专利名称：一种茶树菇菌株及制备方法
技术领域：
本发明属微生物技术领域，具体涉及茶树菇菌株KMFJ-FC及制备方法。
背景技术：
茶树燕茶树燕是担子菌亚门,担子纲、蘑燕菌目、粪伞科、田头菇属，又名柱状田头菇、杨树菇、茶薪菇、柱状环锈伞、柳松茸等。茶树菇是一种高蛋白，低脂肪，无污染，无药害，集营养、保健、理疗于一身的纯天然食用菌。据国家食品质量监督检验中心测定，它富含人体所需的天门冬氨酸、谷氨酸等十七种氨基酸(特别是人体不能合成的八种氨基酸物质)和十多种矿物质微量元素与抗癌多糖，其药用保健疗效高于其他食用菌。它味道鲜美，用作主菜、调味均佳；且有滋阴壮阳、美容保健之功效，对肾虚、尿频、水肿、风湿有独特疗效，对抗癌、降压、防衰、小儿低热、尿床有较理想的辅助治疗功能，民间称之为“神菇”
在茶树菇栽培技术中，优良菌种的获得是关键技术环节。茶树菇菌株的获得通常是利用子实体或孢子进行分离、纯化，直接应用于茶树菇的栽培或菌丝体生产。现有技术的不足在于其生物学特性目前仍处于试验研究阶段，生物转化率较低，而且还要用熟料栽培，生产工艺及技术要素要求较高，因而制约了茶树菇商品经济的发展。另外只能根据菌丝形态及分离物来初步确定是否为茶树菇纯培养物；生产的菌种一般用固体菌种。目前在国内采用液体菌种进行茶树菇资源的保护应用不广泛。
发明内容
本发明的主要目的就是克服现有技术不足，利用云南原产地茶树菇子实体筛选出优良菌株，采用生物技术进行菌种鉴定，制备茶树菇液体及固体优良菌种，为茶树菇资源保护提供优良菌种
本发明采用的真菌是茶树燕aegeri ta KMFJ-FC ;保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所；保藏日期=2012年10月11日；保藏登记入册的编号CGMCC No. 6706
子实体单生，双生或丛生，菌盖直径5-lOcm，表面平滑，初暗红褐色，有浅皱纹，菌肉(除表面和菌柄基茶树菇部之外)白色，有纤维状条纹，中实。成熟期菌柄变硬，菌柄附暗淡粘状物，菌环残留在菌柄上或附于菌盖边缘自动脱落。内表面常长满孢子而呈绣褐色孢子呈椭圆形，淡褐色。菌盖初生，后逐平展，中浅，褐色，边缘较淡。菌肉白色、肥厚。菌褶与菌柄成直生或不明显隔生，初褐色，后浅褐色。菌柄中实，长4 12厘米，淡黄褐色。菌环白色，膜质，上位着生，孢子卵形至椭圆形本发明的技术方案
①采集野生茶树菇子实体；
②组织分离或孢子分离；
③纯化菌株及菌株鉴定；④生物学特性比较及生产性状比较；
⑤确定优良菌株；
⑥菌种生产及菌种应用；
经过反复筛选，获得菌丝体产量高、抗污染的茶树菇液体菌种专用菌株KMFJ-FC
本发明真菌aegeri ta培养方法(以下为重量百分比):
菌种分离纯化培养基2%茶树菇下脚料、O. 001%VB1、2%葡萄糖、2%琼脂；
茶树菇菌株分离及鉴定方法
1、将茶树菇子实体组织块或孢子液接种到上述试管琼脂培养基斜面上，于18-24°C下培养5-10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长 势良好的菌株，获得茶树菇分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于18-24°C下培养5-7天，获得茶树菇纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的茶树燕(Agrocybeaegeri ta) Identities=498/518 (96%), Gaps=7/518 (1%)，分析确定分离得到的纯培养物为茶树菇菌丝体
本发明茶树燕菌种的制备方法分为液体培养和固体培养两种
液体菌种制备方法
液体培养基配方为1(Γ20%麸皮、1(Γ20% 土豆、O. 5 1%蔗糖，余下为水，pH自然
1、将茶树菇的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24°C下培养5-7天，获得试管菌种
2、将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26°C下摇床培养，转速为120-160r/min，培养时间5_7天
3、将摇瓶菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1:0. 8ν/(ν ·π η);搅拌转速为120-160r/min ;接种量为5-10% ;罐压0. 04Mpa ； pH为6. O ;温度为20-26°C ;通气培养72-96小时，获得茶树菇液体菌种
固体菌种制备方法
固体培养基配方为麦粒88%、木屑10%、碳酸钙2%、pH自然
1、将茶树菇的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，于18-24°C下培养5-7天，获得试管菌种
2、将试管种接种到500ml三角瓶(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为前述液体培养基配方，于20-26°C下摇床培养，转速为120-160 r/min，培养时间5_7天
2、采用前述固体培养基配方。将培养料混合后，加水拌均匀后，装入750ml的大口瓶中，压紧封口后在120°C灭菌60分钟，接入液体菌种，于20-26°C培养15-20天，直到菌丝长满
具体实施例方式 实施例一1、将茶树菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于18°C下培养10天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得茶树菇分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取菌丝块接种在培养基斜面上，于18°C下培养7天，获得茶树菇纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的茶树燕(Agrocybeaegeri ta) Identities=509/510 (97%), Gap s=I/510 (0%)，分析确定分离得到的纯培养物为茶树菇菌丝体
4、将aegerita KMFJ-FC的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，18°C下培养7天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为10%麸皮、10% 土豆、O. 5%蔗糖，余下为水，pH自然。于20°C下摇床培养，转速为120rpm，培养时间7天，获得一级液体菌种
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1:0. 8v/(v *min)；搅拌转速为120r/min ;接种量为5% ;罐压0. 04Mpa ； pH为6. O ;温度为22°C ;通气培养96小时，获得茶树菇液体菌种
实施例二
菌种制备的步骤与实施例一相同
1、将茶树菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于22°C下培养6天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得茶树菇分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于22°C下培养6天，获得茶树菇纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的茶树燕(Agrocybeaegeri ta) Identities=509/510 (97%), Gap s=I/510 (0%)，分析确定分离得到的纯培养物为茶树菇菌丝体
4、将aegerita KMFJ-FC的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，22°C下培养6天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为15%麸皮、15% 土豆、O. 6%蔗糖，余下为水，pH自然。于22°C下摇床培养，转速为140rpm，培养时间6天，获得一级液体菌种
将一级液体菌种接种到25L自动发酵生产线的发酵罐中，通气量为1:0. 8v/(v *min)；搅拌转速为140r/min ;接种量为8% ;罐压0. 04Mpa ； pH为6. O ;温度为24°C ;通气培养84小时，获得茶树菇液体菌种
实施例三
1、将茶树菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24°C下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得茶树菇分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平 板培养皿上进行菌种纯化，2天后取尖端菌丝块接种在培养基斜面上，于24°C下培养5天，获得茶树菇纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的茶树燕(Agrocybeaegeri ta) Identities=509/510 (97%), Gap s=I/510 (0%)，分析确定分离得到的纯培养物为茶树菇菌丝体
4、将aegeritaKMFJ-VC的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24°C下培养5天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为20%麸皮、20% 土豆、O. 5%蔗糖，余下为水，pH自然。于26°C下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种 将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为麦粒88%、木屑10%、碳酸钙2%、pH自然。将各原料按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120°C灭菌60分钟后，接种后置于26°C培养15天，获得茶树菇固体菌种
实施例四
1、将茶树菇子实体组织块接种到上述菌种分离纯化培养基斜面上，于24°C下培养5天，对分离培养的试管每天观察记录，及时剔除已污染的试管，挑选出无污染、长势良好的菌株，获得茶树菇分离试管种
2、将分离试管种菌丝块接种到上述琼脂培养基的平板培养皿上进行菌种纯化，2天后取菌丝块接种在培养基斜面上，于24°C下培养5天，获得茶树菇纯化试管种
3、采用供试子实体与对应菌丝分离物，分别按SDS方法提取总DNA，进行PCR扩增及ITS序列测定，通过Blast对比样品的ITS序列与GENBANK中的茶树燕(Agrocybeaegeri ta) Identities=509/510 (97%), Gap s=I/510 (0%)，分析确定分离得到的纯培养物为茶树菇菌丝体
4、将aegeritaKMFJ-VC的菌丝体接种到试管琼脂培养基斜面上，培养基配方为PDA培养基，24°C下培养5天，获得试管种
5、将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装200ml)液体培养基中，培养基配方为18%麸皮、10% 土豆、1%蔗糖，余下为水，pH自然。于26°C下摇床培养，转速为160rpm，培养时间5天，获得一级液体菌种
将一级液体菌种接种到固体培养基上，培养基配方为麦粒88%、木屑10%、碳酸钙2%、pH自然。将各原料按比例称量后混合均匀，加水拌匀后装入750ml的菌种瓶中，每瓶装500ml，120°C灭菌60分钟后，接种后置于20°C培养20天，获得茶树菇固体菌种。
权利要求
1.一种茶树燕菌株，其特征在于所述菌株为(Jgrocybe aegeri ta ) KMFJ-FC,该菌株的保藏号为 CGMCC NO. 6706。
2.根据权利要求1所述的茶树菇菌株的制备方法，所述菌株是经过常规的液体和固体发酵培养获得的，其特征在于所述液体和固体发酵培养基配方如下 液体培养基配方为5-10%麸皮、O. 5-1%黄豆粉、O. 5-1%麦芽糖、1-3%玉米粉，余下为水，pH自然; 固体培养基配方为木屑75-90%、麸皮5-20%、磷肥1%、石膏1%、羊肚菌生长地腐殖土3%，含水量60%、pH自然。
全文摘要
本发明涉及茶树菇菌株的筛选及制备方法，属于微生物技术领域。本发明的菌株AgrocybeaegeritaKMFJ-FC已于2012年10月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.6706。利用该菌株制备的液体及固体优良菌种，应用于茶树菇的促繁有着显著的社会、经济效益和广阔的应用前景。
文档编号A01G1/04GK102986452SQ20121050386
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月2日 优先权日2012年12月2日
发明者郭永红, 张微思, 罗晓莉, 罗孝坤, 尚陆娥 申请人:中华全国供销合作总社昆明食用菌研究所, 云南省供销合作社科学研究所, 昆明菌苑食品有限公司