酸，改善青贮发酵品质，但抑制好氧变质的能力普遍较差。异型发酵乳酸菌利用WSC产生较多的乙酸，抑制了好氧性细菌、酵母和霉菌及青贮饲料好氧变质。目前，应用较广泛的商品菌剂是布氏乳杆菌buchneri ) 但其在某些条件下抑制青忙饲料的效果却不明显，如低温和短时间贮藏。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一株乳酸菌Lactobacillus parafarraginis ZHl 本发明另一目的在于提供上述乳酸菌parafarraginis ZHl的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
一株类谷糠乳杆菌parafarraginis (ZHl),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO. 6079，保藏日期为2012年5月3日。本发明乳酸菌parafarraginis ZHl的生物学特性为革兰氏染色阳性杆菌，葡萄糖异型发酵，耐酸性强(在PH4. O可以正常生长)，生长速度快(MRS培养基培养24小时pH可降到4. 5以下)，生育温域宽(15-45°C可正常生长)，在纯培养和青贮条件下高产苯甲酸和十六烷酸。本发明乳酸菌parafarraginis ZHl的获得方法是富集培养该菌，稀释平板法筛选获得将装有500 mL蒸馏水的锥形瓶、装有9 mL蒸馏水的试管、MRS固体培养基及平板灭菌，灭菌后再将MRS培养基倒入平板内。无菌条件下，取10 g青贮苏丹草样品于塑料袋内，再加入90 mL灭菌蒸馏水振荡均匀，使其终浓度为100 g·!/1，然后再取稀释后样品I mL加入含有9 mL灭菌蒸馏水的试管振荡均匀，使其终浓度为10 g · L—1，此时取该液体O. 03 mL反复进行平板划线分离，直至得到单菌落，将单菌落用接种针插入含有MRS固体培养基的试管中心，于4°C冰箱内保存。其中MRS培养基为蛋白胨(Proteosepeptone NO. 3) 10. O g;牛肉膏(Beef extract) 10. O g ;酵母提取物(Yeast extract) 5. Og ;葡萄糖(Dextrose)20. O g ;吐温(Polysorbate 80)1 mL ;朽1 樣酸铵(Ammonium citrate)
2.O g ;醋酸钠(NaAc) 5. O g ;硫酸镁(MgSO4 · 7H20) O. I g ;硫酸锰(MnSO4 · 4H20) O. 05 g ；磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.0 g ;蒸馏水(H2O) 1000 mL,固体培养基再加15 g/L琼脂(Agar)，121°C，灭菌 20 min。本发明用生理生化方法筛选出高产苯甲酸和十六烷酸、耐酸及生长速度快的乳酸|if Lactobacillus parafarraginis ZHl。 1 . lif Lactobacillus parafarraginis ^ 长基因，然后运用PCR扩增引物25f (SEQ ID NO: I)和1492r (SEQ ID勵:2)，扩增出163rDNA基因，在NCBI上对比相关序列，确定其相似菌种。最后，将筛选出的菌株及对照菌(在国内使用最多的商品菌剂)分别添加到不同饲草中，开封后分析青贮产物和有氧稳定性并与对照菌进行对比，确认parafarraginis ZHl可以显著提高青忙饲料的有氧稳定性。本发明乳酸菌parafarraginis ZHl可以用于调制青忙饲料。具体方法为
(1)将待发酵饲料切断混合均匀；
(2)每千克待发酵饲料加入乳酸菌parafarraginisZHl 1.0X IO8个以上；
(3)将饲料真空密封后贮藏。作为一种优选方案，步骤(I)所述待发酵饲料切断至f 2cm。作为一种优选方案，步骤(3)所述的贮藏温度为15 45°C，pH值为4. (Γ8. 5。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
(I)本发明利用微生物乳酸菌parafarraginis ZHl抑制青忙饲料好氧变质，成本低，安全，可靠，易于利用。(2)本发明菌株可在我国各地使用，特别是低温贮藏条件下效果独特，克服了发酵品质好的青贮饲料易好氧变质的问题。(3)本发明使用的乳酸菌parafarraginis ZHl在低温环境下比市售乳酸菌添加剂效果更佳。
图I为不同乳酸菌在MRS培养基中的十六烷酸产量示意图，其中柱间小写字母不同者为差异显著，/^〈0. 05 ;ZH1,Z. parafarraginis ZHl ;ZH2,短乳杆菌(Z.);LP,植物乳杆菌(Z. 應)；LB,布氏乳杆菌(Z. buchneri )；
图2为不同乳酸菌在MRS培养基中的苯甲酸产量示意图，其中柱间小写字母不同者为差异显著，P〈0. 05 ;ZH1,Z. parafarraginis ZHl ;ZH2,短乳杆菌(Z. /wi50;LP,植物乳杆菌(Z. plantarum') ；LB,布氏乳杆菌(Z. buchneri )；
图3为不同乳酸菌在晾晒黄燕麦青贮中苯甲酸和十六烷酸等的产量，其中柱间小写字母不同者为差异显著，/X0. 05 ;CK,对照；ZHl,Z. parafarraginis ZHl ； LB,商品菌剂；BA,苯甲酸；TA，十四烷酸；PA，十六烷酸；OA，十八烷酸。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例I筛选高产苯甲酸和十六烷酸的优良乳酸菌 从苏丹草青贮饲料上分离的乳酸菌菌株ZH1，进行革兰氏染色和细胞形状观察，并根据生育温度(10、15、20、25、30、35、40、45、50°0和生育 pH (3. 5、3· 75,4. 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· O、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. O),MRS中产生苯甲酸和十六烷酸等生理生化实验。结果表明，ZHl菌株为革兰氏阳性，异型发酵的杆菌，在15-45°C和pH4. 0-8. 5条件下皆可生长，具有较强耐酸性(表I);可发酵大多数糖类(表2);在MRS中能够产生较多的苯甲酸和十六烷酸(图I和图2)。表I菌株ZHl的特性
ww pg
革兰氏染色检测阳性 过氧化氢酶活性阴性
形状_杆状
发酵葡萄糖形式异型 MRS中的生长pH__
3.80—-
4.PO— +
4. 50— +
8. 50— +
MRS中的生育温度 15。。~ +
40 °C~ +
45 °C|±~
注-，不生长；±，生长较弱；+，正常生长。表2菌株ZHl对不同糖的利用能力
糖类I利用性I糖类I利用性
对照_-_七叶灵_;_
甘油_-_Wg_+_
赤癣醇7纤维二糖+ —
D—阿拉{白糖_^_麦牙糖_+_
L-阿拉伯糖_+_乳糖_+_
核糖一+ 蛋二糖^
D-木糖_-_鹿糖_+_
L-木糖_-_海藻糖_+_
阿东醇_+
β-甲基-D-木糖甙-_松三糖_+_
半乳糖_+_棉子糖_+_
葡萄糖I+ I淀粉I- —
权利要求
1.一株乳酸菌L3cioAaci77w5· parafarraginis ZHl,其特征在于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO. 6079，保藏日期为2012年5月3日。
2.权利要求I所述乳酸菌parafarraginisZHl在调制青忙饲料中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于包括如下步骤 (1)将待发酵饲料切断混合均匀； (2)每千克待发酵饲料加入乳酸菌parafarraginisZHl 1.0X IO8个以上； (3)将饲料真空密封后贮藏。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤(I)所述待发酵饲料切断至f2cm。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤(3)所述的贮藏温度为15 45°C，pH值为 4. 0 8· 5。
全文摘要
本发明公开了一株乳酸菌Lactobacillus parafarraginis ZH1及其应用。本发明所述乳酸菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.6079，保藏日期为2012年5月3日。本发明所述乳酸菌为格兰氏染色阳性杆菌，为葡萄糖异型发酵，耐酸，生长速度快，生育温域宽，高产苯甲酸和十六烷酸，可显著抑制青贮饲料的好氧变质。
文档编号A23K1/14GK102851232SQ20121019226
公开日2013年1月2日 申请日期2012年6月12日 优先权日2012年6月12日
发明者张建国, 刘秦华 申请人:华南农业大学