专利名称：一种月月红体细胞胚胎发生及植株再生方法
技术领域：
本发明涉及一种月月红体细胞胚胎发生及植株再生方法，尤指一种以2，4-D和TDZ共同诱导中国月季月月红体细胞胚胎发生的方法及该方法在月月红快速繁殖、基因转化、人工体胚中的应用。
背景技术：
体细胞胚胎发生(Somatic Embryogenesis)是指在离体培养条件下植物的体细胞通过与合子胚类似的途径发育成新个体的过程。由于其速度快、数量大、结构完整等特点，利用体细胞胚胎发生进行乔木树种的人工种子育苗，可能成为未来人工林苗木来源的一种重要手段；由于体细胞胚胎往往产生于单个细胞，通过体细胞胚胎发生途径进行基因转化，有利于获得纯合的转基因植株；此外，胚性培养物是全能性原生质体的重要来源，可用于树种的遗传转化及体细胞杂交等研究，达到改良森林树种的目的。
体细胞胚胎发生是植物界的普遍现象，自1948年Curits等从兰属杂种胚愈伤组织中首次发现和正常胚相似的胚状体结构以来，已在43科97属114种植物中有了体细胞胚胎发生的报道。木本植物的体细胞胚胎发生研究起步较晚，但这个领域的研究却取得了令人瞩目的进展。据初步统计已从挪威云杉、油棕、石刁柏、欧洲七叶树、胡桃楸、花旗松等树种中有体细胞胚胎发生报道。月季是世界四大切花之一，也是中国十大名花之一，其中中国古老月季月月红是现代月季的鼻祖，在月季/玫瑰育种中占有非常重要的位置。月季的体细胞胚胎发生虽已有报道，但未见月月红体胚胎成功的报道。本发明人一直从事月月红体细胞胚胎发生和再生研究，发现通过激素调控可以诱导月月红的器官发生(Organogenesis)，直接产生芽，但是诱导率和再生率非常低，未见合子胚类似的体胚发生。不能形成快速、完整、幼化再生株系，难以通过基因转化途径改良月季(月月红)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种月月红体细胞胚胎发生及植株再生方法，是含2，4-D、TDZ、ABA、GA3和L-脯氨酸的多种培养基在不同光质和光强条件下的应用，具体地说，就是用上述激素和有机物组成搭配成不同培养基，在不同光质和光强条件下对月月红叶柄体细胞进行分阶段诱导，最后诱导出体细胞胚胎和再生植株。为了解决上述技术问题，本发明所采用技术方案是一种用于月月红体细胞胚胎发生的胚性愈伤诱导方法，该方法是将带有O. 8-1. 2_叶柄的月月红无菌芽嫩叶置于EP培养基中，在23°C 27°C黑暗培养2-6个月(一般2个月就可以获得愈伤组织，如需获得更多愈伤组织，可以延长时间)，得到透明水溃状或浅棕色的胚性愈伤组织；EP培养基组成SH培养基+2，4-D3.0mg/L+TDZ1.0mg/L+ L-脯氨酸300. O mg/L，并加入4. Og/L琼脂糖固化培养基，PH值为5. 4。在该培养条件下，月月红的愈伤组织可以长期培养，并保护体细胞胚胎发生能力。上述无菌芽是取一年生半木质化枝条表面消毒后，置于SP培养基上培养1-3个月得到；SP 培养基组成MS 固体培养基+6-BA2. Omg/L+NAA O. lmg/L+GA33. 0mg/L，pH值为 6. O,121°C、125 kPa灭菌15min，培养条件温度为23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照强度为白光1600LUX，。上述表面消毒是指先用70%体积浓度的酒精消毒30秒，再置于O. 3%体积浓度的次氯酸钠溶液中15分钟,最后用无菌水清洗3次。本发明还提供一种月月红体细胞胚胎发生方法，该方法是将上述月月红胚性愈伤组织置于EM培养基上培养1-3个月，得到两片子叶为主的体细胞胚；EM培养基组成SH培养基+2，4-D1. 0mg/L+TDZ0. 2mg/L+L_ 脯氨酸 300mg/L+ABA2. 5mg/L+ GAS3. Omg/L，培养条件温度为23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照强度为红光400Lux。本发明另提供一种月月红体细胞胚胎再生植株方法，该方法是将上述月月红体细胞胚置于SP2培养基上培养1-3个月以产生芽，再按常规技术培育出植株；SP2培养基组成MS 固体培养基 +6-BA1. 0mg/L+NAA0. 2mg/L+L-脯氨酸 300mg/L+ GAS3. 0mg/L,培养条件温度为23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照强度为普通白光1600Lux。本发明还提供在月月红转基因和种质改良、创新中的应用，以及在月月红人工种子制作、良种推广中的应用。现有技术通过单一的2，4-D诱导，在暗培养结合单一白光下培养的方法，虽然能诱导出芽状胚，但出现频率非常低；没有培养出合子胚类似的子叶，营养积累不够，再生难，不正常胚多，用于快速繁殖和基因转化相当困难。本发明解决了现有技术中多体细胞胚胎发生频率低、再生难、不正常胚多等问题。采用本发明的方法，利用2，4-D和TDZ结合共同诱导，胚性愈伤诱导率大大提高；利用暗培养结合低光强红光(400LUX)再到普通白光(1600LUX)，增加体胚诱导过程中胚对红光的偏好和对光强的适应性，促进胚养分的积累和子叶的形成；利用ABA的适当增加，促进体胚由芽向单个子叶、双子叶和多个子叶过渡。从而确定最佳诱导双子叶体胚的浓度和条件，大大提高成苗的再生率。在月月红快速繁殖、基因转化、人工体胚及月季品种改良中有广泛的应用前景。
图I是月月红体细胞胚胎发生图。其中A、球形原胚，B、单子叶期原胚，C、心形期原胚，D、三子叶形原胚；E-G为含1.0 mg/LABA的培养基上不同光处理产生的芽和胚E、在暗培养中产生的芽状胚，F、在红光处理下产生的胚，G、在白光条件下产生的胚；H-O为不同浓度的ABA处理产生的体胚H、红光处理下没有ABA的培养基上产生芽和单子叶胚，I、红光处理下含有2. 5mg/L ABA的培养基上主要产生双子叶胚，J_0为随着ABA浓度的增加出现的不正常胚三子叶胚J、四子叶胚K、丛芽胚P、丛指胚Q、根状胚R、喇叭状胚S。图2是月月红不同体细胞胚胎再生正常芽的频率图。其中C0_没有子叶的芽状胚、Cl-单子叶胚、C2-双子叶胚、Cp-多子叶、丛指胚及
丛芽胚等不正常胚，平均值是三个重复实验的结果，在0. 05水平上没有显著差异用同一字母(a, b, c)表不。图3是体细胞胚胎再生的小植株图。其中C2 :双子叶胚再生的植株，Cl :单子叶胚再生的植株，CO :无子叶胚再生的芽，R :开花的再生植株。图中箭头所指为芽上残留的子叶。
具体实施例方式以下将对本发明作进一步地说明。实施例I植物材料选取北京林业大学苗圃中的月月红(R. chinensis Jacq.) —年生半木质化枝条进行表面消毒(先用70%的酒精消毒30秒，再置于O. 3%的次氯酸钠溶液中15分钟，最后用无菌水清洗3次)。置于含6-BA 2. Omg/L、O. lmg/L NAA及3. Omg/L GA3的MS固体培养基 (含这些激素的培养基定名为SP培养基)上培养2个月以产生无菌芽。无菌芽每月继代到新鲜SP培养基上，所有培养基调整pH值为6.0后于121°C、125 kPa灭菌15min。培养条件温度为23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照强度为普通白光1600Lux。结果表明，月月红在SP培养基上生长正常健壮，增殖系数平均为5芽/月。实施例2愈伤组织的诱导用带有Imm叶柄的无菌芽嫩叶置于EP培养基上(EP培养基为基本的SH培养基加
3.Omg/L 2，4-D、lmg/L TDZ及300. O mg/L L-脯氨酸，用4. Og/L琼脂糖固化培养基，调整pH值至5. 4)，置于23-27°C暗培养2个月。结果表明，含3mg/L 2，4_D和lmg/LTDZ的培养基可以产生浅棕色或透明水溃状胚性愈伤，诱导率约为25%。实施例3体细胞胚胎发生大部分胚性愈伤(一般为棕褐色的松散颗粒，或透明水溃状愈伤块)在优化的EM培养基上(优化的EM培养基为基本的SH培养基加I. Omg/L 2，4_D、0. 2 mg/L TDZ、2. 5mg/L ABA,3 mg/L GA3及300. 0 mg/L L-脯氨酸，用4. Og/L琼脂糖固化培养基。调整pH值至
5.4 )培养，培养温度为23 °C 27 °C，光照为暗培养、或红光(400Lux，光16h/暗8h )、或普通白光(1600Lux，光16h/暗8h)。两周后会产生球形的原胚(见图1A)。一部分在后续培养中继续分化出各种类型的胚(见图IB-图1D)。实施例4不同光照条件下的体细胞胚胎发生将EP培养基上诱导的胚性愈伤(一般为棕褐色的松散颗粒，或透明水溃状愈伤块)继代到诱导体细胞胚胎发生的EM培养基上(EM培养基为基本的SH培养基加I. Omg/L 2，4-D、0.2 mg/L TDZU. 0mg/L ABA、3mg/L GA3 及 300. Omg/L L-脯氨酸，用 4. Og/L 琼脂糖固化培养基，调整pH值至5. 4)，分成三组，分别置于暗培养、红光(13W Mini TwisterEnergy Saver Red,Phillips,光强约为 7. 2MMo I τα2 s—1)和白光(TLP 36 ff/840, Phillips,光强约为27.0 μΜοΙ m_2 s—1)培养2个月。培养条件温度为25±2°C，光照周期为每天光16h，暗8h。其它的胚性愈伤组织在EP培养基上继续培养，以便保持其胚胎发生的能力。结果表明，含0. 2mg/L TDZ和300. 0mg/L L-脯氨酸的EM培养基有利于胚性愈伤的生长，特别是含有TDZ的培养基上胚胎发生频率是未加TDZ的培养基的胚胎发生频率的4倍。长时间放在含TDZ的EP培养基上培养可产生非羽状复叶的真叶(见图IN-图10)，TDZ浓度越高，叶片越成半透明玻璃化的叶片(见图10)。暗培养芽的诱导和分生的频率最高，但产生的不正常苗的频率也最高(见图1E);红光条件下胚胎发生的频率最高，产生不正常苗的频率最低(图1F);在有光条件下(包括红光和白光)，产生的胚往往先形成子叶(图IF及图1G)，不同的是，红光条件下愈伤能继续保持浅棕红色、水溃状，并持续保持胚胎发生的能力，而在白光下，愈伤组织容易变成白色、绿色、表面干硬，逐渐丧失胚胎发生的能力。实施例5不同ABA水平对体细胞胚胎发生的影响将培养12周的胚性愈伤组织分成5组，每组约I克，在含不同浓度ABA (O、I. O、
2.5,5. Omg/L)的EM培养基上培养2个月。EM培养基的其它组份同实施例4。
结果表明，在红光条件下，胚胎发生过程中胚胎的子叶数与EM培养基中ABA的含量成正相关，未含ABA的EM培养基中产生的胚有芽状胚和子叶胚两种(图1H)，含ABA
I.Omg/L的EM培养基上产生胚以单片子叶胚为主，含ABA 2. 5mg/L EM培养基上产生胚以两片子叶为主(图II)，这些子叶胚或胚都具有两极性，即同时具有芽的生长端和根的生长端(图IL及图1M)，而在含ABA 5. Omg/L的EM培养基上产生的胚会有三片(图1J)、四片(图1K)甚至多子叶胚，以及其它非正常胚如芽状胚、根状胚、手指状胚和喇叭状胚等(见图IP-图1S)。因此，结合实施例4和实施例5可知，EM培养基最好配方为基本的SH培养基加 I. Omg/L 2, 4-D,O. 2 mg/L TDZ、2. 5mg/L ABA,3 mg/L GA3 R 300. 0 mg/L L-脯氨酸，用4. Og/L琼脂糖固化培养基，pH值调至5. 4。实施例6不同体细胞胚胎的植株再生将EM培养基上产生的不同的类型体细胞胚胎转入SP2培养基(SP2培养基组成MS 固体培养基 +6-BA1. Omg/L+NAAO. 2mg/L+L_ 脯氨酸 300mg/L+ GAS3. Omg/L)培养 2 个月以促进芽产生，培养条件温度为23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照强度为普通白光1600Lux,见图2,再以常规技术培育出植株。结果表明，两片子叶的胚再生成为植株的能力最强(图3C2及图3R)，再生率达50%左右；其次是无子叶的芽，再生率可达30%左右，见图3C0 ;单片子叶胚的再生率约为15%左右，见图3C1 ;其它类型胚的再生率最低，在5%以下。
权利要求
1.一种用于月月红体细胞胚胎发生的胚性愈伤诱导方法，其特征在于该方法是将带有O. 8-1. 2mm叶柄的月月红无菌芽嫩叶置于EP培养基中，在23°C 27°C黑暗培养2_6个月，得到透明水溃状或浅棕色的胚性愈伤组织；EP培养基组成SH培养基+2，4-D3. Omg/L+TDZ1. Omg/L+ L-脯氨酸300. O mg/L,并加入4. Og/L琼脂糖固化培养基，pH值为5. 4。
2.如权利要求I所述的一种用于月月红体细胞胚胎发生的胚性愈伤诱导方法，其特征在于所述无菌芽是取一年生半木质化枝条表面消毒后，置于SP培养基上培养1-3个月得到；SP 培养基组成MS 固体培养基 +6-BA2. Omg/L+NAA O. lmg/L+GA33. Omg/L, pH 值为 6. 0，121°C、125 kPa灭菌15min，培养条件温度为23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照强度为普通白光1600Lux。
3.如权利要求2所述的一种用于月月红体细胞胚胎发生的胚性愈伤诱导方法，其特征在于所述表面消毒是指先用70%体积浓度的酒精消毒30秒，再置于O. 3%体积浓度的次氯酸钠溶液中15分钟，最后用无菌水清洗3次。
4.一种月月红体细胞胚胎发生方法，其特征在于该方法是将按权利要求I或2或3所述方法得到的月月红胚性愈伤组织置于EM培养基上培养1-3个月，得到两片子叶为主的体细胞胚；EM培养基组成SH培养基+2，4-D1. 0mg/L+TDZ0. 2mg/L+L-脯氨酸300mg/L+ABA2. 5mg/L+ GAS3. Omg/L,培养条件温度为23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照强度为红光400Lux。
5.一种月月红体细胞胚胎再生植株方法，其特征在于该方法是将按权利要求4所述方法得到的月月红体细胞胚置于SP2培养基上培养1-3个月以产生芽，再按常规技术培育出植株；SP2培养基组成MS固体培养基+6-BA1. 0mg/L+NAA0. 2mg/L+L-脯氨酸300mg/L+GAS3. 0mg/L,培养条件温度为23°C 27°C，每天16h光照，8h黑暗，光照强度为普通白光1600Luxo
6.如权利要求1-4中任一项所述的方法在月月红转基因和种质改良、创新中的应用。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法在月月红人工种子制作、良种推广中的应用。
全文摘要
一种月月红体细胞胚胎发生及植株再生方法，该方法是以带叶柄的月月红(Rosa chinensis Jacq.)无菌芽嫩叶为材料通过添加有2,4-D、TDZ和L-脯氨酸的SH培养基共同作用，诱导出愈伤组织，然后在红光作用下诱导出体细胞胚，进一步获得再生植株的过程。该方法用不同的培养基，分别在暗培养、红光培养和普通白光的条件下，获得高频发生的体细胞胚胎，正常植株再生率达到50%左右。高频发生的体细胞胚胎发生及植株再生方法在基因转化、基因功能验证、快速繁殖、树龄幼化、人工种子创制、种质改良与创新方面具有极广泛的用途。
文档编号A01H4/00GK102884984SQ201210434709
公开日2013年1月23日 申请日期2012年11月5日 优先权日2012年11月5日
发明者陈己任, 熊兴耀, 邓子牛 申请人:湖南农业大学