专利名称：一种调控叶片衰老和多重抗逆性的转录因子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及ー种调控叶片衰老和多重抗逆性的转录因子与应用。
背景技术：
植物衰老是植物个体内部一系列程序化的渐行性衰退，最終走向死亡的过程。叶片衰老是植物生长发育的组成部分，构成了植物叶片发育的最后ー个阶段，被认为是程序性细胞死亡(PCD)的ー种，以依赖叶龄的方式进行，并由诸多环境因素诱导，受生长发育时期复杂的内、外因素的相互作用影响。因此叶片衰老并不是被动的过程，而是ー个主动调控的过程。叶片衰老过程中，细胞结构、生理代谢、基因表达方面都经历一系列有序的变 化。另外，由于叶片衰老过程中涉及营养物质的转运和再利用，对整个植株来说，叶片衰老是植物健康生长，培育优良后代的关键(Buchanan-Wollaston V等，Plant Biotechnol J,1 (1):3-12,2003 ；Lim PO 和 Nam HG 等，Curr Top Dev Biol, 67:49-83，2005)。植物激素对植物发育和响应环境具有极其重要的作用。在众多植物激素中，细胞分裂素(CK)对植物叶片衰老的延缓以及こ烯(ET)对叶片衰老的促进作用是十分明确的，而且在不同物种中都得到了相对一致的結果。而其他激素，像脱落酸(ABA)，赤霉素(GA)，茉莉酸甲酯(MeJA)，水杨酸(SA)等都对叶片衰老有着不同程度的影响。尽管取得了一定的进展，但是其调控的复杂网络系统，其作用的相互联系，人们对其具体发生机理还是知之甚少。茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)主要是參与植物防御反应的激素，但是其在叶片衰老过程中也有一定的作用。对离体叶片外施JA可以加速衰老进程，但是在JA的关键基因突变体coi7中并没有这样的现象。Buchanan-Wollaston等检测发现,突变体coi7并不能明显地影响叶片衰老的表型，其中12%的叶片衰老相关基因在中并没有发生变化。对于SA与衰老的关系，Morris发现在叶片衰老过程中植物体内的SA含量在衰老叶片中存在着急剧的上升，但是在未衰老叶片中并不存在这样的现象。此后通过对SA信号途径相关突变私NahG,pad4和/ /的分析,发现这些突变体中衰老标志基因SAGs表达有所改变(MorrisK等，Plant Journal, 23 :677_685，2000)。SA对衰老的作用可能是影响了叶片衰老进程中从衰老向细胞死亡变化的进程。WRKY转录因子因其N端含有由WRKYGQK组成的高度保守的氨基酸序列而得名。在拟南芥中已发现74个WRKY成员，而水稻中则发现了 105个完整的WRKY成员。研究发现，WRKY结构域及其专ー结合的(T) (T)TGAC (C/T)序列(又称W-box)更多地存在于与抗病、损伤、衰老相关基因和水杨酸诱导基因的上游调控区域。已有大量证据表明，WRKY与上述几种生物和非生物逆境激发的应激反应关系密切(Eulgem T等，EMBO J，18 =4689-4699,1999 ；Chen C等，Plant Physiol，129 :706_716，2002)。此外，在果实成熟、种子表皮毛发育、蔗糖信号传导及赤霉素信号传导等过程中均发现了 WRKY基因的表达(Johnson CS等，PlantCell, 14 :1359-1375,2002 ；Sun C 等，Plant Cell，15 :2076_2092，2003)。
Dong等研究了 72个拟南芥的WRKY转录因子在植物抗病方面的作用，发现其中的49个会受到病原菌syringae pv tomato 0 ^)和SA的诱导而产生表达变化，进而调节相关基因的表达来參与拟南芥的抗病过程。作为系统获得性抗性SAR的关键基因似况7 (Cao WH 等，Plant Physiol，143 :707_719，2007)、/^7 的启动子中都含有 W_box(Rushton PJ 等，Plant Mol Biol, 29:691-702,1995)。通常 NPRl 在植物中的表达水平很低，但用病原体感染或外施SA后，其表达量增加2-3倍(Cao WH等，Plant Physiol, 143 707-719，2007)，同时抗多种病原体的能力显著增加。DNA序列分析表明NPRl启动子中28个核苷酸的序列内含有3个W-box。这些W-box是WRKY蛋白结合必需的，如果其中的某个核苷酸被替换，WRKY蛋白就不再与之结合，其SA诱导的表达即完全消除，此时，植物对病原体的反应变得非常敏感。另有研究发现WRKY18、WRKY59、WRKY70等8个基因是NPRl的直接目标參与了植物的SAR过程，显示了 WRKY參与SAR的机理的复杂性(Wang D等，Science, 308 1036-1040，2005 ；ffang D 等，Plos Pathogens, 2 :1042-1050，2006)。/切7 基因启动子驱动的G浴基因的表达及Northern印迹都表明受WRKY6的激活，且在防卫反应诱导条件下这种激活更快、更强(Robatzek S等，Genes Dev, 16 :1139_1149，2002)。WRKY在信号交叉和对话中·也有重要作用，Li等发现，在拟南芥中，AtWRKY70受SA的诱导，而JA和こ烯则没有诱导作用；相反，用JA处理叶片后，AtffRKY70不表达而AtCORl则被大量诱导；同样，在转基·因植株中，SA的合成及其对WRKY的诱导作用消失；在过表达AtWRKY70的植株中，与SAR相关的基因祝-之和高水平表达，植株的抗病性提高，而JA诱导的ACKZtV基因则被抑制，但体内SA、JA和こ烯的含量却没有明显的变化(Li J等，Plant Cell, 16 =319-331,2004 ；Abuqamar S 等，Plant Journal, 48 :28-44, 2006)。在拟南芥中，除 AtWRKY70 外，AtWRKY25和AtWRKY33可能也是平衡植物SA、JA防卫信号途径的ー个重要决定因子(Li J等，PlantCell, 16 :319-331,2004 ；Zheng XL 等，Plant Cell Reports, 26 :1195-1203, 2007)o 此外在叶片衰老方面，參与植物抗病的WRKY因子的部分成员也參与了这个生理过程，说明WRKY家族的功能具有多元化的特征。Murray等(Murray SL等,MPMI,20 :1431-1438, 2007)研究表明，AtffRKY53是ー个抗病性相关的重要调控因子，其功能缺失突变体更易受到的感染，反而对青枯菌表现出较强的耐受カ(Hu J等，PloS 0NE，3 :e2589，2008)，但是也有证据表明AtWRKY53是ー个叶片衰老早期阶段表达的转录因子(Hinderhofer K等，Planta，213 469-473,2001 ；Miao Y 等，Plant Mol Biol，55 :853_867，2004)。同样，病原防御转录因子AtffRKY6和AtWRKY70也发现參与叶片衰老过程。目前对AtWRKY46的研究基本上是一片空白，对于WRKY家族调控植物叶片衰老、多重抗逆性的研究也为数不多，大多仅停留在生理观察阶段，人们对其遗传和分子机制也几乎ー无所知。因此借助拟南芥模式生物，挖掘WRKY家族中调控植物叶片衰老、多重抗逆性的重要基因资源，并应用到农作物性状改良上具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够调控叶片衰老和多重抗逆性的转录因子与应用。本发明提供ー种植物转录因子WRKY46蛋白，来源于拟南芥、杨树等物种，见图2所不,但不局限于这些物种,包括与拟南芥thaliarm)キAtWRKY46 (NCBI基因登录号为AT2g46400，氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示)的同源性高于30%的类似蛋白。
本发明所提供的拟南芥转录因子WRKY46蛋白，是SEQ ID NO: 2所示氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列经过ー个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加，且具有与SEQ ID NO: 2的氨基酸残基序列相同活性的蛋白质。拟南芥转录因子WRKY46的编码基因，是下列核苷酸之一
(I)SEQ ID NO: I 所示的 DNA 序列。(2)编码SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的多核苷酸。SEQ ID NO: I所示的DNA序列由1222个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第73位至960位碱基；SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列由295个氨基酸残基组成。本发明还包括所述植物转录因子WRKY46蛋白的编码基因的表达载体。 本发明还包括含有所述植物转录因子WRKY46表达载体的细胞系。本发明还包括所述植物转录因子WRKY46蛋白的应用，包括将含有所述的WRKY蛋白的编码基因的表达载体转入水稻或玉米作物，以过表达该蛋白从而促进发育并增强多重抗逆性。还包括通过抑制WRKY46编码基因的表达以延缓衰老增加产量潜力。转有本发明蛋白的编码基因的表达载体和细胞系均属于本发明的保护范围。本发明的蛋白在延缓叶片衰老、提高作物产量及多重抗逆性方面有重要作用。
图I为AtWRKY46和其它拟南芥WRKY家族转录因子系统发生树。图2为植物WRKY46的系统进化树。图3为短日照生长45天野生型拟南芥和突变体材料在SA或者水处理后的表型。图4为野生型拟南芥和突变体材料的离子泄露率分析。图5为野生型拟南芥和突变体材料的緑色叶片面积比例统计。图6为野生型拟南芥和突变体材料的抗旱性比较。
具体实施例方式实施例I、拟南芥转录因子AtWRKY46插入突变体材料的获得
I.I拟南芥材料准备
取在16h L/8h D光照，23°C条件下培养30天拟南芥Col-O的叶片。1.2 RNA 提取
取拟南芥材料约0. lg。液氮充分研磨后，转移到1.5ml离心管，加Iml TRIzol(R) ( invitrogen公司)，混勻后,室温放置15分钟,加0. 2ml氯仿异戍醇(24:1),剧烈摇动15秒后室温放置5分钟，13000rpm, 4°C离心15分钟。取上清液并加入等体积异丙醇，小心混匀，室温放置15分钟，13000rpm, 4°C离心15分钟。70%こ醇洗涤沉淀，室温干燥15分钟。溶解于适量的经0. 1% DEPC处理过的ddH20水中，贮存于_80°C备用。I. 3 cDNA第一链合成和反转录PCR
采用上海申能博彩生物技术公司(SHBC)的cDNA第一链合成试剂盒，按照操作指南将总RNA反转录成cDNA。反应体系和反应条件分别为2呢制备的总RNA，0. 5W Rnaseinhibitor,加 DEPC 处理过的去离子水至 8. 5Ml, 2Ml 的 Oligo (dT) 18 primer. 65°C, 5min,室温放置 IOmin, 13000rpm 简短离心 5s。再依次加入 4Ml 5 XFirst-Strand buffer,0.51^1 RNase Inhibitor, 21^1 IOOmM DTT, 21^1 dNTP, ml MMLV Reverse Transcriptase。小心混匀；37°C反转录I小时，90°C 5分钟；冰上冷却；130001^111短暂离心5秒钟，存放于-20°C待用。I. 4 AtffRKY46插入突变体材料的鉴定
根据 TAIR (http://www. arabidopsis. org/)上提供的 AtWRKY46 全长 CDS 序列及插入位点，设计了三条引物 AtWRKY46-LB (5，GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT 3’ (SEQ ID NO: 3))、AtWRKY46-LP :(5’ TCTGTCGATTCCAACAAAACC 3’ (SEQ ID NO: 4))和 AtWRKY46_RP : (5，AAGCCAATTTTTATCCATCGG 3’(SEQ ID NO: 5))作为 PCR 反应的引物。PCR 反应体系为 50P1，反应条件为94°C预变性5min，94°C变性40s，55°C复性40s，72°C延伸70s，循环35次，72°C
充分延伸5min。将所得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，得到纯合突变体材料。实施例2 :拟南芥转录因子AtWRKY46功能分析
2.I序列比较分析
用Genedoc软件分析了 AtWRKY46与其他拟南芥WRKY家族蛋白的同源性。分析结果表明AtWRKY46具有典型保守的WRKY domain,如图I所示，使用MEGA软件建立了 AtWRKY46同其他拟南芥WRKY家族蛋白的系统发生树，结果表明AtWRKY46属于WRKY-III亚家族，与AtWRKY55、AtWRKY41、AtffRKY53和AtWRKY30亲缘关系最近。在水稻、玉米等植物中也存在与AtWRKY46同源性较高的蛋白，如0sWRKY64与AtWRKY46有很高的同源性。图2展示了植物中WRKY46蛋白的系统进化关系。2. 2.突变体叶片衰老指标分析
2.2. I拟南芥基质培养
基质组分蛭石黒土 珍珠岩9 : 3 : 0. 5 营养液组分
权利要求
1.ー种植物转录因子WRKY46蛋白，来源于拟南芥、杨树物种，包括与拟南芥中AtffRKY46的同源性高于30%的类似蛋白。
2.一种拟南芥转录因子AtWRKY46编码基因，其特征在于是下列核苷酸之一 (1)SEQ ID NO: I 所示的 DNA 序列； (2)编码SEQID NO: 2所示氨基酸序列的多核苷酸。
3.根据权利要求2所述的拟南芥转录因子AtWRKY46编码基因，其特征在于该基因的编码框为自5’端第73位到第960位的DNA序列。
4.含有权利要求I所述植物转录因子WRKY46蛋白的编码基因的表达载体。
5.含有权利要求4所述植物转录因子WRKY46表达载体的细胞系。
6.权利要求I所述植物转录因子WRKY46蛋白的应用，其特征在于，将含有权利要求I的WRKY46蛋白的编码基因的表达载体转入水稻或玉米作物，以过表达该蛋白从而促进发育并增强多重抗逆性。
7.权利要求I所述植物转录因子WRKY46蛋白的应用，其特征在于，通过抑制WRKY46编码基因的表达以延缓衰老增加产量潜力。
全文摘要
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种调控叶片衰老和多重抗逆性的转录因子与应用。本发明所提供的植物WRKY46蛋白，来源于拟南芥、杨树等物种(见图2所示)，但不局限于这些物种，包括与拟南芥中AtWRKY46(氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)的同源性高于30%的类似蛋白。拟南芥WRKY46蛋白的编码基因，是下列核苷酸序列之一(1)序列表中的SEQIDNO:1；(2)编码序列表中SEQIDNO2氨基酸序列的多核苷酸。本发明可为延缓叶片衰老、提高作物产量及多重抗逆性方面提供了蛋白资源和方法。
文档编号A01H5/00GK102775483SQ20121024198
公开日2012年11月14日 申请日期2012年7月13日 优先权日2012年7月13日
发明者张建建, 梁宁菁, 蒯本科, 高炯 申请人:复旦大学