专利名称：铁皮石斛茎段组培快繁方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种植物栽培方法，具体来说涉及铁皮石斛茎段组培快繁方法。
背景技术：
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo),属兰科附生兰类，其药材俗称铁皮枫斗，又称黑节草，是一种传统名贵中药，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、润喉明目之功效。现代医学研究表明，铁皮石斛的多糖、生物碱、氨基酸等成分具有提高免疫功能、抑制血栓形成、抑制肿瘤和延缓衰老的作用。由于铁皮石斛种子细小，种胚存在后熟现象，果实成熟时，种胚的发育不超过球型期，种子缺乏胚乳，且需要共生菌的存在，因此自然条件下繁殖率极低，加上长年无节制采挖，自然资源日渐枯竭，被列为国家重点保护药用植 物、中国珍稀濒危二级保护植物和世界二类保护植物。铁皮石斛在生产中往往采用分株、扦插等营养繁殖的方法，但繁殖系数低的问题难以解决。自1960年法国人Gmorel利用石斛基尖组织培养无病毒植株的无性繁殖技术创立以来，石斛组织培养技术逐步深化，尤其近年来石斛组织培养育苗逐步趋向产业化。有研究表明由于石斛的特殊性，在石斛的组织培养中，外植体的选择是十分关键的因素，不同的取材部位和时期，培养的结果也不一样。在目前的研究中，铁皮石斛离体组培方法，通常是以成熟或未成熟的种子以及幼嫩的茎尖、腋芽或幼茎茎段为外植体。尽管种子作为外植体具有操作简单、成活率高，数量扩增迅速等优点，但外植体材料获得的困难，却又成为极大的限制因素，且用种子繁殖的后代有可能产生变异；以幼嫩的茎尖、腋芽或幼茎茎段为材料，又会对植株的生长产生极为不良的影响，同时也受到季节的限制。本发明以I年以上生长期的铁皮石斛离根部三节以上的成年态茎段为外植体材料进行组培快繁，同时克服了上述两种外植体材料的缺陷，不仅材料量大，而且在任何季节均可取材，目前未见有相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对铁皮石斛离体组培外植体材料获得困难，提供了一种铁皮石斛茎段组培快繁方法，该方法以I年以上生长期的铁皮石斛的成年态茎段为外植体材料进行组培快繁，具有材料量大、不受季节限制优点，同时可增加扩繁速度和生产量，降低了组培生产成本，对濒危紧缺药用植物资源再生和持续利用具有重要意义。本发明采用的技术方案是一种铁皮石斛茎段组培快繁方法，包括以下步骤I.茎段外植体的准备取成年态铁皮石斛茎段，除去叶片，用流水冲洗干净；所述成年态铁皮石斛茎段为I年以上生长期的铁皮石斛离根部三节以上的茎段；2.茎段外植体的消毒将清洗干净的茎段外植体取出，置烧杯中，用O. 1%的升汞溶液浸泡5分钟，用无菌水冲洗4 5次，置超净工作台上，切成长度为I 2cm、带2 3个节的小茎段，再用O. 1%的升汞溶液浸泡3分钟，用无菌水冲洗4 5次，备用；3.诱导培养将消毒好的小茎段接种于无菌诱导培养基中，培养基的配方为MS+6-BA0. 8 I. 2mg/L+NAA0. 8 I. 2mg/L,培养条件温度24 26。。、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养40天后，茎段在节间处长出新芽；4.第一次增殖培养将新芽转接到第一次增殖培养基中，第一次培养基的配方为MS+6-BA4. 8 5. 2mg/L+NAA0. 8 L 2mg/L，温度 24 26°C、日光灯照射 24 小时 / 天、光照强度800 12001x，培养30天后，在切口处长出约O. 5cm高的第一代丛生芽，新芽的增殖倍数为20倍以上；5.第二次增殖培养将第一代丛生芽切割后转接到第二次增殖培养基中，第二次培养基的配方为MS+6-BA3. 8 4. 2mg/L+NAA0. 8 I. 2mg/L，温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养30 40天，在切口处长出约O. 5cm高的第二代丛生芽，新芽的增殖倍数达10倍以上；6.第三次增殖培养将第二代丛生芽切割后转接到第三次增殖培养基中，第三次培养基的配方为MS+6-BAl. 5 2. 5mg/L+NAA0. 8 I. 2mg/L，温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养30 40天，在切口处长出Icm高的第三代丛生芽，新芽的增殖倍数达5倍以上，并开始有不定根的生长；7.壮苗培养将第三代丛生芽切割后转接于壮苗培养基中，培养基的配方为MS+NAA1. O I. 5mg/L,培养条件温度24 26 °C、日光灯照射16小时/天、光照强度2000 24001x，培养30 45天，形成2 3cm高的不定芽；8.生根培养将不定芽接种于生根培养基中，培养基的配方为MS+NAA0. 8 I. 2mg/L，培养条件温度24 26°C、日光灯照射16小时/天、光照强度2000 24001x，培养60 75天，每株苗形成2 3条根,根长2 4cm,直径约Imm ；9.光培炼苗将已生根的苗连同培养瓶转入大棚，在温度为25 30°C下，放置7天，去掉瓶塞，炼苗5 7天，即可将种苗取出移栽。以上所述的MS培养基为是目前使用最普遍的培养基，具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养，还能加速愈伤组织的生长。BA即6_苄基腺嘌呤，是一种细胞分裂素。NAA即α-萘乙酸，是一种植物生长素。以幼嫩的茎尖、腋芽或幼茎茎段为外植体材料，因植物细胞活跃，加入浓度较低的植物生长调节剂即可快速诱导分化，但成年态的铁皮石斛茎段，细胞分裂速度减慢，该茎段作为外植体进行组培，较幼嫩的茎尖、腋芽或幼茎茎段的腋芽萌发率低，植物生长调节剂的加入不好控制。试验中发现，增殖培养基的配方为MS+6-BA4. 8 5. 2mg/L+NAA0. 8 I. 2mg/L时，愈伤组织过多，繁殖速度快，但壮苗时长达6个月以上，并产出过弱过细不能用的苗；增殖培养基的配方为MS+6-BAl. 5 2. 5mg/L+NAA0. 8 I. 2mg/L时，结果增殖太慢，每周期2 3苗，达不到快繁目的；而以增殖培养基MS+6-BA3. 8-4. 2mg/L+NAA0. 8
I.2mg/L为缓冲，并结合前两个增殖培养基配方，则可以使新芽的增殖倍数达10000倍，形成约Icm高的健壮丛生芽，减短培育周期，并能快速培育出合格的铁皮石斛培苗，为壮苗准备。本发明的有益效果是I.本发明以I年以上生长期的铁皮石斛离根部三节以上的茎段为外植体材料进行组培快繁，具有取材容易、材料量大、不受季节限制的优点。2.本发明采用以芽生芽的茎段培养方式，诱导时间段，发生过程简单，不存在分化的组织或基本植物结构的丧失，能较好的保持母本的生物学性状，从而保证铁皮石斛的药用价值。3.培养技术简单易行，采用的消毒方法污染率低，繁殖速度快(增殖倍数可达10000倍)，周期短(7 8个月)，可增加扩繁速度和生产量，降低了组培生产成本，对濒危紧缺药用植物资源再生和持续利用具有重要意义。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步描述，以说明其有益效果，但本发明绝非限于这些例子。实施例I 铁皮石斛茎段组培快繁方法，包括以下步骤I.茎段外植体的准备取I年生长期的铁皮石斛离根部三节以上的茎段，除去叶片，用流水冲洗干净；2.茎段外植体的消毒将清洗干净的茎段外植体取出，置烧杯中，用O. 1%的升汞溶液浸泡5分钟，用无菌水冲洗5次，置超净工作台上，切成长度为I 2cm、带2 3个节的小茎段，再用O. 1%的升汞溶液浸泡3分钟，用无菌水冲洗5次，备用；3.诱导培养将消毒好的小茎段接种于无菌诱导培养基中，培养基的配方为MS+6-BA0. 8mg/L+NAA0. 8mg/L,培养条件温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养40天，茎段在节间处长出约O. 5cm高的新芽；4.第一次增殖培养将新芽转接到第一次增殖培养基中，第一次培养基的配方为MS+6-BA4. 8mg/L+NAA0. 8mg/L,温度24 26 °C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养30天，在切口处长出约O. 5cm高的第一代丛生芽，新芽的增殖倍数达20倍;5.第二次增殖培养将第一代丛生芽切割后转接到第二次增殖培养基中，第二次培养基的配方为MS+6-BA3. 8mg/L+NAA0. 8mg/L，温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养30天，在切口处长出约O. 5cm高的第二代丛生芽，新芽的增殖倍数达10倍；6.第三次增殖培养将第二代丛生芽切割后转接到第三次增殖培养基中，第三次培养基的配方为MS+6-BAl. 5mg/L+NAA0. 8mg/L，温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养40天，在切口处长出Icm高的第三代丛生芽，新芽的增殖倍数达5倍，并开始有不定根的生长；7.壮苗培养将第三代丛生芽切割后转接于壮苗培养基中，培养基为MS+NAAlmg/L培养基，培养条件温度24 26°C、日光灯照射16小时/天、光照强度2000 24001x,培养30天，形成2 3cm高的不定芽；8.生根培养将不定芽接种于生根培养基中，培养基的配方为MS+NAA0. 8mg/L,培养条件温度24 26°C、日光灯照射16小时/天、光照强度2000 24001x，培养60天，每株苗形成2 3条根,根长2 4cm,直径约Imm ；
9.光培炼苗将已生根的苗连同培养瓶转入大棚，在温度为25 30°C下，放置7天，去掉瓶塞，炼苗7天，即可将种苗取出移栽。实施例2铁皮石斛茎段组培快繁方法，包括以下步骤I.茎段外植体的准备取2年生长期的铁皮石斛离根部三节以上的茎段，除去叶片，用流水冲洗干净；2.茎段外植体的消毒将清洗干净的茎段外植体取出，置烧杯中，用O. 1%的升汞溶液浸泡5分钟，用无菌水冲洗4次，置超净工作台上，切成长度为I 2cm、带2 3个节的小茎段，再用O. 1%的升汞溶液浸泡3分钟，用无菌水冲洗4次，备用；3.诱导培养将消毒好的小茎段接种于无菌诱导培养基中，培养基的配方为MS+6-BA1. Omg/L+NAAl. Omg/L,培养条件温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强 度800 12001x，培养40天，茎段在节间处长出约O. 5cm高的新芽；4.第一次增殖培养将新芽转接到第一次增殖培养基中，第一次培养基的配方为MS+6-BA5. Omg/L+NAAl. Omg/L,温度24 26 °C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养30天，在切口处长出约O. 5cm高的第一代丛生芽，新芽的增殖倍数达100 倍；5.第二次增殖培养将第一代丛生芽切割后转接到第二次增殖培养基中，第二次培养基的配方为MS+6-BA4. Omg/L+NAAl. 0mg/L，温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养35天，在切口处长出约0. 5cm高的第二代丛生芽，新芽的增殖倍数达10倍；6.第三次增殖培养将第二代丛生芽切割后转接到第三次增殖培养基中，第三次培养基的配方为MS+6-BAl. 8mg/L+NAAl. 0mg/L，温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养30天，在切口处长出Icm高的第三代丛生芽，新芽的增殖倍数达10倍，并开始有不定根的生长；7.壮苗培养将第三代丛生芽切割后转接于壮苗培养基中，培养基为MS+NAA1. 2mg/L培养基，培养条件温度24 26°C、日光灯照射16小时/天、光照强度2000 24001x，培养45天，形成2 3cm高的不定芽；8.生根培养将不定芽接种于生根培养基中，培养基的配方为MS+NAA1. 0mg/L,培养条件温度24 26°C、日光灯照射16小时/天、光照强度2000 24001x，培养75天，每株苗形成2 3条根,根长2 4cm,直径约Imm ；9.光培炼苗将已生根的苗连同培养瓶转入大棚，在温度为25 30°C下，放置7天，去掉瓶塞，炼苗5天，即可将种苗取出移栽。实施例3铁皮石斛茎段组培快繁方法，包括以下步骤I.茎段外植体的准备取3年生长期的铁皮石斛离根部三节以上的茎段，除去叶片，用流水冲洗干净；2.茎段外植体的消毒将清洗干净的茎段外植体取出，置烧杯中，用0. 1%的升汞溶液浸泡5分钟，用无菌水冲洗4次，置超净工作台上，切成长度为I 2cm、带2 3个节的小茎段，再用0. 1%的升汞溶液浸泡3分钟，用无菌水冲洗5次，备用；
3.诱导培养将消毒好的小茎段接种于无菌诱导培养基中，培养基的配方为MS+6-BA1. 2mg/L+NAAl. 2mg/L，培养条件温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养40天，茎段在节间处长出约O. 5cm高的新芽；4.第一次增殖培养将新芽转接到第一次增殖培养基中，第一次培养基的配方为MS+6-BA5. 2mg/L+NAAl. 2mg/L,温度24 26 °C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养30天，在切口处长出约O. 5cm高的第一代丛生芽，新芽的增殖倍数达50倍;5.第二次增殖培养将第一代丛生芽切割后转接到第二次增殖培养基中，第二次培养基的配方为MS+6-BA4. 2mg/L+NAAl. 2mg/L，温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养40天，在切口处长出约O. 5cm高的第二代丛生芽，新芽的增殖倍数达15倍；6.第三次增殖培养将第二代丛生芽切割后转接到第三次增殖培养基中，第三次培养基的配方为MS+6-BAl. 5mg/L+NAA0. 8mg/L，温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养35天，在切口处长出Icm高的第三代丛生芽，新芽的增殖倍数达8倍，并开始有不定根的生长；7.壮苗培养将第三代丛生芽切割后转接于壮苗培养基中，培养基为MS+NAA1. 5mg/L培养基，培养条件温度24 26°C、日光灯照射16小时/天、光照强度2000 24001x，培养40天，形成2 3cm高的不定芽；8.生根培养将不定芽接种于生根培养基中，培养基的配方为MS+NAA0. 8mg/L,培养条件温度24 26°C、日光灯照射16小时/天、光照强度2000 24001x，培养60天，每株苗形成2 3条根,根长2 4cm,直径约Imm ；9.光培炼苗将已生根的苗连同培养瓶转入大棚，在温度为25 30°C下，放置7 天，去掉瓶塞，炼苗6天，即可将种苗取出移栽。
权利要求
1.一种铁皮石斛茎段组培快繁方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)茎段外植体的准备取成年态铁皮石斛茎段，除去叶片，用流水冲洗干净； 所述成年态铁皮石斛茎段为I年以上生长期的铁皮石斛离根部三节以上的茎段； (2)茎段外植体的消毒将清洗干净的茎段外植体取出，置烧杯中，用O.1%的升汞溶液浸泡5分钟，用无菌水冲洗4 5次，置超净工作台上，切成长度为I 2cm、带2 3个节的小茎段，再用O. 1%的升汞溶液浸泡3分钟，用无菌水冲洗4 5次，备用； (3)诱导培养将消毒好的小茎段接种于无菌诱导培养基中，培养基的配方为MS+6-BA0. 8 I. 2mg/L+ NAAO. 8 I. 2mg/L,培养条件温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养40天后，茎段在节间处长出新芽； (4)第一次增殖培养将新芽转接到第一次增殖培养基中，第一次培养基的配方为MS+ 6-BA4. 8 5. 2mg/L+ ΝΑΑ0. 8 I. 2mg/L,温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养30天后，在切口处长出第一代丛生芽； (5)第二次增殖培养将第一代丛生芽切割后转接到第二次增殖培养基中，第二次培养基的配方为MS + 6-BA3. 8 4. 2mg/L+ ΝΑΑ0. 8 I. 2mg/L，温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养30 40天，在切口处长出第二代丛生芽； (6)第三次增殖培养将第二代丛生芽切割后转接到第三次增殖培养基中，第三次培养基的配方为MS + 6-BA1. 5 2. 5mg/L+ ΝΑΑ0. 8 I. 2mg/L，温度24 26°C、日光灯照射24小时/天、光照强度800 12001x，培养30 40天，在切口处长出Icm高的第三代丛生芽，并开始有不定根生长； (7)壮苗培养将第三代丛生芽切割后转接于壮苗培养基中，培养基的配方为MS+NAA1. O I. 5mg/L,培养条件温度24 26°C、日光灯照射16小时/天、光照强度2000 24001x,培养30 45天，形成2 3cm高的不定芽； (8)生根培养将不定芽接种于生根培养基中，培养基的配方为MS+ ΝΑΑ0. 8 I. 2mg/L，培养条件温度24 26°C、日光灯照射16小时/天、光照强度2000 24001x，培养60 75天，每株苗形成2 3条根,根长2 4cm,直径约Imm ； (9)光培炼苗将已生根的苗连同培养瓶转入大棚，在温度为25 30°C下，放置7天，去掉瓶塞，炼苗5 7天，即可将种苗取出移栽。
全文摘要
本发明公开了一种铁皮石斛茎段组培快繁方法，属于生物技术领域。该方法以为1年以上生长期的铁皮石斛离根部三节以上的茎段为外植体材料进行组培快繁，包括以下步骤茎段外植体的准备、消毒、诱导培养、继代培养、壮苗培养、生根培养、光培炼苗。本发明具有取材容易、材料量大、不受季节限制优点，能较好的保持母本的生物学性状，培养技术简单易行，污染率低，繁殖速度快，对濒危紧缺药用植物资源再生和持续利用具有重要意义。
文档编号A01H4/00GK102972299SQ20121052753
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者黄威祥, 黄怀毅, 农定霖 申请人:黄怀毅