专利名称：一种兔窦房结慢性损伤模型的建立方法及其专用电极的制作方法
技术领域：
本发明属于医学领域中的动物模型领域，具体涉及一种兔窦房结慢性损伤模型的建立方法。
背景技术：
病态窦房结综合征(Sick Sinus Syndrome, SSS)是一种临床常见的难治性心律失常疾病，其发病机制尚未明确，已有研究表明，窦房结细胞损伤导致起搏及传导功能障碍是其直接原因。建立稳定、可重复的窦房结慢性损伤(Chronic Sinus Node Dysfunction,CSND)模型是对SSS进行实验研究的前提。CSND模型成功的关键是在尽可能减少动物窦房结周围组织及其他组织器官损伤·的前提下，造成窦房结慢性损伤，使心脏电生理各项指标在造模后一段时间内趋于稳定，符合临床SSS的特征。目前CSND模型的建立方法主要通过冰冻消融窦房结区法、射频消融窦房结区法、结扎窦房结血供动脉法、甲醛湿敷窦房结区法等造成窦房结细胞损伤来实现。这些方法存在较难精确定位窦房结区、损伤范围较大、存活率较低的弊端。例如，冰冻消融窦房结区法及射频消融法依赖于大型设备，操作难度较大，不适宜建立类似兔这样较小动物的CSND模型；结扎窦房结血供动脉法可成功建立窦房结急性损伤模型，兔窦房结主要血供来源于右冠脉，但兔窦房结区面积较小，暴露右冠脉部位欠佳，使用该法易造成心脏其他组织损伤，对建立CSND模型难度较大；甲醛湿敷法虽然能够建立CSND模型，但需在体表进行3 5cm切口并钳断2根肋骨，损伤较大，此外，甲醛湿敷法难以精确定位窦房结区，容易造成心脏其他组织的损伤，并易造成右心耳出血及胸膜破裂导致气胸，不利于模型动物术后存活。
发明内容
本发明的目的在于提供一种兔窦房结慢性损伤模型的建立方法。本发明采用的技术方案是一种兔窦房结慢性损伤模型的建立方法，包括以下步骤(一 )将兔麻醉后，背位固定于兔台上，记录体表心电图；( 二)胸前区备皮，沿胸骨右缘第三肋处纵行开胸I. 5-2. 5cm,逐层分离表皮及肌肉组织，钳断右侧第三肋，经纵膈打开心包，暴露右心耳；(三)将连接心电图Vl导联的电极置于兔心脏的近窦房结区表面并缓慢移动，根据心电图的特征(即心电图显示出窦房结区电图特征)定位窦房结区的准确位置，向该位置施加20%的甲醛溶液，待兔心率下降至原心率的50% 70%时，停止施加甲醛溶液，静脉注射硫酸阿托品2mg，如兔心率稳定于原心率的50% 70%，则可实施步骤(四)；如注射硫酸阿托品后兔心率回升到原心率的70%以上，则需再次施加甲醛溶液，当兔心率又下降至原心率的50% 70%时，停止施加甲醛溶液，再次静脉注射硫酸阿托品2mg，如此交替施加两种药物，直至静脉注射硫酸阿托品后兔心率仍稳定于原心率的50% 70% ;
(四)冲洗胸腔，逐层关胸，饲养备用。优选地,所述兔为大耳白兔。优选地,所述步骤(一)中，所述麻醉采用以3%戍巴比妥钠按30mg/kg剂量耳缘静脉麻醉实施。优选地，所述步骤(三)中，所述向窦房结区施加甲醛溶液的方法是通过注射器向窦房结区表面推注甲醛溶液。这样可以根据需要随时启动或停止施加甲醛溶液，并且便于准确控制甲醛溶液的用量和推注速度。更优选地，所述甲醛溶液通过直径不超过4_的无菌棉球施加至窦房结区表面。这样的设计不仅使甲醛溶液对窦房结区的浸润位置更加准确，而且可以将甲醛溶液锁住而不致外流，以减少甲醛溶液对周围组织的损伤。优选地，在完成步骤(三)后，应待兔心率稳定于原心率的50% 70%达2小时后再实施步骤(四)。
为了更好地实施本发明兔窦房结慢性损伤模型的建立方法，本发明同时还提供一种用于实施步骤(三)的窦房结定位注射渗透电极装置。一种窦房结定位注射渗透电极装置，所述装置包括储液器(I)、注液接口(2)、金属电极针(3);其中储液器(I)包括储液器主体(Ia)和储液器颈(Ib);储液器主体(Ia) —端封闭，另一端与储液器颈(Ib)连通；储液器颈(Ib) —端与储液器主体(Ia)连通，另一端开放；注液接口(2)的一端与储液器主体(Ia)连通，另一端开放，且该开放端可与医用注射器实现密闭连接；金属电极针(3)从内部贯穿储液器主体(Ia)和储液器颈(Ib)，且其两端从储液器(I)中伸出；金属电极针(3)从储液器主体(Ia)伸出的一端用于连接心电图Vl导联，金属电极针(3)从储液器颈(Ib)伸出的一端用于将储液器(I)内的液体导至窦房结区。优选地，金属电极针(3)与所述储液器颈(Ib)内壁之间的空隙使储液器主体(Ia)中的液体仅凭重力作用不能流出，需在所述注射器的推力作用下沿金属电极针(3)的下端流出。这样不仅可以用注射器精确控制施加液体的用量，而且可以控制液体流出的速度。优选地，金属电极针(3)从储液器颈(Ib)端伸出的一端的末端缠绕无菌棉。这样可将多余甲醛溶液锁住而不致外流，减小了对周围组织的损伤；且电极一直固定于窦房结区，确保了窦房结区定位的一致性。优选地，所述金属电极针(3)从储液器颈(Ib)端伸出的一端的末端弯成圆环(3b)或爪钩，所述圆环(3b)或爪钩的内径不超过4mm。以本发明窦房结定位注射渗透电极的上述优选实施方式实施制备兔窦房结慢性损伤模型的步骤(三)时，金属电极针下端的金属圆环(3b)缠绕有无菌棉，棉球有效直径不超过4_，将所述金属电极针的上端(3a)连接心电图vl导联，然后将金属圆环(3b)置于近窦房结区并缓慢移动，当心电图显示出窦房结区电图特征时，停止移动金属圆环(3b)并固定位置，使用注射器(例如规格为Iml的注射器)与注液接口(2)密闭连接并缓慢向储液器主体(Ia)中注入20%的甲醛溶液，在注射压力的作用下，甲醛溶液进入储液器颈(lb)，并沿金属电极针(3)到达金属圆环(3b)上的无菌棉球，从而在窦房结区直径4mm的局部位置内发挥药效。与现有的各种兔窦房结慢性损伤模型建立方法相比，本发明的方法具有如下优
占-
^ \\\ ·I.方法简单，易于操作，不依赖于大型设备；2.采用注射器进行甲醛溶液的推注，易于控制甲醛溶液的使用量；
3.金属圆环(3b)上缠绕的直径不超过4mm的无菌棉球，可将多余甲醛溶液锁住而不致外流，减小了对周围组织的损伤；且电极一直固定于窦房结区，避免了因直接使用注射器注射药物时反复插拔而感染的机会及窦房结定位的不一致性；4.通 过窦房结电图准确定位窦房结区，使甲醛溶液的施加靶位更加准确、具体，相比于甲醛湿敷法中直接用棉球敷药，可显著降低因窦房结周围组织及心脏其他组织损伤而造成心脏出血的几率；5.相比于甲醛湿敷法，由于施药靶位准确，因此可将胸部切口的长度由原来的3-5cm减小到2cm左右，需钳断的肋骨也由原来的2根减少到I根，从而可有效避免手术造成的右心耳出血及胸膜破裂导致的气胸，提高了模型动物的术后存活率；6.造模成功率高，且模型较稳定；7.可行性、重复性好。
图I为兔窦房结电图；图中所示信息包括心率为164次/分、最大值O. 79mV、最小值-O. 99mV、峰峰值I. 78mV ;特征为出现深大负向之P波及相对较小的QRS波群。图2为窦房结定位注射渗透电极装置的纵向剖面图的简化示意图。附图标记列表I储液器Ia储液器主体Ib储液器颈2储液器上的注液接口3金属电极针(全针通常用不锈钢制成)3a金属电极针的上端3b金属电极针下端的金属圆环
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。实施例I甲醛湿敷法和甲醛加压注射渗透法制造兔窦房结慢性损伤模型的比较材料与方法I实验动物大耳白兔35只，普通级，体重2. 5±0. 5kg，雌雄不拘，广安门医院实验动物中心提供(许可证号SCXK (京)2005-0009)。2实验分组实验动物按随机数字表随机分为甲醛湿敷组(以下简称为“湿敷组”)和甲醛加压注射渗透组(即使用本发明方法组，以下简称为“新方法组”)，每组15只；另有5只做为假手术组(即按甲醛加压注射渗透组方法实施手术，但以生理盐水代替甲醛溶液)。3实验仪器BL-420F生物机能实验仪(成都泰盟科技有限公司)；DF_4A心脏电生理刺激仪(东方电子仪器厂)；自制窦房结定位注射渗透电极。
4实验试剂3%戊巴比妥钠(sigma，批号018k0754)，20 %甲醛溶液(国药集团，批号20091015)，硫酸阿托品注射液(天津金耀氨基酸有限公司，批号H12020382)，注射用青霉素钠(80万单位，华北制药，批号Y0909210)5实验方法5. I窦房结慢性损伤模型的建立取健康大耳白兔，以3%戊巴比妥钠按30mg/kg剂量耳缘静脉麻醉，背位固定于兔台上，记录体表心电图。胸前区备皮，沿胸骨右缘2 3mm第三肋处纵行开胸(开口长度湿敷组3-5cm、新方法组约2cm)，逐层分离表皮及肌肉组织，钳断右侧部分肋骨(湿敷组钳断第三、四肋，新方法组钳断第三肋)，经纵膈打开心包(避免损伤右胸膜)，暴露右心耳，然后，·
湿敷组，以直径5mm棉签蘸取20%甲醛溶液湿敷近窦房结区(上腔静脉与右心耳之间)；新方法组，将自制窦房结定位注射渗透电极的上端(3a)连接心电图vl导联，将金属圆环(3b)上缠绕少量无菌棉后(不要影响导电性)置于兔心脏近窦房结区的表面并缓慢移动，当心电图显示出窦房结区电图特征时(即出现深大负向之P波及相对较小的QRS波群)，停止移动电极并固定位置，于注液接口(2)处密闭连接微量注射器，推注20%甲醛溶液O. 01-0. 02ml，使之经棉球作用于窦房结区；两组均待兔心率下降至原心率的50% 70%时,静脉注射硫酸阿托品2mg,观察兔心率变化情况。如兔心率回升到原心率的70%以上，则再次施加甲醛溶液，当兔心率又下降至原心率的50% 70%时，停止施加甲醛溶液，再次静脉注射硫酸阿托品2mg，如此交替施加两种药物，直至注射硫酸阿托品后兔心率仍稳定于原心率的50% 70%。当兔心率稳定于原心率的50% 70%达2小时，则以青霉素生理盐水冲洗胸腔，逐层关胸，精心饲养备用。剔除动物1.实验过程中造成气胸者。2.饲养过程中出现感染及死亡者。5. 2观察指标5. 2. I心率及心律兔四肢皮下插入电极连接BL-420F生物机能实验仪，实验仪与电脑相连输出，记录体表心电图，以连续10个AA间期的均值计算心率,分别于造模前及造模后2h、24h、lw、2w测定并观察心律失常情况。5. 2. 2电生理指标采用心外膜调搏法，以银针电极两根作为心外膜调搏电极，一根作为刺激电极，置于右心耳高位，另一根作为参考电极置于右心耳，电极另一端连接心脏电生理刺激仪。以体表心电图记录电生理变化，分别于造模前及造模后2h、2w测定以下指标(I)SACT(窦房传导时间)设置输出电压为3v，选择高于兔心脏基础心率的10% 15%的频率周期。短阵起搏心房，步长-10ms，SI : S2为8 : I反扫，以Narula法计算SACT。⑵SNRT (窦房恢复时间):采用超速抑制分级递增法刺激心房，间隔lmin，以最后一个心房刺激到恢复第一个窦性周期之间的最长间歇作为SNRT记录。
(3)cSNRT (校正窦房恢复时间)cSNRT = SNRT-SCL (窦性周期)。5. 2. 3造模成功率及兔死亡率记录两组动物造模后兔存活情况，计算两组造模成功率及兔死亡率。5. 2. 4窦房结组织细胞形态观察从两实验组中每组取3只兔行窦房结组织细胞形态观察，分别于第2w完成电生理指标的测量后安乐处死，迅速取出心脏并用生理盐水冲洗，分离右心耳及上、下腔静脉，剪开上、下腔静脉，于上腔静脉入口以下至下腔静脉口以上界嵴的腔静脉侧切取窦房结组织。将切取的窦房结组织经生理盐水冲洗干净后立即置入4%多聚甲醛固定48h，梯度酒精脱水、透明、石蜡包埋、各组织采用横向连续切片，片厚6 μ m，隔10取1，做HE染色，以确定窦
房结组织具体起始位置，随后各组织选取相对一致的层面间取5张白片继续行HE染色，使用Olympus IX-70倒置荧光显微镜观察窦房结组织形态结构的改变。6统计分析所有数据以均数土标准差表示。采用spssie. O软件，做t检验及方差分析，以P< O. 05为差异有显著性。结果之一两组的共同之处I心率及节律变化湿敷组及新方法组造模后21!、241!、1 、2 心率均较造模前明显下降，经〖检验与造模前有明显差异(P <0.01)。18只造模成功兔中有14只出现窦性停搏、窦房阻滞、结性逸搏等心律失常。湿敷组与新方法组造模后2h、24h、lw、2w心率组间比较无统计学差异(P>
O.05)，且均与造模前不同，证实两种手术方法均可成功建立窦房结慢性损伤模型。见表I。表I两组兔造模前后心率变化(X± s，次/分)
权利要求
1.一种兔窦房结慢性损伤模型的建立方法，包括以下步骤 (一)将兔麻醉后，背位固定于兔台上，记录体表心电图； (二)胸前区备皮，沿胸骨右缘第三肋处纵行开胸1.5-2.5cm，逐层分离表皮及肌肉组织，钳断右侧第三肋，经纵膈打开心包，暴露右心耳； (三)将连接心电图Vl导联的电极置于兔心脏的近窦房结区表面并缓慢移动，当心电图显示出窦房结区电图特征时，向电极所处的窦房结区表面局部施加20%的甲醛溶液，待兔心率下降至原心率的50% 70%时，停止施加甲醛溶液，静脉注射硫酸阿托品2mg，如兔心率稳定于原心率的50% 70*%，则可实施步骤(四)；如注射硫Ife阿托品后兔心率回升到原心率的70%以上，则再次施加甲醛溶液，当兔心率又下降至原心率的50% 70%时，停止施加甲醛溶液，再次静脉注射硫酸阿托品2mg，如此交替施加两种药物，直至静脉注射硫Ife阿托品后兔心率仍稳定于原心率的50% 70% ； (四)冲洗胸腔，逐层关胸，饲养备用。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(一)中，所述麻醉是以3%戊巴比妥钠按30mg/kg剂量耳缘静脉注射实施的。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(三)中，所述施加甲醛溶液的方法是通过用注射器向电极所处的窦房结区表面局部推注甲醛溶液而实现。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述注射器的尖端附有直径不超过4mm的无菌棉球。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于完成步骤(三)后，需待兔心率稳定于原心率的50% 70%达2小时后，再实施步骤(四)。
6.一种用于实施权利要求1-5中任一项所述方法的窦房结定位注射渗透电极装置，其特征在于该装置包括储液器(I)、注液接口(2)、金属电极针(3)三部分；其中储液器(I)包括储液器主体(Ia)和储液器颈(Ib);储液器主体(Ia) —端封闭，另一端与储液器颈(Ib)连通；储液器颈(Ib) —端与储液器主体(Ia)连通，另一端开放；注液接口(2)的一端与储液器主体(Ia)连通，另一端开放，且该开放端可与注射器实现密闭连接；金属电极针(3)从内部贯穿储液器主体(Ia)和储液器颈(Ib)，且其两端从储液器(I)中伸出。
7.根据权利要求6所述的电极装置，其特征在于金属电极针(3)与储液器颈(Ib)内壁之间的空隙使储液器主体(Ia)中的液体仅凭重力作用不能流出，需在所述注射器的推力作用下才能沿金属电极针(3)从储液器颈(Ib)的开放端流出。
8.根据权利要求6或7所述的电极装置，其特征在于金属电极针(3)从储液器颈(Ib)端伸出的一端的末端为直径不超过4_的金属圆环(3b)。
9.根据权利要求6或7所述的电极装置，其特征在于该装置还包括一个可与注液接口(2)实现密闭连接的注射器。
10.根据权利要求8所述的电极装置，其特征在于该装置还包括一个可与注液接口(2)实现密闭连接的注射器。
全文摘要
本发明提供了一种兔窦房结慢性损伤模型的建立方法，该方法是将兔麻醉后，背位固定于兔台上，记录体表心电图；于胸前区备皮，沿胸骨右缘第三肋处纵行开胸，逐层分离表皮及肌肉组织，钳断右侧第三肋，经纵膈打开心包，暴露右心耳；将连接心电图v1导联的电极置于兔的近窦房结区并缓慢移动，当心电图显示出窦房结区电图特征时，即向电极所在区施加20％的甲醛溶液，待兔心率下降至原心率的50％～70％时，静脉注射硫酸阿托品2mg，至心率停止回升时，停止施加甲醛；冲洗胸腔，逐层关胸，饲养备用。本发明还提供一种实施所述方法的窦房结定位注射渗透电极。与现有技术相比，本发明方法造模成功率高，且模型较稳定，可行性、重复性好。
文档编号A61D1/00GK102908204SQ20121041097
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月25日 优先权日2012年10月25日
发明者刘如秀 申请人:中国中医科学院广安门医院