专利名称：一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的应用。
背景技术：
辣椒疫病是一种发生于辣椒上的毁灭性真菌病害，该病害可以导致不同地区的多种作物发病，引起大量的经济损失。辣椒疫病典型的症状特征植株被侵染后几天就发生根茎部组织腐烂直至大量植株死亡。到目前为止，生产中还没有对辣椒疫病很好的抗性品种。目前，国内外对辣椒疫病的防治中，化学防治占据重要的地位。化学防治成本较高且易污染环境，而且病原物易对杀菌剂产生耐药性甚至抗药性。所以生物防治逐渐成为人们所关注的焦点和热点。
发明内容
本发明的目的是提供一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的应用。本发明提供的哈茨木霉(Trichodermaharzianum) HNA-12,已于 2012 年 04 月 11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5989。哈茨木霉(Trichoderma harzianum) HNA-12CGMCC No. 5989 简称哈茨木霉 HNA-12。所述哈茨木霉HNA-12可用于抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)。所述哈茨木霉HNA-12可用于促进辣椒植株生长。所述哈茨木霉HNA-12可用于防控辣椒植株发生辣椒疫病。本发明还保护一种产品，它的活性成份为所述哈茨木霉HNA-12，所述产品为具有如下(I)至(3)中的至少一种功能的产品(I)抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；(2)促进辣椒植株生长；(3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。本发明还保护哈茨木霉HNA-12在制备产品中的应用；所述产品为具有如下(I)至
(3)中的至少一种功能的产品(I)抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；(2)促进辣椒植株生长；(3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
本发明还保护所述哈茨木霉HNA-12的孢子液或发酵物。所述孢子液具体可为5 X IO6个孢子/mL的孢子悬浮液。所述发酵物可为固体发酵物或液体发酵物。所述液体发酵物的制备方法具体如下收集哈茨木霉HNA-12孢子，接种到含有种子培养基的发酵罐中，发酵后得到浓度为2. 5X 108CFU/mL的液体发酵物(种子液)；所述发酵的条件为溶解氧浓度20%左右，温度28-30°C，搅拌速度200-250r/min，通气量为10-15L/min。所述种子培养基(pH6. 0-6. 5)由溶质和水组成；所述溶质在种子培养基中的浓度如下麦麸2g/100mL、葡萄糖I. 0g/100mL、硫酸镁O. 5g/100mL、磷酸二氢钾O. 3g/100mL、氯化钙 O. 3g/100mL。所述固体发酵物的制备方法具体如下将所述液体发酵物与固体培养基混合均匀 (每克混合物中含有I. 5 X IO6CFU哈茨木霉HNA-12)，然后进行发酵，然后风干至7_10%，得到固体发酵物；所述发酵的条件为温度28-30°C，空气相对湿度95-100%，培养基厚度5-7cm，培养时间5-7天。所述固体培养基是将麦麸和稻壳和水混合得到的，麦麸和稻壳的质量比为7 :3，固体培养基的含水量为70%左右，pH6. 0-6. 5 ;121°C灭菌30min。所述孢子液或所述发酵物的应用，为如下(I)至(3)中的至少一种(I)抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；( 2 )促进辣椒植株生长；( 3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。本发明还保护一种产品，它的活性成份为所述孢子液或所述发酵物；所述产品为具有如下(I)至(3)中的至少一种功能的产品(I)抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；( 2 )促进辣椒植株生长； (3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。本发明还保护所述孢子液或所述发酵物在制备产品中的应用；所述产品为具有如下(I)至(3)中的至少一种功能的产品(I)抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；( 2 )促进辣椒植株生长；( 3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。本发明提供的哈茨木霉HNA-12，经室内对峙拮抗实验、盆栽防治实验和大田防治试验发现，该菌株对多种病原菌(特别是辣椒疫病菌)具有良好的抑菌效果，并且利用木霉菌制剂防治植物病害具有对人畜无毒、产品无农药残留、不污染环境等优点。本发明在可持续农业发展中应用前景广阔。本发明的社会效益推广应用生物农药可以保护生态环境平衡发展，提高农产品品质及降低农产品中有害物质残留，增强农产品的市场竞争力，增加农民收入，进而增强农业生产的可持续性。本发明的经济效益推广应用生物制剂可减少化学农药的使用量，能提高疫病防治效果，降低防治成本；能有效实现农产品安全生产及显著降低农产品农药残留，提升农产品的经济附加值，扩大我国农副产品外销市场；推进绿色产业的发展，增加农民收入具有重要推进作用。
图I为菌株HNA-12的PDA平板培养形态。 图2为菌株HNA-12的分生孢子梗及分生孢子。图3为哈茨木霉HNA-12和辣椒疫病菌对峙培养72小时后的照片。图4为哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病菌的重寄生作用。图5为哈茨木霉HNA-12对辣椒疫病菌的重寄生作用。图6为哈茨木霉HNA-12挥发性代谢物对辣椒疫病菌在平板上的抑制作用。图7为哈茨木霉HNA-12非挥发性代谢物对辣椒疫病菌在平板上的抑制作用
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)马铃薯200g、葡萄糖15g、琼脂20g，蒸馏水1000ml ;121°C灭菌20min后备用。木霉菌半选择性培养基(TSM培养基)=MgSO4 (7H20) O. 2g、K2HPO4O. 9g、KCl O. 15g、NH4NO3L 0g、葡萄糖3. 0g、玫瑰红0. 15g、60%敌克松可湿性粉剂O. 3克、PCNB O. 2g、琼脂20g,蒸懼水950ml ;121°C灭菌20min备用。马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans):公众可以从中国农业大学获得；参考文献Daayf F，Adam L and Fernando WGD (2003) Comparative screening ofbacteria for biological control of potato late blight(strainUS-8)using invitro, detached leaves, and whole plant testing systems. Canadian Journal of PlantPathology, 25:276 - 284。辣椒疫病菌(Phytophthora capsici):公众可以从中国农业大学获得；参考文献Ahmed AS, Sanchez CP and Candela ME (2000) Evaluation of induction of systemicresistance in pepper plants(Capsicum annuum)to Phytophthora capsici usingTrichoderma harzianum and its relation with capsidiol accumulation. EuropeanJournal of Plant Pathology 106:817 - 824。辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum):公众可以从中国农业大学获得；参考文献刘丽云.刘晓林,刘志恒,等.辣椒根腐病菌生物学特性研究.沈阳农业大学学报,2007，38(1) :54-58。实施例中所用的辣椒品种均为中华红河北省定州市伯堡蔬菜良种繁育场。实施例中的孢子悬浮液都是收集孢子并重悬于水得到的。实施例I、哈茨木霉HNA-12的获得和鉴定一、菌株HNA-12的获得I、样品采集样品为采集自河南安阳辣椒农作物田间表层根际土壤。 用取土器材拨开田间3_5cm的表土层,将土壤连同植物的根系一起挖出，用聚乙烯塑料袋装好，带回实验室分离。2、菌株HNA-12的获得将粘附土壤的根系稍风干，轻拍根系，使粘附在上面的土壤脱落，用无菌水梯度稀释，分别吸取O. ImL稀释液滴入TSM培养基平板上，用灭菌的L形涂布棒涂布均匀，置于25-280C的恒温培养箱中培养3-4天。挑取形态似木霉菌的单菌落转接到PDA平板上进行纯化培养，镜鉴初步认定为木霉菌后编号，并保存到PDA斜面上。获得一株菌株，将其命名为HNA-12。二、菌株HNA-12的鉴定在PDA培养基上20°C培养5d的菌落直径为9. Ocm,生长速度很快，蛛丝状至羊毛状，白色，散生光下由于产孢表面呈绿色，背面无色，后期由于产孢量大使菌落呈稍绿色；多分枝的树状分生孢子梗形成相当疏松的菌丛；主枝宽4-5 μ m,侧枝多，形成金字塔形；侧生瓶梗可达5个，成拟轮状排列或单个沿小侧枝不规则排列；侧生瓶梗基部略缢缩，中部膨大，向上渐狭成瓶梗，5-7Χ3_3.5μπι;顶生的和不典型的瓶梗相对长且纤细，13-18X2. 5-3. 5μπι ;瓶梗大多以大角度在其载体上着生，有时略弯向顶端；瓶梗孢子呈球状分生孢子头，分生孢子近球形或倒卵形，壁光滑，淡绿色，2. 8-3. 2X2. 5-2. 8 μ m。图I为菌株HNA-12的PDA平板培养形态。图2为菌株HNA-12的分生孢子梗及分生孢子。三、菌株HNA-12的保藏通过步骤二的鉴定,菌株HNA-12属于哈茨木霉(Trichoderma harzianum)。哈茨木霉(Trichodermaharzianum) HNA-12,已于 2012 年 04 月 11 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5989。哈茨木霉(Trichoderma harzianum) HNA-12CGMCC No. 5989 简称哈茨木霉 HNA-12。实施例2、哈茨木霉HNA-12对病原菌的抑制作用实验组在同一 PDA平板上接种哈茨木霉HNA-12菌饼和病原菌菌饼进行对峙培养(两个菌饼中心的垂直距离为3cm，两个菌饼的直径均为5mm);以只接种病原菌菌饼的PDA平板作为对照组；25°C黑暗培养一定时间后测量病原菌的菌落直径(最长直径和最短直径的平均值)并计算抑制率。抑制率=(对照组病原菌的菌落直径-实验组病原菌的菌落直径)/对照组病原菌的菌落直径*100%。每种致病菌设置三个重复处理，对照设置三个重复处理，结果取平均值。病原菌分别为辣椒疫病菌、马铃薯晚疫病菌和辣椒根腐病菌。
结果见表1(三次试验的平均值)。哈茨木霉HNA-12和辣椒疫病菌对峙培养72小时后的照片见图3。结果表明，哈茨木霉HNA-12对各个病原菌均具有抑制作用。表I各个培养时间后哈茨木霉HNA-12对各个病原菌的抑菌率(％)
病原菌24小时 36小时 48小时 60小时 72小时 84小时
辣椒疫病菌20 5 42Λ 4 Γ6 56^7 θθΓδ δΓ
马铃薯晚疫病菌 ΙδΓδ 42 5 54 5 59 8 69 2 Wl 辣椒根腐病菌 5Λ 3 Τ3 50 5 6573 69 7 72 5实施例3、哈茨木霉HNA-12的温室生防效果实验辣椒种子经55°C温汤浸种30min后催芽，挑选长势一致的发芽种子播种于培养钵，每钵20粒；在温室中(25-30°C)培养直至辣椒植株长出4片真叶，分组进行如下操作(每组3个培养钵)实验组每株辣椒接种IOmL哈茨木霉HNA-12孢子悬浮液(孢子浓度为5 X IO6个/mL)和IOmL辣椒疫病菌孢子悬浮液(孢子浓度为5 X IO6个/mL);接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤；对照组每株辣椒接种IOmL辣椒疫病菌孢子悬浮液(孢子浓度为5 X IO6个/mL)；接种方式为将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤。接种孢子悬浮液30天后调查发病率(辣椒疫病分级调查标准见表2)并计算病情指数。表2辣椒疫病分级调查标准
病级分级标准 ~~O健康，根茎处无症状，腐烂面积小于1% ；
"I根茎基部有水浸状病斑，或暗绿小病斑，腐烂部分环绕茎周1-25% ；
2根茎基部腐烂褐色，腐烂部分环绕茎周26-50% ；
I根茎基部腐烂褐色至深褐色，腐烂部分环绕茎周51-75%，稍有缢缩;
~根茎基部腐烂深褐至黑色，腐烂部分环绕茎周76-89%，明显缢缩;
~根茎基部腐烂黑色，腐烂部分环绕茎周90%以上，严重缢缩。
== ——— X 200
权利要求
1.哈茨木霉(Trichodermaharzianum) HNA-12，它的保藏编号为 CGMCC No. 5989。
2.权利要求I所述哈茨木霉HNA-12在抑制病原菌中的应用；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)。
3.权利要求I所述哈茨木霉HNA-12在促进辣椒植株生长中的应用。
4.权利要求I所述哈茨木霉HNA-12在防控辣椒植株发生辣椒疫病中的应用。
5.一种产品，它的活性成份为权利要求I所述哈茨木霉HNA-12 ;所述产品为具有如下(I)至(3)中的至少一种功能的产品 (O抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)； (2)促进辣椒植株生长； (3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
6.权利要求I所述哈茨木霉HNA-12在制备产品中的应用；所述产品为具有如下(I)至(3)中的至少一种功能的产品 (O抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)； (2)促进辣椒植株生长； (3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
7.权利要求I所述哈茨木霉HNA-12的孢子液或发酵物。
8.权利要求7所述孢子液或发酵物的应用，为如下(I)至(3)中的至少一种 (O抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)； (2)促进辣椒植株生长； (3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
9.一种产品，它的活性成份为权利要求7所述孢子液或发酵物；所述产品为具有如下(I)至(3)中的至少一种功能的产品 (O抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)； (2)促进辣椒植株生长； (3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。
10.权利要求7所述孢子液或发酵物在制备产品中的应用；所述产品为具有如下(I)至(3)中的至少一种功能的产品 (O抑制病原菌；所述病原菌为如下微生物中的至少一种马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infenstans)、辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)和辣椒根腐病菌(Fusarium oxysporum)；(2)促进辣椒植株生长；(3)防控辣椒植株发生辣椒疫病。全文摘要
本发明公开了一株哈茨木霉菌株及其在防控辣椒疫病中的应用。本发明提供的哈茨木霉(Trichoderma harzianum)HNA-12，保藏号为CGMCC No.5989。所述哈茨木霉HNA-12可用于抑制病原菌、促进辣椒植株生长、防控辣椒植株发生辣椒疫病。本发明在可持续农业发展中应用前景广阔。
文档编号A01N63/04GK102719364SQ20121020769
公开日2012年10月10日 申请日期2012年6月18日 优先权日2012年6月18日
发明者姚彦坡, 李燕, 王 琦 申请人:中国农业大学