专利名称：一株枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
香蕉枯萎病是由尖孢铼刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)侵染引起的一种毁灭性病害，是香蕉生产的毁灭性土传病害。病原菌从受伤的根茎侵入，通过維管束向假茎及叶部蔓延，堵塞木质部导管，直至植株枯萎死亡。香蕉枯萎病菌是土壤习居菌，其厚垣孢子能够在土壌中存活8 10年。目前对枯萎病的防治还没有一种有效的化学农药，而且长期使用化学农药对环境 和人类健康造成严重威胁。与化学防治法相比，利用拮抗菌防治植物病害具有对环境友好、成本低、病原菌不易产生抗药性等优点，是未来病害防治的方向。尽管人们已经发现了大量拮抗细菌，但目前所分离到的细菌还远不能满足农业生产发展的要求。芽孢杆菌能产生耐热、抗逆的芽抱，有利于菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖。国内外已有生防芽孢杆菌用于防治豆类、麦类、棉花和花生等根部病害及防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的细菌和真菌等叶部病害的报道。
发明内容
本发明所要解决的ー个技术问题是提供ー株枯草芽孢杆菌。本发明所提供的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5953。该 菌种已于2012年04月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCOo本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLGOlO在营养琼脂(NA)培养基上呈乳脂色不透明，表面干燥，有皱褶突起，边缘不整齐。显微镜下单个菌体呈杆状，两端钝圆，革兰氏染色后，染色均匀，并可见细胞中被染成蓝紫色芽孢。本发明所要解决的另一个技术问题是提供ー种杀菌剂。本发明所提供的杀菌剂，它的活性成分是上述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) BLGOIOo所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLGOlO具体可为分生孢子或/和菌丝体。所述杀菌剂具体可用于防治由尖孢铼刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp. cubense)引起的植物病害。所述植物病害具体可为香蕉枯萎病。本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种防治香蕉枯萎病的方法。本发明所提供的防治香蕉枯萎病的方法，包括采用I X 108cfu/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953菌悬液浇灌香蕉苗基部的步骤。实验证明，以lX108cfu/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLGOlOCGMCCNo. 5953菌悬液浇灌香蕉苗基部，对香蕉枯萎病的防病效果达81. 4%。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953在低浓度下能够有效抑制香尖孢铼刀菌的生长，对香蕉枯萎病的防治具有重要意义。菌种名称枯草芽孢杆菌拉丁名Bacillussubtilis菌株编号BLG010保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号 保藏日期2012年04月06日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 5953下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
图I 为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 发酵滤液对尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)菌丝抑制作用。A 为未加入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 发酵滤液的PDA上的尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)菌丝。B 为加入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 发酵滤液的PDA上的尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)菌丝。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的NA培养液牛肉浸膏0. 3%，酵母浸膏0. 1%，蛋白胨0. 5%，葡萄糖
I.0%，用蒸馏水定容至IOOOmL ;其pH7. O。其中的百分含量均为质量百分含量。下述实施例中的NA培养基是在上述NA培养液中加入琼脂得到的固体培养基。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。实施例I、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010的分离及鉴定I、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) BLG010 的分离从中国海南省香蕉种植地选择枯萎病重发田中发病田块的香蕉植株，采集根部土样。把土壤样本风干，过筛后称取IOg放入装有90mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分振荡，静置IOmin后，按梯度浓度法稀至I X 10'I X 10'IX 1(T5。各梯度稀释液于80°C水浴加热20min，取IOOul涂布于营养琼脂(NA)分离培养基上。30°C恒温培养2d，根据菌落顔色、形态、干湿度、透明度、边缘等特征挑取有代表性的单菌落纯化，纯化后经革兰氏染色和芽孢染色，菌体杆状、产芽孢等特征选取芽抱杆菌转入NA斜面培养基保存，作为待测菌株。拮抗初筛、复筛拮抗菌制备尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)孢子液(约2.0X105个/mL)，以培养基的1/1000比例吸取孢子悬浮液至PDA培养基混匀后倒至四方形大板。均匀点接待测菌，28°C下培养4天，观察有无抑菌圏。复筛时，在培养4天的香蕉枯萎病菌的菌落边缘打取直径为5mm的菌块，将其移至空白PDA平板中央。然后在距中心5cm处划直线接种供试拮抗细菌。每皿接种2个供试菌株，以只接种指示菌作为对照28°C培养6d。连续观察记录各拮抗菌菌落长度、宽度及抑菌带宽度，重复4次，最终计算抑制率。最终得到枯草芽孢杆菌(BaciIIus subtilis) BLGO10。2、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) BLG010 的鉴定(I)形态学鉴定
将分离纯化到的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010菌株接种于NA培养基上，30°C培养48h，观察菌落形态。另取培养48h的菌落，适当稀释后于显微镜下观察。结果显示枯草芽孢杆菌(BaciIIus subtilis)BLG010菌株在NA培养基上呈乳脂色不透明，表面干燥，有皱褶突起，边缘不整齐。显微镜下单个菌体呈杆状，两端钝圆，革兰氏染色后，染色均匀，并可见细胞中被染成蓝紫色芽抱。(2)分子鉴定枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) BLG010的16S rDNA全序列如序列表中的序列I所示，全长为1429bp。枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis) BLG010已于2012年04月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5953。实施例2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953 对尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)菌丝的拮抗作用I、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 发酵滤液对病原菌丝抑制作用分别在熔融态的PDA培养基中加入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLGOIOCGMCC No. 5953发酵滤液(按照下述步骤2的方法进行制备)摇匀制平板。倒板前在培养皿中央至一无菌的载玻片，倒入培养基刚好没过载玻片，将直径5mm尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)菌块接至载玻片上，28°C培养5d后将载玻片取出直接置于共聚焦显微镜下镜检各处理的菌丝形态。每处理重复3次。显微观察发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953的发酵滤液对尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4 )菌丝的生长有较强的抑制作用，菌丝破裂，消解(图I)。表明枯草芽孢杆菌(Bac i I Iussubtilis) BLG010CGMCC No. 5953发酵滤液能明显抑制尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)菌丝的生长。2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 对尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)分生孢子萌发的抑制作用本实验采用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953发酵上清液测试枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953的代谢物对尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)分生孢子萌发的抑制作用。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953发酵上清液按照如下方法制备将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953接种到NA培养基，30°C培养2-3天，待其产生足量的分生孢子，用无菌钼环刮取其孢子2 — 3环接种于250ml三角瓶(装有50ml NA培养液)内，置可控温摇床上，在30°C条件下，200rpm/min (旋转半径13mm)恒温振荡培养36h ;然后在无菌条件下按照10% (体积百分含量)的接种量接入500ml三角瓶内(装有200ml LB培养液)；接种后的摇瓶在31°C条件下，以240rpm/min (旋转半径13mm)的转速振荡培养36小时；此时菌株已在发酵液中产生高浓度的抑菌活性代谢产物。将以上步骤获得的发酵液5000rpm/min离心10_15min沉降菌丝体及固形物,上清液用
0.22 u m的无菌微孔滤膜过滤,收集滤液(该滤液中无枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLGOIOCGMCC No. 5953)，该滤液即为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCCNo. 5953发酵上清液。取600 ill F0C4孢子液悬浮液(I X 107cfu/mL)，分装至2ml离心管中。再分别往各离心管中加入200 ii I枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953发酵上清液，分别与病原菌菌液混匀置28°C恒温培养，以加入无菌水为对照。每处理重复3次，统计计算拮抗芽孢杆菌12h和24h对香蕉枯萎病病原菌分生孢子萌发的抑制率。
对照萌发率-处理萌发率一抱子明发抑制率对照荫发率ー100%结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953发酵滤液在12小时对F0C4分生孢子萌发的抑制率是89. 25%，在24小时对F0C4分生孢子萌发的抑制率是 73. 21%。3、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953 对尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)的抑制作用采用平板对峙法，测试枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953对尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)的拮抗作用。具体方法如下在马铃薯蔗糖培养基PDA (其中加5g/L蛋白胨，pH值调节到6. 5)平板中央接入直径为5mm的尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)(病原菌)菌丝块，在距离病原菌两侧25mm处，用接种环划线接种枯草芽抱杆菌(Bacillus subtil is )BLG010CGMCC No. 5953,以只接尖抱祿刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)菌丝块的处理作为对照，于28°C培养箱中培养7天，測量抑菌带宽度，每处理重复3次。结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLGOIOCGMCC No. 5953对尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4)的抑菌带宽度为ll_13mm。实施例3、盆栽防治香蕉枯萎病试验将生长3个月，健康的巴西香蕉苗移栽至装有病土 (含有尖孢铼刀菌古巴专化型4号小种(F0C4))的花盆，进行3种不同的处理处理ー在移栽吋，用200ml浓度为I X 108cfu/mL 的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953 菌株菌悬液(用水悬浮枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BLG010CGMCC No. 5953的孢子得到)沿香蕉基部烧灌，共处理150棵苗；处理ニ 用I X 107cfu/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLGOIOCGMCC No. 5953菌悬液((用水悬浮枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCCNo. 5953的孢子得到))沿香蕉基部浇灌，共处理100棵苗；处理三为浇灌清水对照，用等体积的清水沿香蕉基部浇灌，共处理150棵苗。之后在温室大棚里常温培养，待对照出现发病症状后，调查病情指数和防病效果将香蕉枯萎病分为以下5个标准
0级植株无枯黄症状。I级植株下部叶片出现轻微的枯黄症状，嫩叶完好，少部分根系轻微褐变，茎部出现水溃状褐变。2级植株下部叶片出现明显的枯黄症状，但嫩叶完好，根系出现褐变，茎部和假茎部出现水溃状褐变。3级整个植株出现枯黄症状，根系褐变腐烂，茎部和假茎部褐变连片，少数叶柄出现红褐。4级植株出现枯萎死亡症状，根系严重褐变腐烂。
病情指数=E (各级发病株数X该级代表数)X 100%
总数X最高级代表值
防病效果=(对照病情指数-处理病情指数)X100%
対照病情指数结果如表I 所示，说明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No. 5953
对香蕉枯萎病具有很好的防病效果。表I.枯草芽抱杆菌(Bacillus subtiIis)BLG01OCGMCC No. 5953 对香蓮枯萎病的防病效果
处理ー处理ニI处理三(对照)
病情指数 16. 3%41. 3%87.4%
防病效果 81.4%52. 7%/
权利要求
1.枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),其特征在于所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的菌株号为BLG010，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. 5953。
2.权利要求I所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)在生产分生孢子和/或菌丝体中的应用。
3.ー种杀菌剂，它的活性成分是权利要求I所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
4.根据权利要求3所述的杀菌剂，其特征在干所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)为分生孢子或/和菌丝体。
5.根据权利要求3或4所述的杀菌剂，其特征在于所述杀菌剂用于防治由尖孢铼刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)引起的植物病害。
6.根据权利要求5所述的杀菌剂，其特征在于所述植物病害为香蕉枯萎病。
7.权利要求I所述的枯草芽孢杆菌在制备植物杀菌剂中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述植物杀菌剂的靶标菌为尖孢铼刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubenseノ。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述植物杀菌剂用于防治香蕉枯萎病。
10.一种防治香蕉枯萎病的方法，包括采用IXlO8CfuAiL的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) BLG010 CGMCC No. 5953菌悬液浇灌香蕉苗基部的步骤。
全文摘要
本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其应用。本发明所提供的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLG010，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5953。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BLG010CGMCC No.5953在低浓度下能够有效抑制香尖孢镰刀菌的生长，对香蕉枯萎病的防治具有重要意义。
文档编号A01P3/00GK102747020SQ201210248300
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月18日 优先权日2012年7月18日
发明者刘磊, 朱利林, 梁昌聪, 王国芬, 黄俊生 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所