专利名称：一种籼稻高效再生及遗传转化的方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种籼稻高效再生及遗传转化的方法。本发明适用于籼稻成熟胚或幼胚的愈伤组织诱导与再生，以及通过农杆菌介导外源基因的转化。
背景技术：
水稻是全球最重要的粮食作物之一，籼稻是我国主要的栽培类型。农杆菌介导的遗传转化，稳定性好，且载体容纳的外源DNA片段较大，成为水稻转基因的最优选择。该方法通过将目的基因片段插入农杆菌质粒上，然后让愈伤组织与农杆菌共培养，从而由载体将目的基因转移并整合到水稻基因组中。其基本程序包括构建转化载体，建立受体再生体系，导入目的基因，筛选抗性愈伤组织及获得分化的再生转基因植株等。通过转基因技术改良水稻品种已有二十多年的历史，但转化成功的报道主要集中在粳稻上，籼稻的再生及遗传转化难度相对较大。在最新的相关研究中(Lin YJ, Zhang Q等，Optimizing the tissue culture conditions for high efficiency transformationof indica rice,PlantCell Rep.，2005，23:540 547 ；Sivakumar P.等,High frequencyplant regeneration frommature seed of elite, recalcitrant Malaysian Indicarice (Oryza sativa L.)CV. MR219, ActaBiological Hungarica, 2010，61(3):313 321 ;Wani S. H.等，An efficient and reproduciblemethod for regeneration of wholeplants from mature seeds of a high yielding Indica rice(Oryza sativa L. ) varietyPAU201, New Biotechnol.，2011，28(4) :418 422)，籼稻遗传转化仍然存在转化频率低和基因型限制的技术瓶颈。目前，有关籼稻的转基因研究中，只有部分籼稻品种能够成功获得转基因植株。大部分籼稻较难分化，其转化周期较长，转化效率较低，甚至有些籼稻品种无法转化成功。其原因主要是缺乏籼稻通用的高效再生体系与遗传转化方法。针对籼稻再生及遗传转化的现状，我们详细研究了培养基的有机物成分、培养温度、激素配比、抑菌抗生素的种类与浓度等对籼稻愈伤组织诱导、继代增殖和外源基因转化的影响，通过转化方法的改进获得本发明，建立了一种籼稻高效再生及遗传转化的新方法。
发明内容
本发明针对籼稻现有遗传转化技术的不足，是在于提供了一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，建立了籼稻再生与转化的操作流程，筛选简便，效率较高。提高了籼稻遗传转化的效率，对3个籼稻代表性品种如9311、M5274 (籼型两系恢复系)、E09-2076 (籼型三系保持系)进行了转化，转化率均在25%以上。转化过程中的培养条件除了共培养、第一次筛选阶段为26°C外，其余均为32 34°C高温条件。本发明通过以下技术方案实现—种籼稻高效再生及遗传转化的方法，它包括以下步骤
( I)愈伤组织的诱导以籼稻成熟胚或幼胚为外植体，先用75%体积比的酒精浸泡lmin，再用O. 1%质量比的氯化汞浸泡10 12min，无菌水洗涤4 5次，最后将灭过菌的外植体接入诱导培养基，在32-34°C下暗培养20-30天，诱导愈伤组织；(2)愈伤组织的继代增殖从上述得到的愈伤组织中挑选生长旺盛的淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代增殖培养基，置于32 34°C暗培养条件下，继代培养10 15天；(3)愈伤组织的预培养将生长旺盛、颗粒直径2 3_的淡黄色愈伤组织块接种于籼稻愈伤组织的预培养培养基上，32 34°C暗培养3 5天；(4)农杆菌介导的胚性愈伤转化将YEB平板上生长的农杆菌刮到含有乙酰丁香酮的悬菌培养基里，在菌液吸光度为0D_=0. I O. 5的范围内进行农杆菌介导的胚性愈伤转化，将预培养的愈伤组织转移到农杆菌工作菌液中，室温(20 - 25°C，下同)浸泡10 20min ；(5)愈伤组织与农杆菌的共培养将侵染后的愈伤组织浙干农杆菌菌液，转入无菌滤纸上，在超净台上晾干30 60min，然后将愈伤组织颗粒挑到籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基上，26°C下暗培养2 3天；(6)抗性愈伤组织的筛选将共培养后的愈伤组织用无菌水洗净，加入含300 500mg/L特美汀的无菌水溶液浸泡10 20min，用无菌滤纸吸干后接入筛选培养基上筛选2次；第一次筛选为26°C下暗培养10 15天；第二次筛选为32 34°C下暗培养15 20天，直到长出所需的抗性愈伤组织；( 7)抗性愈伤组织的分化将筛选后得到的抗性愈伤组织接入分化培养基，于32 34°C下2000LUX光照培养15 30天，再生绿苗；(8)再生苗的生根将4cm以上的再生苗转入生根培养基，32 34°C，2000Lux光照培养15 30天，获得完整的生根转基因植株。在本发明中，所述的诱导培养基组分为以MS为基本培养基，添加2. 5mg/L 2，4-D, 800mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺,500mg/L脯氨酸,30g/L鹿糖,2. 5g/L植物凝胶，PH 为 5. 8 6. O。所述的愈伤继代增殖培养基的组分如下以MS为基本培养基，添加2. O 3. 5mg/L 2,4-D, O. 05 O. 30mg/L KT，500 800mg/L水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，2. 5g/L植物凝胶，PH为5. 8 6. O。所述的籼稻愈伤组织的预培养培养基的组分如下以1/2MS为基本培养基，添加
2.O 3. 5mg/L 2,4-D, O. 05 O. 30mg/L KT，500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸,20g/L鹿糖，10g/L葡萄糖,3. 5g/L植物凝胶，100 200uM的乙酰丁香酮，PH为5. 6。
所述的农杆菌的悬菌培养基的组分如下以1/2MS为基本培养基,添加2. O
3.5mg/L2，4-D，O. 05 O. 30mg/L KT, 20g/L 蔗糖，10g/L 葡萄糖，100 200uM 的乙酰丁香酮，PH 为 5. 6。所述的籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基的组分如下以1/2MS为基本培养基，添加 2. O 3. 5mg/L 2,4-D, O. 05 O. 30mg/L KT，500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺,300 500mg/L脯氨酸,20g/L鹿糖，10g/L葡萄糖,3. 5g/L植物凝胶，100 200uM的乙酰丁香酮，PH为5. 6。所述的筛选培养基的组分如下以MS为基本培养基，添加2. O 3. 5mg/L 2,4-D,O. 05 O. 30mg/L KT, 500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L 谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3. Og/L植物凝胶，25 60mg/L潮霉素，300 500mg/L特美汀，PH为
5.8 6. O ;第一次筛选培养基的潮霉素浓度为25 40mg/L,第二次筛选培养基的潮霉素浓度为40 60mg/L。所述的分化培养基的组分如下以MS为基本培养基，添加I. 5 2. 5mg/L BA，O. 5 I. 5mg/L KT, O. 3 O. 8mg/L NAA, 500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L 谷氨酰胺，30g/L蔗糖，2. 5g/L植物凝胶，PH5. 8-6. O。所述的再生苗的生根培养基的组分如下以1/2MS为基本培养基，添加I. Omg/LNAA，O. 2mg/L IBA，30g/L 蔗糖，O. 2g/L 活性炭，6. Og/L 琼脂，ρΗ6· O。本发明的优点在于本发明具用具有广泛代表性，对3个籼稻代表性品种如9311、Μ5274 (籼型两系恢复系)、Ε09-2076 (籼型三系保持系)进行了转化，效率较高，均在25%以上。转化过程中的培养条件除了共培养、第一次筛选阶段为26°C外，其余均为32 34°C高温条件，愈伤组织生长速度快，转化周期短(见表I)。以特美汀作为抑菌剂，抑菌效果好，避免了共培养过程中农杆菌的过度生长对愈伤组织的负面影响(见表2)。优化后的激素配比利于愈伤组织的分化成苗，提高了转化效率(见表3)。本发明方法在籼稻转基因研究和分子育种中具有较好的实用性和高效性。表I不同培养温度对籼稻M5274愈伤继代的影响
权利要求
1.一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其步骤是(O愈伤组织的诱导以籼稻成熟胚或幼胚为外植体，先用75%体积比的酒精浸泡，再用O. 1%质量比的氯化萊浸泡10 12min,无菌水洗漆4 5次,最后将灭过菌的外植体接入诱导培养基,在32 34°C下暗培养20 30天，诱导愈伤组织；2)愈伤组织的继代增殖从上述得到的愈伤组织中挑选生长旺盛的淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代增殖培养基，置于32 34°C暗培养条件下，继代培养10 15天；(3)愈伤组织的预培养将生长旺盛、颗粒直径2 3_的淡黄色愈伤组织块接种于籼稻愈伤组织的预培养培养基上，32 34°C暗培养3 5天；(4)农杆菌介导的胚性愈伤转化将YEB平板上生长的农杆菌刮到含有乙酰丁香酮的农杆菌的悬浮培养基里，在菌液吸光度为0D600 = O. I O. 5的范围内进行农杆菌介导的胚性愈伤转化，将预培养的愈伤组织转移到农杆菌工作菌液中，室温浸泡10 20min ；(5)愈伤组织与农杆菌的共培养将侵染后的愈伤组织浙干农杆菌菌液，转入无菌滤纸上，在超净台上晾干30 60min，然后将愈伤组织颗粒挑到籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基上，26°C下暗培养2 3天;(6)抗性愈伤组织的筛选将共培养后的愈伤组织用无菌水洗净，加入含300 500mg/L特美汀的无菌水溶液浸泡10 20min，用无菌滤纸吸干后接入筛选培养基上筛选2次；第一次筛选为26°C下暗培养10 15天；第二次筛选为32 34°C下暗培养15 20天，直到长出的抗性愈伤组织；(7)抗性愈伤组织的分化将筛选后得到的抗性愈伤组织接入分化培养基，于32 34°C下2000LUX光照培养.15 30天，再生绿苗；(8)再生苗的生根将4cm以上的再生苗转入生根培养基，32 34°C，2000Lux光照培养15 30天，获得完整的生根转基因植株。
2.根据权利要求I所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于所述的诱导培养基组分为=MS +2. 5mg/L 2，4_D+800mg/L水解酪蛋白+500mg/L谷氨酰胺+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+2. 5g/L植物凝胶、PH为5. 8 6. O。
3.根据权利要求I的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于所述的继代增殖培养基的组分如下以MS为基本培养基，添加2. O 3. 5mg/L 2，4-D，O. 05 O. 30mg/L KT, 500 800mg/L水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，2. 5g/L植物凝胶，PH为5. 8 6. O。
4.根据权利要求I所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于所述的籼稻愈伤组织的预培养培养基的组分如下以1/2 MS为基本培养基，添加2. O 3. 5mg/L.2,4- ,Ο. 05 O. 30mg/L KT, 500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L 谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸,20g/L鹿糖，10g/L葡萄糖,3. 5g/L植物凝胶，100 200uM的乙酰丁香酮，PH 为 5. 6。
5.根据权利要求I所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于所述的农杆菌的悬菌培养基的组分如下以1/2 MS为基本培养基，添加2. O 3. 5mg/L 2，4_D，.O. 05 O. 30mg/L KT, 20g/L 蔗糖，10g/L 葡萄糖，100 200uM 的乙酰丁香酮，PH 为 5. 6。
6.根据权利要求I所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于所述的籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基的组分如下以1/2 MS为基本培养基，添加2. O .3.5mg/L 2,4- ,Ο. 05 O. 30mg/L KT, 500 800mg/L 水解酪蛋白，300 500mg/L 谷氨酰胺,300 500mg/L月甫氨酸，20g/L鹿糖，10g/L葡萄糖，3. 5g/L植物凝胶，100 200uM的乙酰丁香酮，PH为5. 6。
7.根据权利要求I所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于所述的筛选培养基的组分如下以MS为培养基，添加2. O 3. 5mg/L 2，4-D，O. 05 O. 30mg/L KT, 500 800mg/L水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，3. Og/L植物凝胶，25 60mg/L潮霉素，300 500mg/L特美汀，PH为5. 8 6. O ;第一次筛选培养基的潮霉素浓度为25 40mg/L,第二次筛选培养基的潮霉素浓度为40 60mg/L。
8.根据权利要求I所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于所述的分化培养基的组分如下以MS为培养基，添加I. 5 2. 5mg/L BA, O. 5 I. 5 mg/L KT,.O. 3 O. 8 mg/L NAA，500 800mg/L水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺，30g/L蔗糖，.2.5g/L 植物凝胶，PH5. 8-6. O。
9.根据权利要求I所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于所述的生根培养基的组分如下:以1/2 MS为培养基，添加1.0mg/L NAA, 0. 2mg/L IBA，30g/L蔗糖，.0. 2g/L 活性炭，6. 0g/L 琼脂，ρΗ6· O。
全文摘要
本发明公开了一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，步骤:(1)愈伤组织的诱导以籼稻成熟胚或幼胚为外植体；(2)愈伤组织的继代增殖挑选淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代增殖培养基培养；(3)愈伤组织的预培养；(4)农杆菌介导的胚性愈伤转化将预培养的愈伤组织转移到农杆菌工作菌液中，室温浸泡；(5)愈伤组织与农杆菌的共培养；(6)抗性愈伤组织的筛选将共培养后的愈伤组织进行筛选，长出新的抗性愈伤组织；(7)抗性愈伤组织的分化将筛选后的抗性愈伤组织接入分化培养基；(8)再生苗的生根获得生根转基因植株。筛选简便，效率高。提高了籼稻遗传转化的效率，对3个籼稻代表性品种进行了转化，转化率均在25%以上。
文档编号A01H4/00GK102943090SQ201210403168
公开日2013年2月27日 申请日期2012年10月19日 优先权日2012年10月19日
发明者向发云, 李三和, 游艾青, 顾玉成, 韩光明, 陈志军, 周雷, 刘凯, 杨国才 申请人:湖北省农业科学院