专利名称：一株具有百草枯抗性的硝化还原假单胞杆菌的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株对百草枯(Paraquat, PQ)具有抗性的硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonas nitroreducens)菌株,属于生物技术领域，具体为一株能在含强氧化剂PQ(50mmol/L)或者硝普钠(Sodium nitroprusside, SNP, 200 μ mol/L)的培养基上生长的革兰氏阴性短杆菌菌株。该菌株中分离得到一个基因PnPQR，该基因转化到大肠杆菌中，获得对大肠杆菌具有抗性的菌株，通过农杆菌介导法转化烟草，能提高烟草对百草枯的抗性。
背景技术：
除草剂百草枯(paraquat，PQ)是世界范围内应用最为广泛的除草剂之一，目前在100多个国家的100多种作物中除草(http://www. paraquat, com/Chinese),其应用面积仅 次于草甘膦。草甘膦在全球市场近乎垄断的地位，从某种程度上讲，也得益于转基因抗草甘膦作物的培育成功。单一除草剂压力势必引发杂草的抗性问题。培育新型抗除草剂作物既是新的知识产权和市场竞争的需求，也是保护优异除草剂的迫切需要。国际市场上百草枯仅次于草甘膦，但是尚未见抗百草枯作物出现。为了获得丰富百草枯抗性资源，我们从百草枯污染的土壤中筛选抗性微生物，继而从中分离抗性基因。本发明从抗性土壤中分离了 I个百草枯抗性菌株(S3)并对其进行了一些列的生理生化鉴定和16S rDNA序列分析，对其进行了系统分类。本发明还从S3中分别克隆了 I个基因PnPQR，该基因ORF全长均为I 233bp，编码410个氨基酸残基，含有11个跨膜区(TMS)，属于非典型的主要易化超家族(Majorfacilitator superfamily, MFS)。该基因在大肠杆菌BL21菌株中异源表达,能提高大肠杆菌对百草枯的抗性。过量表达的PnPQR转基因烟草植株TO代叶片分析初步表明，该基因能赋予烟草百草枯抗性。
发明内容
本发明的目的是获得一株具有百草枯(Paraquat，PQ)抗性的菌株并了解该菌株的特征特性。本发明的菌株是一种利用稀释平板法从PQ污染的土壤悬浮液中分离得到的具有高抗百草枯(PQ)的硝化还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)菌株,是能够在含强氧化剂 PQ (50mmol/L)或者硝普钠(Sodium nitroprusside, SNP, 200 μ mol/L)的培养基上生长的革兰氏阴性，短杆菌，具有硝化还原特性和反硝化还原特性，接触酶阳性、吲哚实验阴性。—株对百草枯(Paraquat, PQ)具有抗性的硝化还原假单胞杆菌菌株,该菌株是利用稀释平板法从PQ污染的土壤悬浮液中分离得到的，该菌株现保藏于中国微生物管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC6300。本发明公开了硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonas nitroreducens) CGMCC6300在提高大肠杆菌对百草枯的抗性中的应用。
公开了硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonas nitroreducens) CGMCC6300在制备具有百草枯抗性的转基因烟草中的应用。上述所说的在制备具有百草枯抗性的转基因烟草中的应用，具体步骤如下(I)从硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonas nitroreducens) CGMCC6300 中分离百草枯抗性基因PnPQR 以Pl :5’ -CCACTCCGATGTCCAATC-3’ 和 P2 :5’ -TTACCCGCTCGTCCCTAT-3’ 为引物，通过PCR从硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonas nitroreducens)CGMCC6300中分离序列如SEQID NO. I所示的目标基因PnPQ，将PnPQ连接到pMD18_T载体中，构成pMD-PnPQR载体； (2) pCAMBIA2301载体启动子和终止子的添加以pBI121 为模板，应用引物 35SF :5’ -AATTCGATTAGCCTTTTCAATTTCAG-3’ 和 35SR 5’ -GAGCTCAGGAAGTTCATTTCATTTGGAG-3’，扩增 CaM35S 启动子片段；用 EcoR I 和 SacI 对 PCR产物和pCAMBIA2301同时进行双酶切，用T41igase连接成pCAMBIA2301_35S ;再以pBI121为模板，用引物 NOSF: :5’ -GCATGCATCGTTCAAACAITTGGCAATAA-3’ 和 NOSR :5’ -GANTCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3’，扩增 NOS 终止子片段，再用 Sph I 和 Hind III对 PCR 产物和PCAMBIA2301-35S-N0S 同时进行双酶切，用 T41igase 连接成 pCAMBIA2301-35S_N0S。(3) pCAMBIA2301-PnPQR植物表达载体的构建以pMD-PnPQR 为模板 P3 :5’-GAAGGATCCTCCACTCCGATGTCCAATC-3’ 和 P4 :5’-CTAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT-3’为引物，扩增包括PnPQR编码区全长片段，用BamHI和SacI对PCR产物和pCAMBIA2301-35S-N0S载体同时进行双酶切，用T41igase连接成PCAMBIA2301-PnPQR ；(4)植物表达载体pCAMBIA2301-PnPQR通过农杆菌介导转化烟草，获得转基因烟草。本发明菌株能在含强氧化剂百草枯PQ(50mmol/L左右)或者硝普钠(Sodiumnitroprusside, SNP, 200 μ mol/L左右)的培养基上生长；具有硝化还原特性和反硝化还原特性，接触酶阳性。本发明菌株属硝化还原假单胞菌；对多种抗生素具有抗性。本发明菌株对于抗氧化性、硝化还原和反硝化机制的研究是不可多得的资源。本发明菌株对于杂草的控制和其它农业化学工业的研究也起着重要作用。PnPQR基因在大肠杆菌BL21菌株中异源表达，能提高大肠杆菌对百草枯的抗性；过量表达的PnPQR转基因烟草植株TO代叶片分析初步表明，该基因能赋予烟草百草枯抗性。
图I是S3在含有不同PQ浓度的培养基上的生长曲线。图2是JM109在含有不同PQ浓度的培养基上的生长曲线。图3是S3在含有不同SNP浓度的培养基上的生长曲线。图4是JM109在含有不同SNP浓度的培养基上的生长曲线。图5是S3菌株的16S rDNA序列的系统发生分析。图6是重组菌BL21/pET32a_PnPQR在不同浓度的PQ培养基上的生长。图7是转基因植株(T0代)的百草枯抗性分析。CK :野生型，PQR :转PnPQR植株，I 1000 μ mol/L, 2 :100 μ mo I · L \ 3 :5 μ mol/L。
菌株S3于2012年6月20保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路I号3号院中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6300 ;分类命名是硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens。
具体实施例方式I)百草枯(Parauqat，PQ)污染土壤的采集土壤样品(沙壤土，含水量7%)主要采集于南京红太阳集团公司和深圳诺普信农化股份有限公司，采集地离生产车间约200m，采集深度(T30cm。2)菌株的分离与筛选采用稀释平板分离法(李顺鹏.微生物实验指导[M]. 2003)将土壤悬浮液平铺于含有不同浓度百草枯(0，1，10，20，50臟01/1)的牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿(直径90mm)上，将培养皿置于30°C培养48h，观察生长情况。从土壤悬浮液中成功地分离了 4个抗20mmol/LPQ (百草枯标样购自德国Dr. Ehrenstorfer-Schafers’ s实验室)的单克隆,经过 进一步的筛选，选择了 I个抗50mmol/L PQ的单克隆进行纯化,用于进一步的研究工作。此单克隆命名为S3。纯化的菌株在琼脂平板划线，30°C培养36h后，进行观察。S3单克隆菌落直径约2. 1_，浅黄色，圆形半透明，边缘光滑而整齐；革兰氏染色后在光学显微镜下观察，菌体红色，为革兰氏阴性菌，短杆状。结晶紫染色无芽孢。3)分离菌株的生化鉴定使用细菌ATB 自动化仪(bio-MerieuxATB Expression, France)鉴定分离菌株的碳源利用情况，具体步骤参考说明书(ID32GN V3. I) (ID32GN试剂盒购自法国梅里埃，Lennart Meri,公司)，并利用Database V3. 0.进行分析。表明它能够分解衣康酸、辛二酸盐、乙酸盐、DL-乳酸盐、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、丙酸盐、癸酸盐、戊酸盐、柠檬酸盐、3-羟基-丁酸盐、4-羟基-苯甲酸盐、L-脯氨酸共13种碳源；不能分解李糖、N-乙酰葡萄糖胺、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、丙二酸盐、L-丙酸盐、甘露醇、水杨酸、D-蜜二糖、L-岩藻糖、D-山梨酸、组氨酸、5-酮基-葡萄糖酸盐、糖原、3-羟基-苯甲酸盐、2-酮葡萄糖酸盐、L-丝氨酸共19种碳源。常规的生理生化鉴定参考伯氏细菌学鉴定手册(Holt J G.Bergey’s Manual ofDeterminative Bacteriology, (9th edition) [M]，1984，500pp),其中包括革兰氏染色试验、厌氧生长试验、接触酶实验、脲酶试验、硝化还原试验、反硝化试验、吲哚反应、硫化氢试验、氧化酶试验等。鉴定结果表明S3是一种兼性厌氧、非葡萄糖发酵型细菌。它的最适生长温度为30° C，4° C和41° C都不能正常生长。其它生理生化特性见表I。表I S3的其它生化特性
权利要求
1.硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonasnitrored-cens)CGMCC6300在提高大肠杆菌对百草枯的抗性中的应用。
2.硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonasnitroredcens) CGMCC6300在制备具有百草枯抗性的转基因烟草中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，具体步骤是如下 (1)从硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonasnitroreducens) CGMCC6300中分离百草枯抗性基因PnPQR 以 Pl :5’ -CCACTCCGATGTCCAATC-3 '和 P2 :5’ -TTACCCGCTCGTCCCTAT-3 '为引物，通过PCR从硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonas nitroredu-cens) CGMCC6300中分离序列如SEQID NO. I所示的目标基因PnPQR，将PnPQR连接到pMD18_T载体中，构成pMD-PnPQR载体； (2)pCAMBIA2301载体启动子和终止子的添加以 pBI121 为模板，应用引物 35SF :5’ -GAATTCGATTAGCCTTTTCAATTTCAG-3'和 35SR :5’-GAGCTCAGGAAGTTCATTTCATTTGGAG-3'，扩增 CaM35S 启动子片段；用 EcoR I 和 SacI 对 PCR产物和pCAMBIA2301同时进行双酶切，用T41igase连接成pCAMBIA2301_35S ;再以pBI121为模板，用引物 NOSF :5’ -GCATGCATCGITCAAACAITTGGCAATAA-3’ 和 NOSR :5’ -GANTCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3 '，扩增NOS终止子片段，再用Sph I和Hind III对PCR产物和PCAMBIA2301-35S-N0S 同时进行双酶切，用 T41igase 连接成 pCAMBIA2301-35S_N0S ； (3)pCAMBIA2301-PnPQR植物表达载体的构建以 pMD-PnPQR 为模板 P3 :5’ -GAAGGATCCTCCACTCCG ATGTCCAATC-3 '和 P4 :5’ -CTAGAGCTCTTACCCGCTCGTCCCTAT-3’为引物，扩增包括PnPQR编码区全长片段，用BamHI和SacI对PCR产物和pCAMBIA2301-35S-N0S载体同时进行双酶切，用T41igase连接成PCAMBIA2301-PnPQR ； (4)植物表达载体pCAMBIA2301-PnPQR通过农杆菌介导转化烟草，获得转基因烟草。
全文摘要
本发明涉及一株对百草枯(PQ)具有抗性的硝化还原假单胞杆菌(Pseudomonasnitroreducens)菌株的应用，该菌株保藏编号为CGMCC6300。本发明从硝化还原假单胞杆菌CGMCC6300中克隆了PnPQR基因，该基因编码一个非典型的主要易化超家族(MFS)成员。PnPQR在大肠杆菌BL21菌株中表达，能提高其对百草枯的抗性。过量表达PnPQR的转基因烟草植株具有百草枯抗性。
文档编号A01H5/00GK102807963SQ201210256939
公开日2012年12月5日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者郭书巧, 倪万潮, 束红梅, 巩元勇, 沈新莲, 张香桂, 徐鹏 申请人:江苏省农业科学院