专利名称：桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，涉及将目的基因转入发根农杆菌后侵染桑树外植体，诱导出桑树转基因毛状根，建立一种桑树转基因毛状根高效诱导和繁殖体系的方法。
背景技术：
桑树(Morus L.)属多年生木本双子叶植物，是应用于蚕桑产业一种重要的经济作物，是家蚕的唯一饲料来源；桑树在林业、食品行业也具有重要地位，桑叶中富含人体所需的多种氨基酸，其果实、根、茎、叶等都具有很高的药用价值和保健价值；同时，桑树能产生多种具有重要的药用价值的次生代谢物质，如槲皮素等黄酮类化合物及多种具有抗病毒、 抗菌、抗氧化、抗衰老、预防肿瘤等功能的活性物质(李想韵，朱鸿，孙一铭，孙敏，桑遗传转化体系的建立及槲皮素合成的研究，中国中药杂志，2010，35 (11))。我国拥有世界上最多的桑树资源，但由于自然界生长的桑树遗传背景复杂，杂合性非常高，传统的遗传育种周期很长，并且很难做到对某个有价值遗传性状的定向育种。随着现代分子技术的发展，借助转基因育种，可以有选择地对桑树转入人为需要的某个基因，实现定向分子育种。但目前通过桑树愈伤细胞诱导后再分化而进行遗传转化存在周期长、转化效率偏低等问题(谈建中，楼程富，钟名其，平野久，大豆球蛋白基因表达载体的构建及对桑树的遗传转化，蚕业科学，1999，25 (O);而利用花粉介导转基因往往受到季节和桑树花性等因素制约。由于缺乏高效的桑树转基因技术体系支撑，国内外利用转基因技术进行桑树遗传育种的研究尚处于起步阶段；对桑树某些有价值的功能基因的鉴定和应用，以及对桑树多种有价值的次生代谢产物的研究也存在诸多困难。发根农杆菌是在植物基因工程中广泛应用的一种侵染性很强的根瘤菌科农杆菌属革兰氏阴性菌，其携带的Ri质粒能有效侵染绝大多数双子叶植物，少数单子叶植物以及个别裸子植物，诱发植物产生形状如根系的发根即毛状根(hairy root)。由于发根农杆菌转化的毛状根具有生长速度快、分支多，能够持续合成次生代谢产物，获得的次生代谢产物量高且稳定、不需要添加外源植物激素等特点，因此可作为生产和研究植物次生代谢物质的生物反应器；同时，由于发根农杆菌携带的Ri质粒能将外源基因整合到寄主染色体、其诱导产生的毛状根易获得再生植株等优点，因此，建立特定植物的转基因毛状根体系，在定向分子育种方面具有广泛应用前景。近年来利用发根农杆菌已转化大约160多种植物，在40多种植物建立了毛状根培养体系，特别是一些药用植物建立了毛状根转基因体系，极大地方便了药用次生代谢产物生产及遗传育种研究。随着现代分子生物学的迅速发展，向桑树定向转入有价值基因，建立一套有效的桑树转基因体系已成为可能。尽管也有诱导野生型桑树毛状根的报道(孔卫青，杨金宏，卢从德，发根农杆菌诱导桑树毛状根体系的建立，西北植物学报，2010，30 (11))，但仍然存在诱导率偏低等问题(14-17%左右)，并且目前未见将目的基因利用植物表达载体转入发根农杆菌，诱导的转基因毛状根，建立桑树转基因体系的报道。AP2/ERF蛋白是植物特有的一类转录因子，在植物分子信号传导途径的级联反应中起到了关键性的作用，其表达水平的变化能在很大程度上影响植物对不良环境的适应能力(Zhi-Xin Qiao et al. Molecular cloning and functional analysis of an ERFgene from cotton (Gossypium hirsutum). Biochimica et Biophysica Acta. 2008,1779 122-127)。大量研究表明，ERFs参与植物的生长发育、环境适应和对各种胁迫因子作出的抗逆性反应，与植物次生代谢产物的形成有密切关系(Takeshi Fukao, et al. Ethylene-Akey regulator of submergence responses in rice.Plant Science 2008,175:43-51)。而目前并无将AP2/ERF类转录因子或其他目的基因转入发根农杆菌，高效诱导桑树转基因毛状根并繁殖，建立桑树毛状根转基因体系的报道。
发明内容
解决的技术问题本发明将所选择的目的基因转入发根农杆菌，快速、高效诱导出含目的基因的桑树毛状根，对获得的转基因毛状根扩大培养并检测，建立一套高效的桑树毛状根转基因体系。技术方案桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，步骤包括 (I)桑树无菌苗培养选取桑树种子，或剪取野外生长的桑树顶芽，清洗消毒后置于MS培养基，26°C _28°C生长，培养一个月后得到桑树无菌苗，剪取无菌苗顶部叶片或茎段作为外植体；(2)外植体预培养将上述外植体置于事先配制的预培养基上培养36_48h ；(3)转基因侵染菌液制备高保真酶扩增目的基因桑树乙烯转录因子MaERFlJf获得的目的片段与真核表达载体pBI121-eGFP连接后，将连接产物用冻融法转化发根农杆菌ATCC158341感受态细胞；挑取阳性克隆，用YEB液体培养基扩增至0D600=0. 5时，添加乙酰丁香酮(AS)，作为转基因侵染菌液；(4)侵染与共培养上述预培养的外植体置于转基因侵染液中浸染5-10min后，取出滤纸吸干，置于MS+50-300 μ MAS的共培养培养基中，26°C _28°C共培养36_48h ；(5)外植体除菌培养共培养结束后，将外植体用无菌水清洗后转移至外植体除菌培养基MS+500mg/L头孢霉素+0. I %聚乙烯吡咯烷酮(PVP，g/mL)+50-300 μ MAS，一星期后再转移至MS+250mg/L头孢霉素+0. I % PVP+50-300 μ M AS，直到侵染15天后出现桑树毛状根；(6)桑树转基因毛状根的培养剪取长度约Icm的毛状根，转入MS+500mg/L头孢霉素的固体除菌培养基，再过一星期转入MS+250mg/L头孢霉素除菌培养基，直至除去残留的发根农杆菌；将彻底除菌的毛状根转入添加0-1. Omg/L的吲哚乙酸的B5固体培养基扩大培养；将固体扩大培养的毛状根转入添加0-1. Omg/L的吲哚乙酸的B5液体培养基扩大培养，
繁殖结束。还包括转基因毛状根检测步骤分为分子检测和荧光检测2个部分，取毛状根，PCR方法检测农杆菌Ri质粒中RolC基因，判断是否为毛状根，再检测绿色荧光蛋白，验证是否是桑树转基因毛状根。步骤(I)所述的桑树外植体为剪取所培养的高度达7-8cm桑树无菌苗顶端2-3cm处的幼叶或茎段作为外植体。步骤(2)所述的预培养基为MS+2.4-DO. 1-0. 5mg/L+KT O. 5-1. 5mg/L+CaCl2l. 0-6. Og/L 的预培养基，pH=5. 0-5. 8。步骤(2)所述的预培养基优选为MS+2.4-DO. 5mg/L+KT I. 5mg/L+CaCl24. 4g/L,pH=5. 4。步骤(3)所述的转基因侵染菌液为YEB液体培养基中添加的AS为50-300 μ Μ。步骤(3)所述的转基因侵染菌液优选为YEB液体培养基中添加的AS为200 μ Μ。步骤(4)所述的共培养培养基优选为MS+200 μ M AS。步骤(5)所述的外植体除菌培养基优选为MS+500mg/L头孢霉素+0. I % PVP (g/mL) +200 μ M AS 及 MS+250mg/L 头孢霉素 +0. 1% PVP (g/mL) +200 μ M AS。
步骤(6)所述的Β5固体和液体培养基优选添加的吲哚乙酸均为O. lmg/L。有益效果如前所述，桑树缺乏高效转基因体系已经成为桑树功能基因、次生代谢物质及遗传育种研究的一个制约因素。至今未见通过毛状根体系转入诸如AP2/ERF类转录因子等外源目的基因，建立桑树毛状根转基因体系的相关文献报道。本发明不仅首次将一个与植物次生代谢及逆境胁迫相关的目的基因MaERFl转入植物表达载体，将该载体转入发根农杆菌后再转入桑树外植体，在叶片和茎段均高效诱导出桑树转基因毛状根，叶片和茎段诱导率分别达到56%和68%，而且对获得的桑树转基因毛状根扩大培养的方法进行了优化，由此成功建立了桑树毛状根转基因体系。该方法可省去桑树愈伤细胞再分化的步骤，克服了利用愈伤细胞进行遗传转化存在的周期长，转化效率偏低等问题；转基因毛状根诱导和繁殖不受外界环境、季节和桑树花性等因素制约，大大提高桑树转基因效率；转入的MaERFl转录因子基因有助于桑树逆境胁迫下的应答机制及次生代谢物质的研究；本发明对桑树功能基因鉴定和研究及分子育种具有重大意义；对其他转基因困难的木本植物提供了可靠的借鉴方法，具有广阔的开发应用前景。
图IA为叶片诱导出的转MaERFl基因桑树毛状根；B为茎段诱导出的转MaERFl基因桑树毛状根；图2为毛状根在B5固体培养基扩大培养；图3为转MaERFl基因桑树毛状根RolC基因检测；图4为转MaERFl基因桑树毛状根荧光检测。
具体实施例方式文中的“ + ”理解为“体系中含有”。实施例I :转桑树MaERFl转录因子基因毛状根的诱导(I)桑树外植体培养选取桑树品种为沙二 X伦109桑树种子,或剪取野外生长的沙二 X伦109桑树顶芽，均由国家种质镇江桑树圃提供。用无菌水将种子或野外剪取的桑芽清洗3-5次；用75% wt酒精消毒2min，再用无菌水清洗2次；0. 1% wt的升汞消毒5min，无菌水清洗2次；置于MS培养基，26°C _28°C生长，培养无菌苗；一个月后，当桑树无菌苗生长至7-8cm高时，剪取无菌苗顶端2-3cm处的幼叶或茎段作为外植体，其中叶片剪成O. 5cmXO. 5cm,莖段剪成 1cm。(2)外植体预培养将上述外植体置于事先配置的MS+2. 4-D O. 5mg/L+KTl. 5mg/L+CaCl24. 4g/L 预培养基(pH=5. 4)上培养 36_48h。(3)转基因侵染菌液制备将pBI121载体中的⑶S基因片段用绿色荧光蛋白eGFP基因片段代替后的改造载体；根据GenBank GQ162103. I公布的桑树乙烯转录因子MaERFl 序列设计引物 MaERF-F :5’ -CTAGTCTAGAATGTGTGGAGGTGCTATTATCTC-3’ 及 MaERF-R 5’ -CGCGGATCCAAAGGCTTCGCCAGACACGGTG-3’ ；以桑树总 RNA 为模板，以 Promega 公司反转录酶反转录，合成cDNA第一链；以cDNA第一链为模板，以MaERF_F/R为引物，按照Takala公司的PrimeSTAR Max DNA Polymerase高保真酶说明书扩增目的基因MaERFl,扩增反应为98 °C IOs, 59 °C 5s, 72 °C 8s，30个循环；电泳验证PCR产物大小，并将目的片段切胶回收；回收产物和pBI121-eGFP载体分别用Xba I和BamH I双酶切；再次电泳回收目的片段，并与酶切并回收后的pBI121_eGFP载体用TaKaRa T4 DNA Ligase连接， 构建pBI121-MaERFl-eGFP质粒；将pBI121-MaERFl_eGFP质粒用冻融法转化发根农杆菌ATCC158341感受态细胞；挑取阳性克隆，转入YEB液体培养基，在26_28°C，180rpm的摇床中扩增至0D600=0. 5时，添加200 μ L/L的AS (乙酰丁香酮)，作为转基因侵染菌液。(4)侵染与共培养上述预培养的外植体置于转基因侵染液中浸染5-10min后，取出滤纸吸干，置于MS+200yM AS的共培养培养基中，26°C -28°C共培养36_48h。(5)外植体除菌培养共培养结束后，将外植体用无菌水清洗后转移至外植体除菌培养基 MS+500mg/L 头孢霉素 +0. I % PVP( g/mL)+AS 200 μ Μ, 一星期后再转移至 MS+250mg/L头孢霉素+0. I % PVP (g/mL)+AS 200μΜ的除菌培养基。叶片(图1-Α)和茎段(图1-Β)从侵染到出现桑树毛状根均约为15天。其中25个叶片中有14个产生毛状根，诱导率为56% ；50个茎段外植体有34个产生毛状根，诱导率为68%。转桑树MaERFl转录因子基因毛状根扩大培养诱导出来的毛状根经过一星期的生长，剪取长度约Icm的毛状根，转入MS+500mg/L头孢霉素的固体除菌培养基，再过一星期转入MS+250mg/L头孢霉素，直至除去残留的发根农杆菌；将彻底除菌的毛状根转入B5固体培养基(添加O. lmg/L的吲哚乙酸)扩大培养(图2);将固体扩大培养的毛状根转入B5 (添加O. lmg/L的吲哚乙酸)液体培养基扩大培养，
完成繁殖。转桑树MaERFl转录因子基因毛状根验证分为分子检测和荧光检测2个部分。取一定数量毛状根，CTAB法提取毛状根 DNA 为模板，设计引物 rolc-F:5’ -ACAAGCCACTTCTGTTTCCC-3，；rolC-R 5’ -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3’，用PCR方法扩增，检测农杆菌Ri质粒中RolC基因，随机选取的6个扩大培养桑树毛状根株系，均检测到RolC基因的存在(图3)，说明获得的均为毛状根；同时，由于MaERFl为转录因子，定位在细胞核上，可通过细胞核荧光验证转基因是否成功。取上述6个株系中长度约2-3_的毛状根，制作成切片，用激光共聚焦显微镜检测荧光，结果显示均检测到细胞核荧光，检出率为100%，表明所扩大培养的桑树毛状根均为转基因毛状根(图4)。序列表〈110〉江苏科技大学
〈120〉桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法〈130〉<160>4<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>33
<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉Ictagtctaga atgtgtggag gtgctattat ctc33<210>2〈211 >31<212>DNA〈213〉人工序列<400>2cgcggatcca aaggcttcgc cagacacggt g31<210>3<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>3acaagccact tctgtttccc20<210>4<211>20<212>DNA〈213〉人工序列<400>4cagcgactgc aaccagttta20
权利要求
1.桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤包括 (1)桑树无菌苗培养取桑树种子，或剪取野外生长的桑树顶芽，清洗消毒后置于MS培养基，26°C_28°C生长，培养一个月后得到桑树无菌苗，剪取无菌苗顶部叶片或茎段作为外植体； (2)外植体预培养将上述外植体置于事先配制的预培养基上培养36-48h； (3)转基因侵染菌液制备高保真酶扩增目的基因桑树乙烯转录因子MaERFl，将获得的目的片段与真核表达载体pBI121-eGFP连接后，将连接产物用冻融法转化发根农杆菌ATCC158341感受态细胞；挑取阳性克隆，用YEB液体培养基扩增至0D600=0. 5时，添加乙酰丁香酮(AS)，作为转基因侵染菌液； (4)侵染与共培养上述预培养的外植体置于转基因侵染液中浸染5-10min后，取出滤纸吸干，置于MS+50-300 μ MAS的共培养培养基中，26°C _28°C共培养36_48h ； (5)外植体除菌培养共培养结束后，将外植体用无菌水清洗后转移至外植体除菌培养基MS+500mg/L头孢霉素+0. I %聚乙烯吡咯烷酮(PVP)+50-300 μ M AS，一星期后再转移至MS+250mg/L头孢霉素+0. 1% PVP+50-300 μ MAS，直到侵染15天后出现桑树毛状根； (6)桑树转基因毛状根的培养剪取长度Icm的毛状根，转入MS+500mg/L头孢霉素的固体除菌培养基，再过一星期转入MS+250mg/L头孢霉素除菌培养基，直至除去残留的发根农杆菌；将彻底除菌的毛状根转入添加0-1. Omg/L吲哚乙酸的B5固体培养基扩大培养；将固体扩大培养的毛状根转入添加0-1. Omg/L吲哚乙酸的B5液体培养基扩大培养，繁殖结束。
2.根据权利要求I所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于还包括转基因毛状根检测步骤分为分子检测和荧光检测两个部分，取毛状根，PCR方法检测农杆菌Ri质粒中RolC基因，判断是否为毛状根，再检测绿色荧光蛋白，验证是否是桑树转基因毛状根。
3.根据权利要求I所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤(I)所述的桑树外植体为剪取所培养的高度达7-8cm桑树无菌苗顶端2-3cm处的幼叶或茎段作为外植体。
4.根据权利要求I所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤(2)所述的预培养基为MS+2. 4-D O. 1-0. 5mg/L+KT O. 5-1. 5mg/L+CaCl2l. 0-6. Og/L 的预培养基,pH=5. 0-5. 8。
5.根据权利要求I所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤(2)所述的预培养基优选为MS+2. 4-D O. 5mg/L+KT I. 5mg/L+CaCl24. 4g/L，pH=5. 4。
6.根据权利要求I所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤(3)所述的转基因侵染菌液为=YEB液体培养基中添加的AS为50-300 μ Μ。
7.根据权利要求I所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤(3)所述的转基因侵染菌液优选为YEB液体培养基中添加的AS为200 μ M0
8.根据权利要求I所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤(4)所述的共培养培养基优选为MS+200 μ M AS。
9.根据权利要求I所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤(5)所述的外植体除菌培养基优选为MS+500mg/L头孢霉素+0. I % PVP+200 μ M AS及MS+250mg/L 头孢霉素 +0. I % PVP+200 μ M AS。
10.根据权利要求I所述的桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，其特征在于步骤(6)所述的B5固体和液体培养基优选添加的吲哚乙酸均为O. lmg/L。
全文摘要
桑树转基因毛状根的诱导及繁殖方法，步骤包括桑树无菌苗培养；外植体预培养；转基因侵染菌液制备；侵染与共培养；外植体除菌培养；桑树转基因毛状根的培养；将固体扩大培养的毛状根转入添加吲哚乙酸的B5液体培养基扩大培养，繁殖结束。该方法可省去桑树愈伤细胞再分化的步骤，克服了利用愈伤细胞进行遗传转化存在的周期长，转化效率偏低等问题；转基因毛状根诱导和繁殖不受外界环境、季节和桑树花性等因素制约，大大提高桑树转基因效率；转入的MaERF1转录因子基因有助于桑树逆境胁迫下的应答机制及次生代谢物质的研究；本发明对桑树功能基因鉴定和研究及分子育种具有重大意义，具有广阔的开发应用前景。
文档编号A01H5/06GK102876709SQ201210384738
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者方荣俊, 赵卫国, 童伟, 程嘉翎, 刘利, 张 林, 杨永华, 戚金亮 申请人:江苏科技大学