专利名称：一个簇毛麦金属转运蛋白基因及其所编码的蛋白质和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦金属转运蛋白基因及其所编码的蛋白质和应用。
背景技术：
由专性寄生真菌小麦白粉病菌(Blumeria graminis DC f. sp. tritici)引起的小麦白粉病是中国和世界上许多国家小麦生产中危害日趋严重的病害之一。从一叶期到衰老，植株都能被白粉菌侵染。早期的侵染可使分蘖减少，上部叶片和穗部晚期的侵染能严重减少籽粒产(20 % -33 % )。白粉病虽然能用杀菌剂防治，但必然增加人力、物力投入，而且还会引起环境污染等生态问题，因此培育和推广抗病品种已被公认为是防治小麦白粉病最为经济、安全和有 效的途径，而抗病遗传背景和抗病机理的研究则是制定抗病育种策略的重要依据。明确其抗病机制，克隆抗病相关基因，对于防治小麦病害、开展抗病育种改良具有重要理论指导意义。小麦抗病分子机制是目前小麦白粉病研究的热点课题。白粉病病原菌与寄主小麦之间的互作关系十分复杂。分析病原菌-寄主互作过程中的基因表达情况，有助于发掘抗病基因和发现抗病通路，并进一步阐明抗病的分子机制。通过构建受白粉病菌诱导表达的cDNA文库、SSH文库，利用双向电泳结合质谱技术、芯片技术等，筛选出了可能与白粉病抗性相关的基因或蛋白，包括各种病程相关蛋白、丝氨酸-苏氨酸激酶、ABC转运蛋白等，也发现了水杨酸途径、双氧水途径等信号通路与白粉病抗性关。二倍体簇毛麦是高抗白粉病的小麦远缘物种，其抗病基因Pm21位于6V上，本实验室前期研究表明Hv-CMPG与簇毛麦的白粉病相关，该基因是一个E3连接酶，参与泛素化过程降解结合目标底物蛋白。研究像Hv-CMPG这类E3连接酶的底物结合蛋白及信号传导途径是近年来的研究热点。研究利用酵母双杂交技术，将Hv-CMPG作为诱饵，利用聚乙二醇-醋酸锂转化法，筛选受白粉菌诱导的簇毛麦酵母双杂交cDNA文库，得到Hv-CMPG的一个互作基因HV-FP3，该基因是一个金属转运蛋白，在簇毛麦叶片中受白粉菌诱导上调表达；利用基因枪技术将其转化感白粉病小麦品种扬麦158中，以期提高白粉病抗性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种金属转运蛋白基因HV-FP3。本发明的另一目的是提供该基因的表达载体。本发明的又一目的是提供该基因和表达载体的应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现金属转运蛋白基因HV-FP3,来自二倍体簇毛麦(Haynaldia villosa, VV,2n=14),可以和白粉病抗性相关基因Hv-CMPG互作，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。该受体蛋白激酶基因编码的蛋白质HV-FP3，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
含有所述的金属转运蛋白基因Hv-FP3的表达载体。所述的含有金属转运蛋白基因Hv-FP3的表达载体优选以PBI220为出发载体，将所述的HvFP3基因插入pBI220的BamHI和KpnI酶切位点间所得。所述的金属转运蛋白基因Hv-FP3在构建抗白粉病小麦品种中的应用。所述的含金属转运蛋白基因Hv-FP3的表达载体在构建抗白粉病小麦品种中的应用。有益效果本发明首次从簇毛麦中克隆得到了一个和白粉病抗性相关基因Hv-CMPG互作的金属转运蛋白基因HV-FP3及其所编码的蛋白质HV-FP3，为簇毛麦中首次报道。将其插入表达载体pBI220，得到的该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小 麦品种对白粉病的抗性。HV-FP3用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，能够提高小麦的白粉病抗性。
图1利用酵母双杂交克隆Hv-CMPG的互作基因Hv_FP3，上行为SD_LT培养基，下行为 SD-HLT 培养基；从左至右分别为 pGADT7+pGBKT7、pGBKT7 :CMPG+pGADT7、pGADT7 FP3+pGBKT7、pGBKT7 CMPG+pGADT7 :FP3。图2Hv-FP3在二倍体簇毛麦白粉菌诱导后的叶片中的实时荧光定量RT-PCR分析X轴0h、45min、lh、2h、4h、6h、12h、24h、48h、72h分别表示簇毛麦叶片受白粉菌诱导的不同时间段^轴Hv-FP3基因在不同样品中受白粉菌诱导前后的表达倍数。图3HV-FP3转基因载体构建图谱图4HV-FP3基因转化扬麦158的Ttl代阳性转基因植株PCR分子鉴定结果泳道I为Marker，泳道2为水空白对照，泳道3为未转化扬麦158对照，泳道9为包含目的基因的质粒，泳道4-8依次为阳性转化植株Tq-10-2、Tq-17-3、Tq-27-3、Tq-32-1、T0_39_3 ο图5HV-FP3基因转化扬麦158的Ttl代阳性植株Q-RT-PCR分析结果X 轴Υ158, T0-l-4, Τ0-10-2, Τ0-17-3, Τ0-27-3, T0-32-l, T0-39-3 为阳性转化植株，T0-l-4为阴性转化植株，扬麦158为转基因受体小麦；￥轴Hv-FP3基因在转基因植株中相对于扬麦158的表达倍数。
具体实施例方式实施例1利用酵母双杂交克隆金属转运蛋白基因HvFP3二倍体簇毛麦(参考文献齐莉莉，陈佩度，等，小麦白粉病新抗源一基因Pm21，作物学报，1995，21 (3) :257-262)是高抗白粉病的材料。Hv-CMPG是南京农业大学细胞遗传研究所克隆的一个位于二倍体簇毛麦6V上的白粉病抗性相关基因(刘圆.簇毛麦Hv-CMPG基因克隆及其功能初步分析[D].南京.南京农业大学，2007)，以Hv-CMPG为诱饵，用聚乙二醇-醋酸锂转化法筛选酵母双杂交cDNA文库，得到一个Hv-CMPG的互作基因(附图1)。对该互作基因测序，获得了大小为702bp的序列，序列如SEQ ID NO.1所示。通过NCBI网站中的ORFfinder搜索该获得序列的开放阅读框，发现其包含一个全长ORF的基因，其中5’-UTR (非翻译区)72bp、3’-UTR174bp、0RF (开放阅读框)456bp，编码151个氨基酸，序列如SEQ IDNO. 2所示，将该基因命名为Hv-FP3。实施例2HV-FP3基因受白粉菌诱导的表达特征把抗白粉病的簇毛麦种子(参考文献齐莉莉，陈佩度，等，小麦白粉病新抗源-基因卩11121，物学报，1995，21 (3) :257-262)播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵(周围用圆柱状透明塑料片隔离，顶端用滤纸封闭，形成无白粉菌的环境)。待三叶期，把在感病品种苏麦三号上培养的南京本地混合白粉菌新鲜孢子轻轻抖落在簇毛麦的幼苗上。接种白粉菌后的簇毛麦叶片保存在161。接种后011、451^11、111、211、411、611、1211、2411、4811、7211取样，置于一70°C冰箱内保存备用。用TRIZOL (InvitiOgen)提取受白粉菌诱导的簇毛麦叶片的RNAjlJ用AMV酶(Takara)合成反转录第一链,得到反转录产物。应用能特异扩增Hv-FP3 的特异引物 P1(TGGATCACCTCTCTGATTTGTG(SEQ IDNO. 3))和P2(TGCTCGATCAGCGAATCTTA(SEQ IDNO. 4))，对该基因在受白粉菌诱导样品中进行实时荧 光定量PCR (Q-RT-PCR)分析。PCR反应在实时荧光定量PCR仪(MylQ，Bio-Rad, USA)上扩增并检测荧光。20 μ I PCR 反应体系中含 2 X SYBR Green PCR Master MixlO μ 1,0. 4nmol/μ I引物Pl和P2，上述获得的反转录产物2 μ I。扩增参数为95°C lOmin，然后95°C 15s、56°C 30s，72°C lmin，共40个循环。反应结束后，进行溶解曲线的测定。检测基因表达水平定量用MyiQ系统软件进行分析。结果表明，在簇毛麦叶片中HV-FP3受白粉菌诱导上调表达，2h后表达水平达到峰值，之后开始下调。Q-RT-PCR的结果表明，Hv-FP3可能与白粉病抗性相关(附图2)。实施例3HV-FP3正义表达载体构建及其转化普通小麦扬麦158利用上述经白粉菌诱导后的簇毛麦cDNA为模板，以可扩增HV-FP3基因蛋白编码区的引物对 P3 (CGGGATCCATGGGCGCCTTGGATCACCT (SEQ ID NO. 5))和 P4(GGGGTACCTCACATGACGGTGCAGGCGTC SEQ ID NO. 6))进行 PCR 扩增，回收扩增片段。用 BamHI和KpnI双酶切将扩增目标片断插入到载体pBI220 (Jefferson RA, Kavanagh TA, BevanMW. GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusionmarker inhigherplants. EMBO J. 1987, 6:3901-3907.)的 35s 启动子后面的多克隆位点BamHI和KpnI之间。由此将目标基因Hv_FP3克隆到强启动子35s的下游，获得表达载体pBI220:FP3 (附图 3)。将构建好的过量表达载体通过基因枪法转化扬麦158，挑选2800个幼胚愈伤进行基因枪轰击，轰击前在高渗培养基(MS+ABA0. 5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2, 4_D2mg/L+葡萄糖30g/L+0. 4mol/L甘露醇，pH5. 8)上预处理4小时，轰击后在高渗培养基上继续培养16小时。之后将愈伤组织转移至恢复培养基(1/2MS (只有大量元素减半的MS) +水解酪蛋白500mg/L+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L，pH5. 8)上暗培养2周，再将其转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ABA0. 5mg/L+ 水解酪蛋白 500mg/L+2，4-Dlmg/L+ 蔗糖 30g/L+4mg/L Bialaphos, pH5. 8)，筛选培养2周。然后将具有抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+L-谷氨酞胺 I mmol/L+水解酪蛋白 200mg/L+KTlmg/L+IAA0. 5mg/L+鹿糖 30g/L+琼脂0. 8%, pH5. 8)进行分化，待分化芽长至2-4cm时将其转移至生根培养基(l/2MS+KTlmg/L+蔗糖30g/L+琼脂0. 8%, pH5. 8)中。至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1_2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株共190株。
提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用载体上启动子引物P5(TGCGATAAAGGAAAGGCTATC (SEQ ID NO. 7))和基因内部引物 P6 (AGTCCATCTTCACCTTGATGTTC(SEQ ID NO. 8))进行PCR扩增，以鉴定阳性植株。PCR程序10_50ng/μ I基因组DNA模板，ΙΟμΜ 的 5’引物和 3’引物各 O. 5μ I ；2. 5μ IlOXbuffer ；2. 5μ 12. 5mM 的 dNTP ；1. 5μ 125mM^Mg2+ ；0. 25μ I (5U/ μ l)Taq polymerase (TaKaRa)，加水至 25 μ I。PCR 反应条件为94°C预变性 3min ；94°C 45s, 58°C 45s, 72°C lmin，35 个循环；72°C延伸 IOmin0 PCR产物经 8% 的聚丙烯凝胶电泳检测。其中5株可以扩增约510bp的目的条带，初步鉴定为阳性植株，株系编号依次为1^-10-2,1^-17-3,1^-27-3,1^-32-1,1^-39-3 (附图 4)。选取成株期的阳性转基因植株，利 用随机挑选的阴性转基因植株Tfl-4以及转基因受体扬麦158作为阴性对照植株，提取叶片总RNA，利用Hv-FP3基因的特异引物Pl和P2，进行Q-RT-PCR分析。结果表明与对照扬麦158相比，T0-1-4植株中的Hv_FP3基因的表达量没有显著变化；Tq-10-2、Tq-32-1植株中的Hv-FP3基因的表达量上调了约2. 3-2. 9倍；T0-39-3植株中的Hv-FP3基因的表达量上调约5. 8倍；TQ-17-3植株中的Hv_FP3基因的表达量上调约8. 7倍，植株1-27-3中Hv-FP3基因的表达量上调了约14倍。(附图5)。实施例4转基因植株的白粉病抗性鉴定用江苏南京地区田间采集的白粉病菌混合菌种同时接种Ttl代转基因植株、转基因受体品种扬麦158，进行苗期离体和成株期白粉病抗性鉴定。抗性鉴定标准采用“0-9级”白粉病抗性反应型的分级标准，0-2级为高抗、3-4级为中抗、5级以上为感病。苗期离体抗性鉴定的两次重复结果表明扬麦158和阴性转基因植株Tc1-H表现为中感或高感；阳性转基因植株均表现为高抗。苗期离体和成株期白粉病抗性鉴定结果基本一致(表I)。表I转基因植株的白粉病抗性鉴定
权利要求
1.一个簇毛麦金属转运蛋白基因HV-FP3，其特征在于其CDNA序列如SEQ ID NO.1所/Jn ο
2.权利要求1所述金属转运蛋白基因HV-FP3编码的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列如 SEQID NO. 2 所示。
3.含有权利要求1所述的金属转运蛋白基因HV-FP3的表达载体。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于所述的金属转运蛋白基因HV-FP3的表达载体是以PBI220为出发载体，将权利要求1所述的Hv-FP3基因插入pBI220的BamHI 和KpnI酶切位点间所得。
5.权利要求1所述的金属转运蛋白基因Hv-FP3在培育抗白粉病和/或抗赤霉病小麦品种中的应用。
6.权利要求3或4所述的含金属转运蛋白基因Hv-FP3的表达载体在培育抗白粉病和 /或抗赤霉病小麦品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一个簇毛麦金属转运蛋白基因及其所编码的蛋白质和应用，属于基因工程领域。Hv-FP3的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自二倍体簇毛麦(Haynaldia villosa，VV，2n=14)，在抗白粉病二倍体簇毛麦中受白粉菌诱导表达增强。将Hv-FP3基因转化感白粉病小麦品种扬麦158，对转基因T0代植株进行白粉病抗性鉴定，结果表明Hv-FP3基因的过量表达可以提高扬麦158对白粉病的抗性。Hv-FP3可望用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，有望提高小麦的白粉病抗性。
文档编号A01H5/00GK103014023SQ201210574738
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者李颖波, 王秀娥, 曹爱忠, 王海燕, 邢莉萍, 肖进, 费菲, 祝燕飞 申请人:南京农业大学