生产麦角硫因的菌株及制备麦角硫因的方法

生产麦角硫因的菌株及制备麦角硫因的方法
【专利摘要】本发明涉及一株糙皮侧耳(Pleurotus?ostreatus)TIB.BPE.10010，保藏编号为CGMCC?No.6232。本发明还涉及麦角硫因的制备方法，包括发酵培养糙皮侧耳CGMCC?No.6232生物合成麦角硫因和从菌丝体细胞内浸提麦角硫因的步骤。
【专利说明】生产麦角硫因的菌株及制备麦角硫因的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物资源、发酵工程和天然产物的生物合成领域。更具体地，本发明涉及一株生产麦角硫因的菌株，糙皮侧耳(Pleurotusostreatus),以及利用该菌株发酵制备麦角硫因的方法。
【背景技术】
[0002]麦角硫因(L-Ergothioneine，EGT)是一种稀有的天然手性氨基酸，是机体内重要的天然活性物质，具有很强的有抗氧化活性:清除活性氧族和活性氮化物，激活抗氧化物酶，抑制超氧化物歧化酶(Aruoma 01,Whiteman M,England TG,Halliwell B.Antioxidantaction ofergothioneine assessment of its ability to scavenge peroxynitrite.BBRC, 1997,231:389~391.)，抑制各种血红素蛋白发生氧化反应等(RomaroR, et al.Thereactivity of thiols and disulfides with different redox states tomyoglobin[J].Biol.Chem.,1992,267:1680~1688.)。此外，麦角硫因还具有防止紫外辐射(Rougee M，et al.Deactivation of singlet molecularoxygen by thiols and related compounds,possible protectors against skinphotosensitivity[J].Photochem.Photobiol.1988,47:485~489.)，螯合二价金属离子，调节生物体内的氧化还原平衡，参与细胞内的能量调节(Hartman PE.Ergothioneine as an antioxidant [J].Methods Enzymol, 1990,186:310~318.)，保护线粒体DNA，对外源物质解毒及细胞生理保护剂等多种功能。与其它抗氧化剂和活性物质相比，麦角硫因具有以下的优势:它是生物体内的天然产物，无毒，无异味；稳定性好，生理PH条件下不会自发氧化；极易溶于水，在水溶液中不易分解；对光、热不敏感；能同时清除自 由基和活性氧化物；对02_具有极高的亲和力。因此，麦角硫因在器官和细胞保存、医药、食品饮料、功能食品、动物饲料、化妆品及生物技术等领域具有广泛的用途和市场前景。
[0003]麦角硫因的制备方法有三类:化学合成法、提取法以及生物合成法。生物合成法包括固体发酵和液体深层发酵。用化学法合成左旋的麦角硫因十分困难，合成的原料昂贵，合成成本高，麦角硫因产品必须达到很高的纯度才能保证产品的安全；提取法因原料中麦角硫因的含量低，提取成本高；菌丝体的固体发酵法可以使用的提高麦角硫因含量的技术手段极为有限，菌丝体中麦角硫因的含量低；利用食用菌深层发酵制备麦角硫因是其商业化绿色生产的主导方向。
[0004]Pramvadee Tepwong(Pramvadee Tepwong, Anupam Giri, FumitoSasaki, etal.Mycobial enhancement of ergothioneine by submergedcultivation of ediblemushroom mycelia and its application as anantioxidative compound[J].FoodChemistry，2012，131:247 ~258.)、AhnJ(Republic KR Forestry Res Inst.Culturemedium of Ganodermaneo-japonicum for increasing ergothioneine and culturemethod ofGanoderma neo-japonicum[P].KR:KR20100025825A.)和黄龄谊(黄龄谊，高麦角硫因含量之杏鲍菇菌丝体深层培养及其生理活性[D].台湾:中兴大学，2010.)等人利用香燕(Lentinula edodes)、新日本灵芝(Ganoderma peo-japonicum)和杏鲍燕(Pleurotuseryngii)菌丝体进行液体深层发酵，菌丝体中麦角硫因的含量分别达到3.45mg/g Dff>3.43mg/g DW和3.93mg/g DW，折算成发酵液中麦角硫因的含量分别为23.6mg/L、57.5mg/L和 62.2mg/L。
[0005]目前深层发酵法制备麦角硫因的主要问题是产物的产率低，影响麦角硫因发酵产率的两个主要因素是生产菌种和生产工艺。因此，迫切需要筛选得到麦角硫因的高产菌株，建立菌株高效合成麦角硫因的方法。
[0006] 糖皮侧耳(Pleurotus ostreatus),属担子菌亚门(Basidiomycotina),侧耳属(Pleurotus),是一种食用菌。糙皮侧耳含丰富的营养物质，每百克干品含蛋白质20~23克，氨基酸成分种类齐全，矿物质含量丰富，含有钾、钠、钙、镁、锰、铜、锌、硫等14种微量元素，还含有维生素B2、维生素C、维生素D以及麦角固醇等。糙皮侧耳易于进行固体栽培和液体发酵培养，且生长迅速，产量高。

【发明内容】

[0007]本发明一个方面是提供一株糖皮侧耳(Pleurotus ostreatus)TIB.BPE.10010,已于2012年6月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC N0.6232。
[0008]该糙皮侧耳CGMCC N0.6232在麦芽汁琼脂培养基(MEA)上生长较快，于25°C黑暗条件下生长7天，菌落直径为58~60mm，呈白色，絮状，气生菌丝茂盛；背面呈浅褐色，无水溶性色素；其菌落形态特征参见图1。该菌株的营养菌丝壁光滑或粗糙，具分隔，分枝多，宽
2.1~8.6μπι;有锁状联合现象，未见无性孢子，参见图2。
[0009]该糙皮侧耳CGMCC N0.6232的rRNA基因序列(28S rDNA的D1D2区序列片段)和ITS序列分别为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2，参见图3和图4。
[0010]本发明所提供的糙皮侧耳CGMCC N0.6232的脂肪酸成分见后文的表1，G+C mol%含量为50.95%，该菌株的适宜生长温度是19~31°C，液体深层发酵时可以生物合成麦角硫因。
[0011]本发明的另一个方面是提供一种麦角硫因的生物合成制备方法，通过利用糙皮侧耳CGMCC N0.6232液体深层发酵而制备麦角硫因。
[0012]具体地，本发明提供一种麦角硫因的制备方法，包括:(a)在液体培养基中培养糙皮侧耳CGMCC N0.6232;和(b)将培养的糙皮侧耳CGMCC N0.6232在其生长期内接种至发酵培养基，由此通过糙皮侧耳CGMCC N0.6232使发酵培养基发酵。优选地，糙皮侧耳CGMCCN0.6232 获自 PDA(Becton,Dickinson and Company)斜面菌种。还优选地，培养的糖皮侧耳CGMCC N0.6232按4~20%的接种量(V/V)接种至发酵培养基。进一步优选地，步骤(a)的培养在约19~31°C、优选约25~28°C进行至少3天，例如约3~15天，优选约3~7天，更优选约3~5天；步骤(b)的培养在约19~31°C、优选约25~28°C进行至少6天，例如约7~20天,优选约7~15天,更优选约8~15天。更进一步地,培养在摇床上进行。仍进一步地，所述摇床的转速被设定为约100~200rpm。通过该方法,发酵液中麦角硫因的浓度至少为35mg/L,优选至少为50mg/L,更优选至少为70mg/L,还更优选至少为90mg/L,进一步优选至少为 100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L 或 140mg/L。[0013]更具体地，本发明的麦角硫因的制备方法包括如下步骤:
[0014]I)将糙皮侧耳 CGMCC N0.6232 的固体菌种(优选 PDA(Becton，Dickinson andCompany)斜面菌种)接种至液体种子培养基，在19~31°C、优选25~28°C摇床100~200rpm培养至少3天，例如约3~15天,优选约3~7天,更优选约3~5天,制备种子液；
[0015]2)将种子液按4~20%的接种量(V/V)接种至发酵培养基，发酵培养基在500mL三角瓶中的装液量为100~200mL，然后在19~31°C、优选25~28°C摇床100~200rpm培养至少6天,例如约7~20天,优选约8~15天,更优选约7~15天,得到糙皮侧耳菌丝体发酵液；
[0016]3)发酵结束后，将菌丝体发酵液升温至50~100°C、优选60~95°C、更优选80~90°C，以O~600rpm搅拌浸提10~lOOmin，麦角硫因从菌丝体的细胞内浸提到细胞外的发酵液中
[0017]所述的液体种子培养基的组成为:玉米粉15~50g/L(优选25~40g/L)、豆柏粉 10 ~35g/L (优选 15 ~25g/L)、α -淀粉酶 20 ~80U/L (优选 30 ~65U/L)、KH2PO4I ~6g/L (优选2~4.5g/L) 'MgSO40.2~5g/L (优选0.2~3g/L)，其余为水，初始pH自然，于500mL三角瓶中装液量为100~250mL。
[0018]进一步地，所述糙皮侧耳CGMCC N0.6232的种龄优选为4天。
[0019]所述的发酵培养基的组成为:碳源10~80g/L,氮源5~70g/L(优选5~40g/L)，无机盐1.2~llg/L (优选2.2~7.5g/L)，其余为水。
[0020]进一步地，所述的发酵培养基的碳源可以包括但不限于以下的一种或几种:糊精、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘油、麦芽糊精、麦芽糖浆、甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、乳糖、玉米淀粉和玉米粉。
`[0021]所述发酵培养基的氮源可以包括但不限于以下的一种或几种:酵母浸粉、玉米浆、麸皮、豆柏粉、豆饼粉、花生饼粉、麦芽浸出物、酪蛋白、浓缩蛋白、脱脂奶粉、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸铵、氨水、尿素、碳酸铵和硝酸钠。
[0022]所述发酵培养基的无机盐是KH2PO4和MgSO4。
[0023]更进一步地，所述的发酵培养基优选为:甘油10~80g/L，酪蛋白胨10~40g/L，KH2P042~4g/L，MgSO40.5~2g/L，其余为水。利用本发明方法生产麦角硫因，发酵液中麦角硫因的含量至少为35mg/L,优选至少为50mg/L,更优选至少为70mg/L,还更优选至少为90mg/L,进一步优选至少为 100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L 或 140mg/L。为了减少麦角硫因产品中的杂质，可以使用水浸提:发酵结束后，菌丝体发酵液经固液分离，收集菌丝体，加入水，制成菌丝体的水悬液。将菌丝体水悬液升温至50~100°C、优选60~95°C、更优选80~90°C，以O~600rpm搅拌浸提10~lOOmin，麦角硫因从菌丝体的细胞内被浸提到细胞外的水溶液中。
[0024]所述菌丝体发酵液的固液分离方法可以是过滤或离心。
[0025]本发明还涉及包括糙皮侧耳菌丝体和发酵液的组合物，所述发酵液包括麦角硫因，其中麦角硫因在所述发酵液中的浓度至少为35mg/L,优选至少为50mg/L,更优选至少为70mg/L,还更优选至少为90mg/L,进一步优选至少为100mg/L、110mg/L、120mg/L、130mg/L或140mg/L。所述糙皮侧耳优选为本发明所述的糙皮侧耳CGMCC N0.6232。
[0026]本发明的优势在于:利用本发明所提供的糙皮侧耳CGMCC N0.6232和本发明的发酵方法，进行液体深层发酵，发酵液中麦角硫因的含量高，原料价廉易得。
【专利附图】

【附图说明】
[0027]图1是糙皮侧耳CGMCC N0.6232的菌落形态特征的照片。
[0028]图2是糙皮侧耳CGMCC N0.6232菌丝体的显微照片。
[0029]图3是糙皮侧耳CGMCC N0.6232的rRNA基因序列的测定结果(28S rDNA的D1D2区序列片段)。
[0030]图4是糙皮侧耳CGMCC N0.6232的ITS序列测定结果。
[0031]图5显示不同发酵培养基碳源对麦角硫因产率的影响。
[0032]图6显示不同发酵培养基氮源对麦角硫因产率的影响。
【具体实施方式】
[0033]本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的【具体实施方式】，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其它的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。
[0034]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
[0035]下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036]实施例1:糙皮侧耳CGMCC N0.6232菌体脂肪酸成分的测定
[0037](I)测定方法
[0038]使用美国MIDI (Microbial Identification)公司 Sherolock 全自动细菌鉴定系统对实验菌株进行菌体脂肪酸成分分析。
[0039](2)试剂的配制
[0040]溶液1:将45g氢氧化钠溶于150mL甲醇及150mL蒸馏水。
[0041]溶液I1:将190mL浓盐酸、275mL甲醇溶于135mL蒸馏水。
[0042]溶液II1:将200mL正己烷与200mL甲基叔丁醚混合均匀。
[0043]溶液IV:将10.8g氢氧化钠溶于900mL蒸馏水。
[0044]溶液V:饱和氯化钠溶液。
[0045](3)提取方法
[0046]用接种环从PDA培养基表面刮取适量培养物，置于8mL螺口玻璃管中，加入ImL溶液I，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5~10s，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min。
[0047]待样品管冷却后，加入2mL溶液II，盖严振荡，随后精确控制80±1°C水浴lOmin，冰浴冷却；此步骤严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏。
[0048]在冷却的样品管中加入1.25mL溶液III，快速振荡IOmin左右，弃去下层水相。在剩余有机相中加入3mL溶液IV和几滴溶液V，快速振荡5min左右，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。
[0049](4)色谱分析:
[0050]采用Agilent Technologies的6890N气相色谱仪,配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器(FID)及HP气相色谱化学工作站(HPCHEMSTATION verA5.05);色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm,液膜厚度0.33 μ m ;炉温为二阶程序升温:起始温度170°C，每分钟5°C升至260°C，随后以40°C /min升至310°C，维持1.5min ;进样口温度250°C，载气为氢气，流速0.5mL/min，分流进样模式，分流比100: 1，进样量2μ L ;检测器温度300°C，氢气流速30mL/min,空气流速216mL/min,补充气(氮气)流速30mL/min。
[0051](5)测定结果:
[0052]菌体脂肪酸成分测定结果见下表1:
[0053]表1.糙皮侧耳CGMCC N0.6232菌株的菌体脂肪酸成分测定结果:脂肪酸名称脂肪骹名:称I屮义> !质暈百
【权利要求】
1.一株糙皮侧耳(Pleurotus ostre atus)TIB.ΒΡΕ.10010,保藏编号为 CGMCCN0.6232。
2.如权利要求1所述的糙皮侧耳CGMCCN0.6232，其rRNA基因序列(28S rDNA的D1D2区序列片段)为SEQ ID N0.1。
3.如权利要求1所述的糙皮侧耳CGMCCN0.6232，其ITS序列为SEQ ID N0.2。
4.如权利要求1所述的糙皮侧耳CGMCCN0.6232，其菌体脂肪酸成分包括1.33被％的omega5c-十五碳单不饱和脂肪酸、11.05wt%的十六碳饱和脂肪酸、0.63wt%的十七碳饱和脂肪酸、78.13wt%的反异式饱和十八碳脂肪酸/omega6,9c-型十八碳双不饱和脂肪酸、7.93wt%的omega 9c-十八碳单不饱和脂肪酸、和0.92wt%的饱和十八碳脂肪酸。
5.如权利要求1所述的糙皮侧耳CGMCCN0.6232，其基因组DNA的G+C mol%含量为50.95%。
6.如权利要求1所述的糙皮侧耳CGMCCN0.6232，其能够在发酵液中产生麦角硫因，其中麦角硫因在所述发酵液中的浓度至少为35mg/L。
7.一种组合物，包括糙皮侧耳菌丝体和发酵液，所述发酵液包括麦角硫因，其中麦角硫因在所述培养基中的浓度至少为35mg/L。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所述糙皮侧耳为如权利要求1-6中任一项所述的糙皮侧耳 CGMCC N0.6232。
9.一种麦角硫因的制备方法，包括如下步骤: 将糙皮侧耳CGMCC N0.6232的固体菌种接种至液体种子培养基，在25~28°C培养3~5天，制备种子液；和 将种子液按4~20%的接种量(V/V)接种至发酵培养基，然后在19~31°C培养7~15天，得到糙皮侧耳菌丝体发酵液。
10.如权利要求9所述的方法，进一步包括在发酵结束后，将菌丝体发酵液升温至50~100°C，以O~600rpm搅拌浸提10~lOOmin，将麦角硫因从菌丝体的细胞内浸提到细胞外的发酵液中的步骤。
11.如权利要求9所述的方法，进一步包括在发酵结束后，菌丝体发酵液经固液分离，收集菌丝体，加入水，制成菌丝体悬液，将菌丝体悬液升温至50~100°C，以O~600rpm搅拌浸提10~lOOmin，将麦角硫因从菌丝体的细胞内浸提到水溶液中的步骤。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述的液体种子培养基的组成为:玉米粉25~40g/L、豆柏粉 15 ~25g/L、α -淀粉酶 30 ~65U/L、ΚΗ2Ρ042 ~4.5g/L、MgSO40.2 ~3g/L，其余为水。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述的发酵培养基的组成为:碳源10~80g/L，氮源5~40g/L，无机盐2.2~7.5g/L，其余为水。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述的发酵培养基的碳源包括以下的一种或几种:糊精、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、山梨醇、甘油、麦芽糊精、麦芽糖浆、甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、乳糖、玉米淀粉、和玉米粉。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述的发酵培养基的氮源包括以下的一种或几种:酵母浸粉、玉米浆、麸皮、豆柏粉、豆饼粉、花生饼粉、麦芽浸出物、酪蛋白、浓缩蛋白、脱脂奶粉、牛肉膏、蛋白胨、酪蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸铵、氨水、尿素、碳酸铵和硝酸钠。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述的发酵培养基的无机盐是KH2PO4和MgS04。
17.如权 利要求13所述的方法，其中所述的发酵培养基为:甘油10~80g/L，酪蛋白胨.5 ~40g/L, KH2P042 ~4.5g/L，MgSO40.2 ~3g/L，其余为水。
【文档编号】A01H15/00GK103734022SQ201210392417
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年10月16日 优先权日:2012年10月16日
【发明者】姜文侠, 刘琦, 周涛 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所