专利名称：黄麻链霉菌nf0919菌株代谢产物在防治小麦病害上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及用途,更具体地说涉及一种黄麻链霉菌iStreptomycescorchorusii)Wm\9菌株代谢产物及其在防治小麦病害上的应用，属于生物农药技术领域。
背景技术：
由植物病原真菌立枯丝核菌(/PAizocioflia cereal)侵染引发的小麦纹枯病和玉雙靡赤霉iGibberella zeae)侵染引发的小麦赤霉病,是小麦上的主要病害。当前,小麦纹枯病和赤霉病主要以化学防治为主，常用以下化学药剂防治三唑酮，三唑醇，烯唑醇和多菌灵等。由于长期用该类药剂进行单一防治，使得小麦纹枯病菌和赤霉病菌对上述化学药剂产生不同程度的抗药性，有时会出现防治失败的事例，给农业生产造成重大损失。 目前成功用于防治麦类病害的生物农药专用制剂还没有。文献已报道生物防治控制病害的生防菌属(种)主要有(I)芽孢杆菌属细菌spp.)中的枯草芽孢杆菌{Bacillus)、多粘芽抱杆菌{Bacillus poIymyxa)和巨大芽抱杆菌{Bacillusmega terium)； (2 )假单胞菌属细菌iPseudomorms spp.)中的突光假单胞细菌iPseudomonasfluorescens )等。本发明提供的可同时兼治小麦各类病害的颉颃细菌黄麻链霉菌NF0919菌株，在现有技术中没有提及和公开。
发明内容
提供黄麻链霉菌iStreptomyces cor chorus ii ) NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，及提取物在防治小麦纹枯病和小麦赤霉病上的应用。本发明是通过以下技术方案实现的
本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL 201010236886. I。黄麻链霉菌(拉丁文学名为Streptomyces corchorusii) NF0919菌株，已于2010年7月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为=CGMCC No. 3968。本发明的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，包括以下步骤
(A)菌株的活化与一级种子培养液的培养
将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30°C培养10 d，挑取I cm2大小的菌块接种于50 mL—级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL)，置于170 rpm摇床上30°C振荡培养44 48 h，其中所述的50 mL—级种子培养液的成分为可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的单位比例为W/V;
(B)二级种子培养液的培养将步骤(A)所得一级种子培养液按5% (V/V)的接种量接入50 mL 二级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL),170 rpm,30 °C摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V ;所述的50 mL 二级种子培养液的成分(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的单位比例为W/V ；
(C)发酵培养液的培养
将步骤(B)所得二级种子培养液按5% (V/V)的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为溶氧100%，消泡剂I. 6 L，搅拌速度为360 rpm,发酵温度为36 °C，发酵时间为72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的发酵培养液的成分为(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的单位比例为W/V ;所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂；
(D)NF0919菌株发酵液中代谢产物分离方法
把步骤(C)所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2. 0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本发明的有益效果是
本发明提供黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，并证明其提取物可同时兼治小麦多种病害。大田防治结果表明，该菌株代谢产物对小麦纹枯病和小麦赤霉病均有很好的防治效果。
具体实施方式
实施例本发明中提供用的黄麻链霉菌NF0919菌株的菌株特征，见专利ZL201010236886. I。本发明黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中产物的提取方法，包括以下步骤
(A)菌株的活化与一级种子培养液的培养
将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30°C培养10 d，挑取I cm2大小的菌块接种于50 mL—级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL)，置于170 rpm摇床上30°C振荡培养44 48 h，其中所述的50 mL—级种子培养液的成分为可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的单位比例为W/V;
(B)二级种子培养液的培养
将步骤(A)所得一级种子培养液按5% (V/V)的接种量接入50 mL 二级种子培养液中(250 mL三角瓶装培养液50 mL),170 rpm,30 °C摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V ;所述的50 mL 二级种子培养液的成分(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白
2.2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的单位比例为W/V ；
(C)发酵培养液的培养将步骤(B)所得二级种子培养液按5% (V/V)的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为溶氧100%，消泡剂I. 6 L，搅拌速度为360 rpm,发酵温度为36 °C，发酵时间为72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的发酵培养液的成分为(W/V):马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的单位比例为W/V ;所述的消泡剂为XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂；
(D) NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法
把步骤(C)所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2. 0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本实施例的实施效果
NF0919菌株发酵液的提取物对小麦纹枯病和小麦赤霉病的田间防效试验试验在江苏省句容市镇江农业科学研究所行香园区进行，小麦品种为镇麦5号。试验 处理方案如下
(A)小麦纹枯病的防治
药剂处理方法NF0919菌株发酵液提取物3000倍液，对照药剂为50%多菌灵可湿性粉剂(江苏省绿盾植保农药实验有限公司生产)1000倍液，空白对照为不防治，小区面积60 m2,随机区组排列，4次重复。处理时间为2011年4月8日，细喷雾防治I次，用水量为
50kg/667m2，防治后14天调查病害严重度并计算出病情指数；
(B)小麦赤霉病的防治
药剂处理方法NF0919菌株发酵液提取物3000倍液，对照药剂为50%多菌灵可湿性粉剂(江苏省绿盾植保农药实验有限公司生产)1000倍液，空白对照为不防治，小区面积60 m2,随机区组排列，4次重复。处理时间为2011年5月16日，细喷雾防治I次，用水量为50 kg/667m2，防治后14天调查病害严重度并计算出病情指数。结果与分析NF0919菌株发酵液提取物3000倍液小麦纹枯病和小麦赤霉病的防治效果分别为91. 32%和95. 21% (表1)，而对照药剂50%多菌灵可湿性粉剂1000倍液对小麦纹枯病和小麦赤霉病的防治效果分别为72. 30%和81. 99% (表I)。以上结果表明，NF0919菌株发酵液中代谢产物提取物的田间防治效果显著高于对照药剂，NF0919菌株发酵液提取物对小麦两大病害的兼治作用显著。试验中所有处理均未发生药害现象，表明NF0919菌株发酵液中代谢产物使用安全。表I NF0919菌株发酵液的提取物对小麦纹枯病和小麦赤霉病的田间防治试验结果
权利要求
1.黄麻链霉菌iStreptomycescorchorusii ) NF0919菌株(该菌种特性见专利ZL201010236886. I)发酵液中代谢产物的提取方法。
2.根据权利要求I所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取物，在防治小麦纹枯病和小麦赤霉病上的应用。
3.权利要求I所述的黄麻链霉菌NF0919菌株发酵液中代谢产物的提取方法，其特征在于包括以下步骤 (A)菌株的活化与一级种子培养液的培养 将保存的NF0919菌株的斜面在高氏一号培养基上活化，30°C培养10 d，挑取I cm2大小的菌块接种于50 mL 一级种子培养液中，置于170 rpm摇床上30°C振荡培养44 48 h,其中所述的50 mL—级种子培养液的成分为可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的单位比例为W/V ； (B)二级种子培养液的培养 将步骤(A)所得一级种子培养液按5%的接种量接入50 mL 二级种子培养液中，170rpm,30 °C摇床上培养48 - 52 h，其中所述的5%的单位比例为V/V ;所述的50 mL 二级种子培养液的成分:马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%, K2HPO4 O. 05%，MgSO4 O. 05%,淀粉酶O. 01%,马铃薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4, MgSO4和淀粉酶含量的单位比例为VV； (C)发酵培养液的培养 将步骤(B)所得二级种子培养液按5%的接种量接种于装有160 L发酵培养液的容积为200 L的发酵罐中，其中所述的5%的单位比例为V/V，设置发酵参数为溶氧100%，消泡齐IJ(XP-100F系列发酵用有机硅消泡剂)1.6 L，搅拌速度为360 rpm,发酵温度为36 V，发酵时间为72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的发酵培养液的成分为马铃薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白.2.6%, K2HPO4 O. 05%, NaCl O. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，马铃薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4 ,NaCl、MgSO4和CaCO3含量的单位比例为W/V; (D)NF0919菌株发酵液中代谢产物提取方法 把步骤(C)所得发酵液在10000 rpm离心5 min得上清液，用浓盐酸调节pH至2. 0，出现沉淀，再次离心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。
全文摘要
本发明为黄麻链霉菌NF0919菌株(其在CGMCC的保藏编号为CGMCC No.3968，菌种专利号为ZL201010236886.1)发酵液中活性代谢产物的提取方法。代谢产物能有效防治小麦纹枯病和小麦赤霉病。
文档编号A01P3/00GK102870820SQ20121035462
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月23日 优先权日2012年9月23日
发明者杨敬辉, 陈宏州, 庄义庆, 张文文 申请人:江苏丘陵地区镇江农业科学研究所