专利名称：水稻抗病基因OsLYP6及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一种水稻抗病基因及其应用，特别涉及水稻抗病基因0SLYP6及其应用。
背景技术：
植物在自然界中受到微生物等病原体侵袭，可在细胞水平上启动快速的早期防御机制，即天然免疫反应(innate immune) (Iriti and Faoro, 2007 . Iriti, M.,and Faoro, F. Review of innate and specific immunity in plants and animals.Mycopathologia. 2007，164，57-64)。天然免疫反应是植物针对病原侵袭产生的基础防御反应，主要过程包括对病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)，即病原体细胞表面成分的识别(主要涉及PAMPs与PAMP受体)；将入侵信号由胞外向胞内传递，启动宿主细胞信号传导；进而影响下游抗病基因的表达，最终对病原产生防御(Boiler and He，2009 Boiler，T.，and He，S. Y. Innate immunity in plants:an arms race between pattern recognition receptors in plants and effectors inmicrobial pathogens. Science，2009，324，742-744; Cui et al.，2009 Cui, H.，Xiang, T. ， and Zhou, J.M. Plant immunity: a lesson from pathogenic bacterialeffector proteins. Cell Microbiol. , 2009，11，1453-1461)。植物PAMPs主要包括脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖(peptidoglycan，PGN)、鞭毛蛋白(flagellin，flg22)、延伸因子 EF_Tu、真菌细胞壁成分(几丁质 / 壳聚糖寡糖)等(Gust et al.，2007 Gust，A. A.，Biswas，R.，Lenz,H. D.，Rauhut, T.，Ranf, S.，Kemmerling，B.，Gotz，F.，Glawischnig，E.，Lee,J. ， Felix, G. ， and Nurnberger, T. Bacteria-derived peptidoglycans constitutepathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity inArabidopsis. J Biol Chem. ， 2007， 282， 32338-32348; Zipfel and Robatzek， 2010Zipfel， C. ， and Robatzek, S. Pathogen-associated molecular pattern-triggeredimmunity: veni，vidi. Plant Physiol, 2010，154，551-554)。当这类物质作用于植物细胞表面，可被相应的受体分子感应，并通过下游信号传导途径，引发细胞内一系列免疫应答(Kishi-Kaboshi et al.，2010 Kishi-Kaboshi，M.，Okada, K.，Kurimoto, L，Murakami，S.，Umezawa, T.，Shibuya, N.，Yamane，H.，Miyao，A.，Takatsuji，H.，Takahashi， A. ， and Hirochika， H. A rice fungal MAMP-responsive MAPK cascaderegulates metabolic flow to antimicrobial metabolite synthesis. Plant J .，2010，63，599-612)。因此，对外源PAMP的感应与识别是植物天然免疫反应的重要起始步骤，对植物细胞中感应PAMP的受体分子及其作用机制进行研究，是植物免疫反应系统研究的重要方面(Kishimoto et al.，2010 Kishimoto, K.，Kouzai, Y.，Kaku, H.，Shibuya,N.，Minami, E.，and Nishizawa, Y. Perception of the chitin oligosaccharidescontributes to disease resistance to blast fungus Magnaporthe oryzae in rice.Plant J . ， 2010， 64， 343-354)。PAMP受体多属于跨膜激酶受体，如flg22受体FLS2、EF-Tu受体EFR，它们可以识别病原菌表面分子，通过激活自身激酶活性，将引起胞内的信号传递。此外，在真菌PAMP受体的研究中，还发现一些LysM蛋白参与了几丁质类PAMP的识别反应过程(Kaku et al.,2006 Kaku, H. , Nishizawa, Y. , Ishii-Minami, N. , Akimoto-Tomiyama, C. , Dohmae,N. , Takio, K. , Minami, E. , and Shibuya, N. Plant cells recognize chitinfragments for defense signaling through a plasma membrane receptor. Proc NatlAcad Sci U S A ， 2006， 103， 11086-11091; Miya et al. ， 2007 Miya, A. ， Albert,P., Shinya, T. , Desaki, Y. , Ichimura, K. , Shirasu, K. , Narusaka, Y. , Kawakami,N. , Kaku, H. , and Shibuya, N. CERKl, a LysM receptor kinase, is essential forchitin elicitor signaling in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104,19613-19618)。LysM蛋白，即含有LysM (lysin motif)结构域的蛋白质。LysM结构域是肽聚糖(peptidoglycan, PGN)结合结构域,最早发现于细菌中的肽聚糖裂解酶中，其功能是识别细菌细胞壁中的肽聚糖成分。LysM蛋白广泛存在于古细菌之外的各物种(Buist et al. , 2008 Buist, G. , Steen, A. , Kok, J. , and Kuipers, 0. P. LysM, a widelydistributed protein motif for binding to (peptido)glycans. Mol Microbiol .,2008，68，838-847)。LysM蛋白的功能可能涉及植物病原防御反应，细菌中LysM蛋白主要是对细菌肽聚糖进行识别与结合，但植物中LysM蛋白主要识别结合的PAMP为真菌细胞壁
成分-几丁质及其寡糖分子(de Jonge et al. , 2010 de Jonge, R., van Esse, H. P.,
Kombrink, A. , Shinya, T. , Desaki, Y. , Bours, R. , van der Krol, S. , Shibuya, N.,Joosten, M. H. , and Thomma, B. P. Conserved fungal LysM effector Ecp6 preventschitin-triggered immunity in plants. Science , 2010, 329, 953-955; Iizasa etal. , 2010 Iizasa, E. , Mitsutomi, M. , and Nagano, Y. Direct binding of a plantLysM receptor-like kinase, LysM RLKI/CERKI, to chitin in vitro. J Biol Chem.,2010，285，2996-3004)。近年研究发现植物蛋白的LysM结构域还可识别结合其他PAMP成分(如细菌肽聚糖)。水稻(Oryza sativa L.)是极为重要的粮食作物，也是重要的单子叶模式植物，细菌与真菌导致的病害严重制约水稻的产量，因此研究水稻与病原菌的相互作用及水稻感应病原菌入侵的机理，对于水稻功能基因组学及水稻育种都具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水稻抗病基因及其应用。本发明的再一个目的在于提供一种抗病水稻的培育方法。本发明所采取的技术方案是
基因位于6号染色体上，基因座位号为L0C_0s06gl0660 (MSU登陆号)，对应的RAP登陆号为0s06g0208800。其全长基因组序列约为3189bp，包括5个外显子，4个内含子。其cDNA全长1230bp，编码409个氨基酸。编码的蛋白质序列如SEQ ID NO :3所示,存在有LysM (Lysin motif)结构域。
一种培育抗病水稻品种的方法，包括将水稻抗病基因0sLYP6或其cDNA转入水稻基因组中，并使其过表达；或将水稻抗病基因0sLYP6或其cDNA转入载体中，使用载体转染水稻细胞，并使水稻抗病基因0sLYP6或其cDNA过表达。本发明的有益效果是
本发明方法利用反转录PCR技术从水稻中克隆到了一个含lysin motif (LysM)结构域蛋白的基因0sLYP6,证实0sLYP6参与了水稻对病原菌及真菌的防御反应，是一种重要的参与水稻天然免疫反应的抗病基因。本发明方法利用转基因技术，获得的RNA干涉及过表达转基因水稻，发现0sLYP6基因的功能缺失可导致水稻对致病菌(水稻白叶枯病菌Obo-gcM)、细菌性条斑病菌Obc-gdlV)、水稻稻瘟病株i/Z-A)抵抗力的下降，而AsZ7/ 过表达转基因水稻则表现出明显抗性。
图I是0sLYP6基因对稻白叶枯病抗性的影响 图2是0sLYP6基因对细菌性条斑病菌Obc-gdlV)抗性的影响 图3是0sLYP6基因对水稻稻瘟病株i/Z-A抗性的影响图。
具体实施例方式下面结合试验，进一步说明本发明。培养基和营养液
LB培养基*
10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，调节pH至7.0，定溶至I L，在I. 034X IO5Pa高压下蒸气灭菌20 min，加入I. 5%的琼脂粉即为LB固体培养基，室温保存。培养基
5 g蛋白胨,1 g酵母提取物，5 g牛肉浸膏，5 g鹿糖,0.24 g无水硫酸镁,调节pH至7. 0，加入去离子水至总体积为I L，加I. 5%的琼脂粉可制成固体培养基。培养基
含有 NH4NO3 (1650 mg/L), KNO3 (1900 mg/L), CaCl2 2H20 (440 mg/L), MgSO4 7H20(370 mg/L), KH2PO4 (170 mg/L), KI (0. 83 mg/L), H3BO3 (6. 2 mg/L), MnSO4 4H20 (22. 3mg/L), ZnSO4 7H20 (8. 6 mg/L), Na2MoO4 2H20 (0. 25 mg/L), CuSO4 5H20 (0. 025 mg/L),CoCl2 6H20 (0. 025 mg/L), Na2EDTA 2H20 (37. 3 mg/L), FeSO4 7H20 (27. 8 mg/L)，肌醇(100 mg/L)，烟酸(0. 5 mg/L),盐酸批卩多辛(0. 5 mg/L),盐酸硫胺素(0. I mg/L),甘氨酸(2mg/L)，蔗糖(30%)，用NaOH调pH至5. 8，加入组培用琼脂粉(8 g/L)即可制成固体MS培养基。1/2 MS培养基除蔗糖含量不减半外，其余成分均为原来的一半。’s营养液
四水硝酸韩945 mg,硝酸钾506 mg,硝酸铵80 mg,磷酸二氢钾136 mg,硫酸镁493 mg,铁盐溶液2. 5 mL，微量元素液5 mL，溶于800 mL水中，调节pH至6. 0后定容至I L。
权利要求
1.水稻抗病基因OsLYP6，全长3189bp，其序列如SEQID N0:1所示。
2.水稻抗病基因OsLYP6的cDNA，全长1230bp，编码409个氨基酸，其序列如SEQ IDNO 2所示。
3.水稻抗病基因OsLYP6编码蛋白，其序列如SEQID NO:3所示。
4.水稻抗病基因OsLYP6或其cDNA在培育抗病水稻中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于抗病水稻为抗水稻白叶枯病、水稻细条病、水稻真菌稻瘟病水稻中的至少一种。
6.一种培育抗病水稻品种的方法，包括将水稻抗病基因OsLYP6或其cDNA转入水稻基因组中，并使其过表达；或将水稻抗病基因OsLYP6或其cDNA转入载体中，使用载体转染水稻细胞，并使水稻抗病基因OsLYP6或其cDNA过表达。
全文摘要
本发明公开了水稻抗病基因OsLYP6及其应用。OsLYP6基因位于6号染色体上，基因座位号为LOC_Os06g10660(MSU登陆号)，对应的RAP登陆号为Os06g0208800。其全长基因组序列约为3189bp，包括5个外显子，4个内含子。其cDNA全长1230bp，编码409个氨基酸。OsLYP6编码的蛋白质序列如SEQIDNO3所示，存在有LysM(Lysinmotif)结构域。本发明方法利用反转录PCR技术从水稻中克隆到了一个含LysM结构域蛋白的基因OsLYP6，证实OsLYP6参与了水稻对病原菌及真菌的防御反应，是一种重要的参与水稻天然免疫反应的抗病基因。该基因有望应用于水稻抗病品种的培育。
文档编号A01H5/00GK102747089SQ20121022623
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者刘兵, 敖英, 王宏斌, 王金发 申请人:中山大学