一种用于从十字花科作物制造产品的方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于从来自白花菜目的植物的种子制造一种产品的方法，该方法包括以下步骤：提供具有按重量计约9%或更少的含水量的种子；-破坏这些种子；-将这些破坏的种子与酸水溶液混合以便提供在约1.0至约5.0范围内的混合物pH；-将黑芥子酶从芥子油苷分离以便提供一个含有黑芥子酶的部分和一个不含黑芥子酶的部分；并且从该含有黑芥子酶的部分或从该不含黑芥子酶的部分分离出产物；其中这些破坏的种子和该水性混合物的温度被维持在从约0℃至约65℃的值。该产品可以是一种蛋白质产品或一种非蛋白质产品。本发明的方法提供了在动物饲料、非食物产品中使用或用于人类消费的植物产品。
【专利说明】一种用于从十字花科作物制造产品的方法
发明领域
[0001]本发明涉及用于从一种植物材料制造一种产品，确切地说从来自白花菜目、尤其是十字花科的植物的种子制造一种产品的方法。该产品可以是一种蛋白质产品或一种非蛋白质产品。本发明的方法提供在动物饲料、非食物产品中使用或用于人类消费的植物产品。非食物产品包括粘合剂、涂料，等等。具体地说，蛋白质产品具有降低的含量的不希望的芥子油苷、酚类物质以及来自芥子油苷的非酶和酶催化的降解的组分、以及酚类物质和芥子油苷的氧化产物，因为这些组分对营养价值和颜色具有负面作用。
发明背景
[0002]用于生产植物产品(例如蛋白质分离物或浓缩物等)的方法在现有技术中是熟知的。此类植物产品通常用于动物饲料，但是它们还可以用于人类消费或其他目的。除了有营养价值的组分外，许多所考虑的植物还包含供给不想要的颜色和负营养价值的组分。此外，一些植物可能具有能够被激活的防御系统，例如通过破坏细胞结构并且将这些植物组分进行混合，以便将前体组分降解成活性更大的组分。
[0003]白花菜目并且尤其是十字花科的植物是重要的粮食作物，其中许多代表性作物在世界各地进行栽培。这些科成员提供植物油的来源并且它们的种子还典型地具有高蛋白质含量。油菜和芥菜的种子可以例如产生40%的油和30%的蛋白质。然而，由于存在于这些种子中的芥子油苷-黑芥子酶系统，从十字花科的植物的种子产生天然蛋白质分离物和浓缩物是复杂的。黑芥子酶是能够催化芥子油苷水解并转化成具有辛辣、苦味或令人不快的味道的各种化合物(这些化合物中的一些在植物中所发现的浓度水平下还是有毒的)的一种酶或多种同工酶的酶混合物。例如，黑芥子酶将葡萄糖基团从芥子油苷裂解掉，并且剩余的分子然后快速转化成一种硫氰酸酯、一种腈或多种异硫氰酸酯或其产物；这些物质经常是在足够高的浓度下用作植物的防御并且充当人类和单胃动物的抗营养因子的在量上占主导的活性物质。黑芥子酶是根据EC3.2.1.147进行分类。黑芥子酶活性对芥子油苷的具体降解产物可以取决于以下因素，如pH或存在的其他蛋白质或酶。黑芥子酶通常储存在黑芥子硫苷酸细胞中的黑芥子硫苷酸颗粒内，但是还可以是在蛋白质体/液泡中，并且作为同与这些芥子油苷分离的胞质酶相关的膜。按这种形式，这些酶被维持与它们的芥子油苷底物隔离，并且此外它们可以被保持处于高度稳定的形式，该形式受保护免于降解。具体地说，十字花科种子可以具有低含水量，从而保持黑芥子酶处于无活性的形式。当这些种子的结构分解(例如通过破坏植物材料)、尤其是在存在水的情况下，黑芥子酶与可获得的芥子油苷底物相接触并且发生水解。黑芥子酶通常是能够快速转化芥子油苷的非常有效的酶，该转化在大多数处理中是不希望的，除了芥菜生产。
[0004]通常通过加热至高温、例如至70°C或更高来将黑芥子酶灭活。然而，除芥子油苷的酶分解外，还可以非酶地降解芥子油苷。具体地说，芥子油苷在存在二价铁(即Fe2+)的情况下降解；二价铁可以以足够的量存在以便在工业规模的方法中使用钢制槽和设备来催化芥子油苷的分解。由于芥子油苷降解产物的非常强的作用，例如，苦味、脱色作用、负营养价值等等，仅需要小量的二价铁就引起对来自十字花科植物材料的最终产物的可检测的作用。二价铁介导的降解在高温下不会被阻碍。
[0005]来自十字花科种子的蛋白质产品的产生在现有技术中已经得以解决，但是仍然需要用于从十字花科种子产生产品(例如蛋白质产品)的改进的方法。
[0006]W02010/020038涉及一种卡诺拉(canola)蛋白质分离物的产生。因此，它描述一种制备蛋白质分离物的方法，该方法包括:将一种钙盐(例如氯化钙)添加至来自卡诺拉蛋白质胶束团(micellar msss)的沉淀的上清液，以便形成一种植酸I丐沉淀物,从所得到的溶液去除沉淀的植酸钙，任选地将pH调整至2.0至4.0，并且浓缩该溶液。W02010/020038既未提及又未解决从芥子油苷的黑芥子酶产生的降解出现的任何问题。
[0007]W02010/020042也涉及可溶性卡诺拉蛋白质分离物的产生并且披露了 一种与W02010/020038的方法类似的方法，并且它同样未解决黑芥子酶-芥子油苷的问题。
[0008]US2009/0286961披露了用于从油籽柏生产蛋白质分离物的多种方法。用于US2009/0286961的相关油籽包括卡诺拉、油菜籽、芥菜、绿菜花、亚麻、棉花、大麻、红花、芝麻或大豆的种子。US2009/0286961的方法可以包括从脱脂或富含蛋白质的油籽柏去除纤维，该步骤涉及在将pH调整至适合于酶活性的值(如3至7)之后添加纤维素酶，接着加热至同样适合于酶活性的温度以便水解纤维。US2009/0286961的方法提供一种油籽的热处理，这导致存在于油籽中的酶(例如，黑芥子酶、脂肪酶、磷脂酶)的灭活，其目的在于防止油的酶降解和芥子油苷的分解，并且此外该热处理还可以使浓缩物或分离物中的蛋白质变性。
[0009]因此，US2009/0286961的方法可以提供一种不含芥子油苷降解组分的产品，但是是以使存在于油籽中的其他蛋白质变性为代价，并且它未解决可能由可溶性酚类物质引起的潜在问题。
[0010]EP0772976披露了一种生产具有高水平的萝卜硫素(sulphoraphane)和最少萝卜硫素-腈的芸苔属蔬菜补充物或浓缩物的方法。因此，EP0772976目的在于将母体芥子油苷、萝卜硫苷(gluocoraphanin)最大限度地转化成萝卜硫素,而同时最小化萝卜硫素-腈的存在。在其最广泛的形式中，这可以在包括以下步骤的一种方法中实现:使芸苔属蔬菜中的内源性黑芥子酶灭活并且将该蔬菜与外源性黑芥子酶进行掺混。确切地说，该方法可以包括将新鲜绿菜花烫漂以便使内源性黑芥子酶灭活，将蒸煮过的绿菜花与外源性黑芥子酶的源进行掺混，从该掺混的绿菜花与外源性黑芥子酶制备一种匀浆物，将该匀浆物进行离心，通过低热真空浓缩来浓缩上清液，将载体如淀粉、麦芽糖糊精、蔗糖、右旋糖以及蔬菜胶添加至浓缩的上清液，将PH降低至3.5，通过干燥该浓缩物和载体来形成一种粉末，并且从该粉末形成一种片剂。
[0011]虽然EP0772976解决了黑芥子酶对芥子油苷的活性并且披露了一种包括它的灭活的方法，但是该方法不适合于从芸苔属植物提供处于非变性形式的蛋白质。
[0012]W02008/144939披露了一种用于十字花科油籽的水性蛋白质提取的方法。该方法包括十字花科油籽柏的水性提取，其中将PH调整至从约2.5至约5.0的值以便获得一种可溶性富含油菜籽蛋白(napin)的蛋白质提取物和一种富含十字花科蛋白(cruciferin)的残余物。具体地说，据发现PH3至5的间隔提供令人希望的低溶解度。富含十字花科蛋白的残余物可以例如在中性或碱性pH、如从约7.0至约13.0下经受进一步的水性提取，以便获得一种可溶性富含十字花科蛋白的蛋白质提取物和一种低蛋白质残余物。这些可溶性蛋白质提取物可以进行脱盐并且通过过滤(如超滤法或透析过滤法)进行纯化。W02008/144939确切地说披露了使用5kD膜来过滤可溶性部分。
[0013]W02008/144939未明确地提及黑芥子酶，并且黑芥子酶_芥子油苷问题因此未明确地解决。具体地说，据显示还不涉及将黑芥子酶与芥子油苷分离以便防止随后的酶催化的芥子油苷转化。
[0014]鉴于以上，需要一种能够从来自白花菜目、尤其是十字花科的植物的种子提供产品的方法，该产品不含由黑芥子酶对芥子油苷的催化活性并且还由芥子油苷的非酶降解而发生的芥子油苷的降解产物。同样，需要一种能够去除酚类物质和芥子油苷以及其降解产物的方法。具体地说，需要一种能够从这些种子提供天然蛋白质并且避免不想要的氧化(伴随产生不同氧化产物)的方法。此外，需要一种用于在工业规模上将芥子油苷与黑芥子酶分离的方法。本发明解决了这些问题。
发明概述
[0015]本发明涉及一种用于从来自白花菜目的植物的种子制造一种产品的方法，该方法包括以下步骤:
[0016]-提供具有按重量计约9%或更少的含水量的种子；
[0017]-破坏这些种子；
[0018]-将这些破坏的种子与酸水溶液混合以便提供在约1.0至约5.0的范围内的混合物pH;
[0019]-将黑芥子酶从芥子油苷分离以便提供一个含有黑芥子酶的部分和一个不含黑芥子酶的部分；并且
[0020]-从该含有黑芥子酶的部分或从该不含黑芥子酶的部分分离出产物；
[0021]其中这些破坏的种子和该水性混合物的温度被维持在从约0°C至约65°C的值。优选的是，这些种子是来自十字花科的植物。进一步优选的是，该温度是从约0°c至约50°C。
[0022]本发明的方法从十字花科的一种植物材料提供多种产品，这些产品具有很少或没有芥子油苷和/或其降解产物。具体地说，该方法允许来自含有芥子油苷与黑芥子酶二者的植物种子的产品的分级分离，在不抑制黑芥子酶的情况下，这些酶否则可以使这些芥子油苷降解。来自白花菜目、尤其是十字花科的任何植物的种子可以用于该方法中。但是，还考虑采用来自十字花科的植物的其他部分。例如，在某些实施例中，该产品是从来自白花菜目、尤其是十字花科的任何植物的营养部分制造的。在一个优选的实施例中，这些种子是油菜籽(甘蓝型油菜(Brassica napus L.))。
[0023]芥子油苷的酶降解可以发生在破坏来自白花菜目、尤其是十字花科的植物的种子之后。通常这些种子的破坏导致这些种子的分解，其中，在未破坏的种子中，黑芥子酶与芥子油苷分离。因此，这些种子的破坏有利于芥子油苷与黑芥子酶之间的接触，该接触因此借此可以在存在水的情况下引发芥子油苷的酶降解。具体地说，当这些种子被破坏作为传统工业方法的一部分时，该破坏的植物材料可能经受水性提取，从而提供黑芥子酶的进一步活化；这在本发明的方法中被防止。
[0024]在破坏芸苔属种子之前，黑芥子酶和芥子油苷一般被隔离并且将不会发生芥子油苷的酶分解。然而，在初始破坏过程中，这些种子的高含水量允许芥子油苷的酶降解，从而产生损害最终产品的风险。因此，根据本发明，这些种子的含水量应该是低的，即按重量计约9%或更少。诸位发明人发现当含水量处于这个水平时，由黑芥子酶的活性促进的芥子油苷的酶降解被充分降低。因此，提供具有低含水量的种子可提供足够的时间帧来用于建立用以防止酶活性的另外措施，例如混合酸水溶液等等。某些类型的芸苔属种子可以具有按重量计高于9%的固有含水量。因此，在一个具体实施例中，提供这些种子的步骤可以包括将含水量降低至按重量计约9%或更少的一个步骤。在本发明的一个优选的实施例中，这些种子的含水量是在按重量计约2% (例如约4%)至约9%的范围之内。当含水量是在这个范围之内时，已经发现处于其天然状态的蛋白质和酶的回收是最佳的，并且归因于研磨的芥子油苷降解被降低。
[0025]任何方法可以用于降低含水量。例如，可以通过加热这些种子来干燥这些种子。当完整的种子正确地进行热干燥时，由于这些种子中的蛋白质的稳定形式，存在于这些种子中的蛋白质通常将不会变性。在另一个实施例中，可以使用提取来降低含水量。水的提取可以使用液体溶剂(例如乙醇或异丙醇)来进行，或可以使用处于一种亚临界或超临界状态的溶剂来提取水，这还被称为“亚临界提取”或“超临界提取”。优选的是，在超临界提取中使用二氧化碳(CO2)作为溶剂以便降低含水量，但是其他适当的溶剂也可以用于超临界提取中。超临界提取是本领域技术人员熟知的，这些技术人员可以容易地建立一种方法来从这些种子优先地提取水，例如在50°c和20MPa下使用二氧化碳。同样，本领域技术人员可以容易地建立一种方法来使用处于超临界状态的一种溶剂来从这些种子优先地提取油，例如在50°C和60MPa下使用二氧化碳。从这些种子超临界提取水和油可以按任何顺序顺序地进行或同时进行。同一超临界溶剂(例如二氧化碳)可以有利地用于专一地、选择性地并且顺序地提取水与油二者。使用超临界二氧化碳提取水有利地提供一种方法，其中去除水而不会使这些种子、并且借此这些种子的蛋白质经受高温，这样使得蛋白质的热变性最小化。
[0026]本发明人现在已经发现当根据本发明处理这些种子时，可以充分地抑制黑芥子酶，而无需如另外通常在现有技术的技术中所需要的对这些破坏的种子施加过多热量。当这些破坏的种子和该水性混合物的温度维持在约0°C至约65°C的范围之内的一个值、优选约50°C时，热介导的蛋白质的变性得以防止。因此，该方法提供用于回收和分离保留了其活性的天然蛋白质和酶。具体地说，它提供一种非变性的蛋白质的蛋白质产品。通过避免加热，回收的蛋白质(例如天然蛋白质或非变性蛋白质)将具有更好的溶解度参数。此外，如果芥子油苷降解产物已经与蛋白质进行反应(尤其是在赖氨酰残基和半胱氨酰残基的侧链上)，也观察到低蛋白质溶解度。因此，通过避免芥子油苷降解，可以保持蛋白质溶解度。这特别适用于油菜籽蛋白。从这些种子的破坏直到黑芥子酶已经从芥子油苷分离，应该将温度保持在所指示的范围之内。此外，水性混合物的温度越低，黑芥子酶的活性越低。因此，优选的是，温度在约0°C至约25°C (或“环境温度”)的范围之内。
[0027]将这些破坏的种子与一种酸水溶液进行混合以便提供因此所获得的水性混合物的在约1.0至约5.0的范围之内的pH。发明人发现在这个范围之内的pH抑制黑芥子酶的活性。图1示出pH对黑芥子酶的活性的作用。因此，通过将pH维持在其中由黑芥子酶引起的芥子油苷的降解被延迟的范围之内，芥子油苷和黑芥子酶可以被分离，而不会产生芥子油苷的任何降解产物。本发明人现在已经进一步发现:当使用一种螯合酸获得、任选地使用一种螯合酸与另一种酸(如一种强无机酸或一种有机酸)的组合获得时，在这个范围(即约1.0至约5.0)中的pH抑制芥子油苷的二价铁介导的水解和其他非酶分解以及酚类物质。当与在约0°C至约50°C、尤其是约0°C至约25°C的范围之内的、约20°C或约15°C的温度组合使用时，有可能从这些种子中回收天然蛋白质和非降解的芥子油苷。在一个具体实施例中，水性混合物的PH是约1.0至约3.0。本发明人发现将pH维持在这个范围内导致黑芥子酶的几乎完全抑制。图2示出在10分钟反应之后随pH变化的芥子油苷的残余含量。黑芥子酶抑制与非酶降解的防止的组合作用在PH3.0或更低(例如在约2.0至约2.5的范围之内)、在存在任选地与另一种酸组合的一种螯合酸的情况下是尤其显著的。这允许被低PH抑制的黑芥子酶和芥子油苷以及可溶性酚类物质存在于溶液中并且可以被回收。当pH是约2.0或更高时，一旦pH被重新调整至(例如)酶的最优值、例如至约6.5，可以恢复酶的活性。因此，当pH是在约2.0至约2.5 (例如约2.2至约2.3)的范围之内时，由于芥子油苷在这个pH下的高溶解度，有可能获得芥子油苷的良好产率，并且还有可能回收受pH抑制的黑芥子酶，该酶可以通过将PH增加至5以上进行重新活化。此外，在水性混合物的pH在2.0至约3.0、约2.0至约2.5、或约2.2至约2.3的范围之内的情况下，这些种子的蛋白质可以特别有利地以天然状态来回收。当PH是低于约2、例如在约1.0至约2.0的范围之内时，黑芥子酶可能被不可逆地灭活。因此，在一个具体实施例中，将这些破坏的种子与酸水溶液进行混合以便提供混合物的在约1.0至约2.0的范围之内的pH。当pH是在约1.0至约3.0的范围之内时，蛋白质的溶解度通常高于当pH是高于3.0时，并且这一范围可以提供蛋白质的改善的产率。在本发明的任何实施例中，有可能在将这些破坏的种子与酸水溶液进行混合之后进一步调整pH。具体地说，可以监测并且通过添加酸或碱将pH控制至一个所希望的值，或可以同样通过添加酸或碱来增加或降低pH。
[0028]能够提供在所指示的范围之内的pH的任何酸可以用于本发明的方法中。该酸可以是处于适当浓度的一种强酸或该酸可以是一种缓冲液。具体地说，在其中该PH是在约2.0至约3.0、例如约2.2至约2.3的范围之内的多个实施例中，优选的是使用一种缓冲液。在所有实施例中都有可能采用多种缓冲液与多种强酸的一种组合。该酸可以是一种无机酸或一种有机酸，具体地说，该酸对于在食物产品中使用可以是相容的。优选的是，该酸水溶液包含一种螯合剂，具体地说一种螯合酸。
[0029]破坏的种子与酸水溶液的任何比例在本发明的方法中都是可能的。然而，在多个优选的实施例中，破坏的种子与酸水溶液的比例是1:20至10:1。
[0030]根据本发明的方法，将黑芥子酶和芥子油苷分离成两部分，借此提供一个含有黑芥子酶的部分和一个不含黑芥子酶的部分。一般来说，在本发明的pH范围之内，黑芥子酶和芥子油苷是处于可溶形式。然而，在某些实施例中，黑芥子酶和/或芥子油苷还可以从溶液中沉淀出来。发明人发现将芥子油苷底物从黑芥子酶分离提供不含芥子油苷的、并且特别是不含衍生自芥子油苷的降解产物的高价值产品的回收。此外，可以回收黑芥子酶与芥子油苷二者，并且在某些方面，本发明涉及根据本发明的方法可获得的黑芥子酶和芥子油苷。
[0031]能够使黑芥子酶与芥子油苷分离的任何方法可以用于本发明的方法中。一般来说，芥子油苷是具有负电荷的小分子，而黑芥子酶是具有更大大小的蛋白质分子；某些黑芥子酶具有在约PH5或更高的等电点，从而使这些黑芥子酶在本发明的方法中的pH范围之内带正电荷。因此，黑芥子酶和芥子油苷可以基于它们的大小进行分离，例如使用超滤膜、透析过滤或凝胶过滤。具体地说，超滤膜可以被选择成具有例如IOOkDa或更低的截留值，从而允许黑芥子酶保留在渗余物中，而芥子糖苷可以从渗透物部分中进行回收。因此，当采用超滤或透析过滤时，渗余物将代表含有黑芥子酶的部分，该部分不含芥子油苷；并且渗透物将代表不含黑芥子酶的部分，该部分含有芥子油苷和可溶性酚类物质。
[0032]还可以使用吸附方法将黑芥子酶从芥子油苷分离。因此，可以将这些破坏的种子与酸水溶液的混合物与能够吸附、或结合黑芥子酶而不会结合芥子油苷或反之亦然的任何吸附材料相接触，接着从该吸附材料洗脱吸附的部分。例如，通过将该水性混合物与一种带负电荷的材料(例如一种阳离子交换材料)相接触，黑芥子酶可以吸附至该带负电荷的材料并且与芥子油苷分离。同样，通过将该水性混合物与一种带正电荷的材料(例如一种阴离子交换材料)相接触，芥子油苷可以吸附至该带正电荷的材料并且与黑芥子酶分离。任何离子交换材料都适合用于本发明的方法。还有可能采用其他原理将黑芥子酶吸附至吸附材料，例如可以将黑芥子酶吸附至用能够选择性地结合黑芥子酶的亲和配体进行功能化的一种材料。
[0033]当吸附材料用于分离黑芥子酶与芥子油苷时，可以使用如本领域技术人员将熟知的任何适当的方法从该吸附材料洗脱被吸附的组分，即视情况而定为黑芥子酶或芥子油苷。例如，当采用一种阳离子交换材料时，含有黑芥子酶的部分由被吸附的材料来表示，并且当采用一种阴离子交换材料时，该被吸附的材料表示含有芥子油苷和可溶性酚类物质的、不含黑芥子酶的部分。然后可以从该吸附材料洗脱出被吸附的材料。
[0034]根据本发明，可以从含有黑芥子酶的部分与不含黑芥子酶的部分二者回收产品。具体地说，本发明提供分离一种不含芥子油苷和/或芥子油苷降解产物的产品，例如一种不含以下化合物的产品:如腈类、异硫氰酸酯类、硫氰酸酯类、环硫腈类(epithionitriles)、以及卩惡唑烧~2~硫酮类。因此,本发明的方法改善了所分离的产品的质量并且取代去除所述化合物另外所要求的多个纯化步骤。此外，分离提供完整地回收黑芥子酶与芥子油苷二者的可能性。
[0035]在本发明的方法的一个实施例中，与酸水溶液进行混合和破坏这些种子的步骤是同时地进行的。这个工序进一步促进黑芥子酶的快速抑制。黑芥子酶典型地具有高反应速率。因此，重要的是将这些破坏的种子与已经在所希望的pH下的酸水溶液进行混合，或同时进行混合和破坏。然而，可能需要调整混合物的PH以便保持所希望的值。一旦这些破坏的种子已经与酸水溶液相混合，黑芥子酶就被抑制，并且这些破坏的种子可以用酸水溶液进行提取，持续如所希望的任何持续时间。
[0036]在根据本发明的方法的一个实施例中，该方法可以进一步包括以下步骤:将一个油部分从一个油耗尽的部分分离。用于从这些种子分离一个油部分的任何方法适合用于本发明，并且该术语应该理解成其最广泛的术语。例如，“分离油”可以包括挤压或使用适当的溶剂(例如液体溶剂如有机溶剂，或处于超临界状态的溶剂如超临界二氧化碳)提取、或挤压与液体或超临界溶剂提取的任何组合。当这些种子已经经受油挤压时，种子残余物或“压滤饼”被认为是表示“破坏的种子”，但是压滤饼还可以在与酸水溶液混合之前进行进一步破坏。同样，压滤饼可以在与酸水溶液混合的同时进行进一步破坏。在又一个另外的实施例中，在与酸水溶液混合之后分离油部分，例如使用能够分离两个液相(例如一个油相和一个水相)与一种固相的一种固液分离单兀。例如，该方法可以米用一种三相漢析离心机。[0037]在多个具体实施例中，本发明的方法的步骤被设置成在连续基础上操作。一个、多个或所有步骤可以被设置成连续地操作。连续操作尤其适用于大容量、例如每小时多吨种子的工业规模处理。
[0038]在根据本发明的方法的一个优选的实施例中，该产品是天然蛋白质。具体地说，该产品是具有低含量的芥子油苷和芥子油苷降解产物的天然芸苔属蛋白质。这些蛋白质非常适合作为食品成分并且将具有可比得上酪蛋白的价值。在另一个实施例中，该产品是一种可溶性或不溶性膳食纤维。在一个具体实施例中，本发明涉及一种方法，其中由于多种底物、例如可溶性酚类物质和在不想的颜色形成中所涉及的酶的分离，例如与通过传统方法所生产的蛋白质和纤维相比，蛋白质和纤维产品的深色减轻。在一个另外的实施例中，由于所涉及的、例如金属催化的或其他氧化的抑制，蛋白质和纤维产品的非酶颜色形成减轻。根据本发明的方法可以提供一种产品，其中由于多种底物和酶的初始抑制和分离，蛋白质(例如天然蛋白质)和纤维产品的营养价值被保留；这些底物和酶否则造成引起这些蛋白质和纤维产品的减少的营养价值的反应。
[0039]在另一个实施例中，该产品是一种芥子油苷。芥子油苷可用作生物活性化合物和/或分子结构单元(building block)。取决于类型,这些化合物可以用作药物(例如癌症预防)或与或不与黑芥子酶相组合用作农药、杀真菌剂或杀虫剂。在另外的其他实施例中，本发明的方法的产品是芥子油苷的一种降解产物，例如来自芥子油苷的黑芥子酶处理的一种降解产物。在另一个实施例中，该产品是活性黑芥子酶，并且在一个另外的实施例中，该产品是处于受抑制的或无活性形式的一种黑芥子酶。在根据本发明的方法的一个优选实施例中，黑芥子酶是按照其活性形式和/或按照它可以返回至它的活性形式的一种状态来回收。这类黑芥子酶可用于芥子油苷降解，因为芥子油苷化合物的降解产物(例如)可以用作农药、杀真菌剂、和/或杀昆虫剂。在另一个实施例中，该产品是一种抗氧化剂或一种酚类化合物。这些抗氧化剂可以是中性、阴离子、以及阳离子抗氧化剂。在另一个实施例中，该产品是油。在另一个实施例中，该产品是一种两亲性脂质，例如一种磷脂或一种糖脂。在另一个实施例中，该产品是一种脂溶性抗氧化剂或维生素。
[0040]附图简要说明
[0041]通过使用以下示意图进一步详细地解释本发明的多个实施例。这些说明用作实例并且不应限制本发明的范围:
[0042]图1示出随pH变化的黑芥子酶活性。
[0043]图2示出随pH变化的残余芥子油苷含量。
[0044]图3示出不同缓冲液对黑芥子酶活性的作用。
[0045]图4示出展示导致源自十字花科植物材料的不同有价值的产品的分级分离的方法步骤的示意性流程图。
[0046]图5示出展示用于源自一种白花菜目植物的种子的油乳剂的分级分离的方法步骤的示意性流程图。
[0047]图6示出展示用于富含蛋白质的材料的分级分离的方法步骤的示意性流程图。
[0048]图7示出展示用于一种酸性水部分的分级分离的方法步骤的示意性流程图，该酸性水部分是在用于源自十字花科植物材料的有价值的产品的分级分离的方法中获得的。
[0049]发明详细说明[0050]本发明涉及一种用于从来自白花菜目的植物的种子制造一种产品的方法，该方法包括以下步骤:
[0051]-提供具有按重量计约9%或更少的含水量的种子；
[0052]-破坏这些种子；
[0053]-将这些破坏的种子与酸水溶液混合以便提供在约1.0至约5.0的范围之内的混合物PH ；
[0054]-将黑芥子酶从芥子油苷分离以便提供一个含有黑芥子酶的部分和一个不含黑芥子酶的部分；并且
[0055]-从该含有黑芥子酶的部分或从该不含黑芥子酶的部分分离出产物；
[0056]其中这些破坏的种子和该水性混合物的温度被维持在从约0°C至约65°C的一个值。
[0057]参考示出这些方法的示意性流程图的多个图进行说明，其中每个方法步骤通常用根据该方法标记的框来表示。同样，起始或最终产品以及中间产品也由适当标记的框鉴别。
[0058]最初，提供具有低含水量的、来自白花菜目、尤其是十字花科的一种植物的种子。白花菜目、尤其是十字花科的任何植物适合用于该方法，但是含有黑芥子酶-芥子油苷防御系统的其他科的植物也可以根据本发明进行处理。同样，十字花科的植物的其他部分也适合用于该方法的某些实施例。该科尤其包括以下物种:如甘蓝(Brassicaoleracea)(绿菜花(broccoli)、卷心菜、花椰菜(cauliflower),等等)、芜菁(Brassica rapa)(芜菁(turnip)、大白菜(Chinese cabbage),等等)、甘蓝型油菜(油菜籽，等等)、黑芥(Brassicanigra)(黑芥(black mustard))、褐芥菜(Brassica juncea)(褐芥菜(sareptamustard))、萝卜(Raphanus sativus)(常见萝卜)、白芥(Sinapisalba)(芥菜)、辣根(Armoraciarusticana)(辣根(horseradish))、紫罗兰(Matthiola)(紫罗兰(stock))、拟南芥(Arabidopsis thaliana)。优选的种子是油菜籽或卡诺拉种子。其他相关种子是卷心菜、绿菜花、花椰菜、芜菁、芥菜、萝卜、辣根、水芹(cress)、山葵(wasabi)以及水田芥(watercress)的种子。该科还可以被称为十字花科(Cruciferae)、芥菜科(mustardfamily)或甘蓝科(cabbage family),并且术语芸苔属植物(brassica)和十字花科植物(crucifer)(或十字花科的(cruciferous))同样是指该科的植物。这些术语可以互换使用。
[0059]植物通常包含可溶性和不溶性组分(如蛋白质和非蛋白质组分)的复杂混合物。本发明的方法提供源自这些组分的产品，如蛋白质(例如天然蛋白质)，处于受抑制的、活性或无活性形式的黑芥子酶，纤维、淀粉、果胶、纤维素和半纤维素、芥子油苷以及其降解产物、抗氧化剂、酚类物质、矿物质、以及其他有机组分。
[0060]如结合本发明提及的“种子”是指从一种植物获得和/或源自一种植物的任何种子。种子还可以被称为细胞型胚乳。种子中储存的主要大分子材料是碳水化合物、蛋白质、以及脂质。这些化合物一起存在，但是相对量在不同分类的种子中不同。
[0061]本发明的方法还可以与其他含有芥子油苷/黑芥子酶的植物材料(例如像卷心菜、绿菜花、花椰菜，等等)一起使用。该方法可以根据起始材料(十字花科植物品种、植物部分等等)进行修改，但是总体过程是如所描述的。
[0062]十字花科的成员典型地包含一种或多种黑芥子酶。单一物种可以包含单一黑芥子酶或几种不同的黑芥子酶，并且一种黑芥子酶可以作为不同的同工酶被发现。在本发明的背景下，术语“黑芥子酶”通常是指存在于相关种子中的黑芥子酶。具体地说，一种黑芥子酶可以是根据EC3.2.1.147分类的一种酶。
[0063]术语“芥子油苷”也应广义地理解。芥子油苷典型地是具有充分定义的结构的水溶性阴离子，其由具有处于顺式-[Z]-构型的、在醛肟碳(C-O)处连接至硫酸根基的β -D-硫代吡喃葡萄糖基的烷基醛肟-O-硫酸根酯组成。除了一些例外，烷基侧链对于不同芥子油苷来说不同，并且正是这个侧基中的变化造成这些植物化合物的生物活性的主要变化。单一植物可以包含一种或多种不同的芥子油苷，并且术语芥子油苷通常是指存在于相关种子中的芥子油苷。具体地说，“芥子油苷”还可以指多种芥子油苷的混合物。
[0064]一般来说，植物材料将在本发明的方法中经受一定程度的破坏性处理。这种破坏性处理(或“破坏”或这个术语的派生形式)可以是旨在减少该植物材料的部分或颗粒的大小的任何处理，并且典型的破坏性处理涉及切割、挤压、切碎、研磨、碾磨、压碎、磨碎、粉碎等等。具体地说，破坏目的在于降解或破坏该植物材料的细胞壁以便使这些细胞的内容物可及。在一个优选实施例中，这些种子是通过在将这些种子与酸水溶液混合之后湿研磨来进行破坏，以使得破坏和进一步混合是同时进行。再又另一个实施例中，这些种子在初始干燥破坏、接着湿研磨中进行破坏，其优选地与同酸水溶液混合同时进行。术语植物材料和破坏的植物材料还可以指在破坏性处理中所产生的任何液体，并且术语“植物材料”因此可以指任何整个植物、一种植物的任何部分、在破坏性处理过程中所获得的一种固体或液体材料、或这些的一种混合物。
[0065]本发明的方法包括将这些破坏的种子与酸水溶液进行混合、以便提供混合物的在约1.0至约5.0的范围之内的pH的一个步骤。在本发明的背景下，这个范围通常被称为“低pH”。与本发明的方法相关的其他pH范围是约1.0至约3.0、如约2.0至约2.5、如约
2.2至约2.3的值。在这些pH范围内，黑芥子酶被抑制。在低于约2.0的pH下，黑芥子酶通常被不可逆地抑制。据信使黑芥子酶经受具有低于约2.0的pH值的环境导致该酶的一种不可逆变性。因此，在一个具体实施例中，从约1.0至约2.0的pH范围对于提供一种不可逆地灭活的黑芥子酶是切合的。该PH可以使用任何酸(如硫酸、盐酸或磷酸)来获得，或该酸可以是有机的，如柠檬酸或乙酸。在某些具体实施例中，该酸还能够充当一种螯合剂，这些酸包括例如柠檬酸、草酸、乳酸、苹果酸、丙二酸(maleonic acid)、酒石酸、琥珀酸。某些黑芥子酶包含一种金属原子，例如一种锌原子，其可以涉及在酶的活性中，并且据信一种螯合酸还可以通过螯合该金属原子来抑制该酶。此外，不受理论束缚，本发明人认为一种螯合酸可以结合存在于溶液中的金属离子(例如二价铁)，并且借此防止芥子油苷的非酶金属离子介导的分解和酚类物质。在一个具体实施例中，该酸是柠檬酸或乙酸。图3示出一种螯合酸(即柠檬酸)对一种黑芥子酶的活性的作用。
[0066]关于一些应用，可能希望完全地或部分地去除和/或中和该酸。根据本发明的产品的低PH可能例如干扰后来的酶的应用，并且它还可能干扰在根据本发明的一种或多种产品的基础上生产的食物产品的味道，特别是如果相对大量的这类产品被添加至该食物产品的话。
[0067]图4展示用于十字花科植物材料的分级分离的一种总体方法。术语“分级分离”和“生物分级分离”可以互换使用，并且是指一种植物种子的多种组分分离成不同部分，这些部分可以进行进一步处理以便获得用于该具体部分的一种最终产品。其他作物可以使用相同和/或相似方法进行处理。本发明的示例性实施例的一个目的是提供该十字花科植物材料分级分离成多个单独的产品，如蛋白质、芥子油苷、黑芥子酶、酚类物质、纤维部分，等等。具体地说，本发明方法的一个目的是获得处于其天然形式的黑芥子酶的一个部分以及将芥子油苷从天然黑芥子酶分离。
[0068]在本发明的方法中，这些种子首先进行破坏。出于本发明的目的，任何破坏方法是适当的，并且所采用的破坏原理的具体类型可以取决于这些种子的性质和它们的具体组成进行选择。例如，该破坏原理可以选自这类参数如这些种子的水和油含量、在破坏之前这些种子的大小、以及这些种子的硬度。该破坏原理典型地被选择成允许这些种子中的细胞的细胞壁破坏，并且典型的原理包括切割、挤压、切碎、研磨、碾磨、粉碎、磨碎等等。在一个优选实施例中，破坏涉及挤压以便允许一个油部分从一个油耗尽的部分分离。
[0069]在一个优选实施例中，破坏涉及挤压以便允许一个油部分与一个油耗尽的部分分离。在挤压之后所获得的材料在图4中被称为“饲料”。该挤压是在保持这些蛋白质处于其天然形式的温和条件下进行。这暗含连续处理是在低温下进行，例如在约0°C至环境温度的范围之内、如在约(TC至约20°C、约19°C、约18°C、约17°C、约16°C、约15°C、约10°C或约5°C的范围之内的温度；或轻度增加的温度，例如在约环境温度至约50°C、如至约45°C、约40°C、约35°C或约30°C的范围之内的温度。此外，为了获得成功的生物分级分离，这些种子应该是成熟的并且具有低含水量。芥子油苷应该以其天然状态进行保存。然而，在初始破坏性处理过程中的高含水量(即按重量计高于9%)可以导致这些芥子油苷的酶降解，从而有可能会对最终产品产生不可逆性损害。因此，含水量应该是相当低的，例如在按重量计约2% (例如约4%)至约9%的范围之内，以便有利于蛋白质的提取并且避免这些芥子油苷的酶降解、之后的由与芥子油苷降解产物反应而进行的蛋白质的化学修饰。如果满足这些指标，那么所生产的油具有低的或不可检测的芥子油苷降解产物，并且种子残余物中的蛋白质和纤维保持其天然形式。优选的是，在破坏中温度低于环境温度以便进一步最小化芥子油苷的酶降解。
[0070]可以在挤压之后立即分离油，例如使用过滤或离心，或可以在生物分级分离过程中将油耗尽的部分(例如这些破坏的种子)和油部分与酸水溶液进行混合以便提取蛋白质、可溶性纤维、芥子油苷以及感兴趣的其他组分。由于这些破坏的种子包含芥子油苷与天然黑芥子酶二者，应谨慎避免在接下来的提取步骤过程中的酶芥子油苷降解。提取(在图4中的“混合器”中)是在酸水溶液中进行，并且为了避免芥子油苷降解，PH保持较低以便在芥子油苷与黑芥子酶相接触时最小化黑芥子酶活性。温度优选地保持较低，温度越低，黑芥子酶的酶活性越低。
[0071]可以自由地选择提取步骤的持续时间，例如提取可以瞬时发生，或提取可以具有长达例如3小时、如I分钟、10分钟、15分钟、30分钟或I小时的持续时间。提取可以有利地作为一个连续过程进行。在某些实施例中，可能需要在提取过程中物理地搅拌混合物。例如，提取可以在配备有搅拌桨、叶轮、圆盘涡轮、螺旋桨等的一个容器中进行，或该混合容器可以以另外的方式来装配以搅拌破坏的种子与酸水溶液的混合物。在一个实施例中，混合是通过湿研磨任选地与同时破坏组合进行。具体地说，当物理地搅拌破坏的种子与酸水溶液的混合物时，这通常涉及使该混合物经受剪切应力。在一个优选的实施例中，感兴趣的组分，例如蛋白质、纤维、黑芥子酶、芥子油苷等等是在液相中发现的。感兴趣的这些组分可以溶解于该液相中或者感兴趣的这些组分可以被发现处于一种沉淀状态中。在本发明的某些实施例中，感兴趣的一些组分被发现处于一种溶解状态，并且感兴趣的其他组分是处于一种沉淀的形式。
[0072]在这些破坏的种子、的提取之后，可以使例如压滤饼、这些破坏的种子与酸水溶液的混合物经受固液分离以便将具有感兴趣的这些组分的一种液相与一种固相(或“壳”)分离。这可以通过使用例如离心机、筛或水力旋流器(hydrocyclones)或这些的组合来完成。在一个特别优选的实施例中，使用三相滗析器来获得包括一个油相(例如一种油乳剂)、一个第一酸性水相(例如一种蛋白质悬浮液)、以及具有壳的一个固相的三个部分。该油乳剂可以进行进一步处理以便获得一个纯化的油部分；图5展示从该三相滗析器获得的油乳剂的进一步处理。在这个实例中，将该油乳剂与水在增加的温度下进行混合，并且将所获得的悬浮液在例如一个二相滗析离心机中进行处理以便提供一种纯化的油和一种水相。
[0073]从该三相滗析离心机所获得的第一酸性水相(例如蛋白质悬浮液)可以使用一个二相滗析离心机进行处理，以便分级分离该蛋白质悬浮液，从而提供一个第二酸性水相或第二蛋白质悬浮液，和一个富含蛋白质的部分(“富含蛋白质的材料”或PRM)。来自该第一酸性水相的黑芥子酶和芥子油苷被发现处于该第二水相中，并且该富含蛋白质的部分包含蛋白质、不含黑芥子酶与芥子油苷二者，并且这个部分还可以被称为一种蛋白质分离物。可以如所希望的使这种蛋白质分离物经受任何进一步处理步骤；适当的进一步处理是本领域技术人员所已知的。例如，图6展示富含蛋白质的部分的处理，在这种情况下该富含蛋白质的部分还包含不溶性纤维。将该富含蛋白质的部分与水、任选地还与盐(指示为“盐水”)和/或任选地在碱性PH下在混合器中进行混合。碱性pH有利于蛋白质从这些不溶性纤维的溶解，但是在中性pH下的水也可以溶解蛋白质。优选的是，盐(例如NaCl)还例如在约
0.02M至约1.0M下存在，因为盐可以防止由于酚类化合物(尤其是芥子碱和其他芥子酰基(sinapoyl)衍生物)的氧化而引起的、例如呈褐化形式的变色。使具有不溶性纤维和溶解的蛋白质的盐水经受一种固-液分离(例如一种二相滗析离心机)以便将这些不溶性纤维与溶解的蛋白质(“水部分”)分离。可以使该水部分经受一种脱盐操作，例如在20kDa、10kDa、5kDa、3kDa或IkDa下透析过滤，以便去除盐并且还任选地将溶解的蛋白质浓缩为一种蛋白质浓缩物(“球蛋白”)。在图6中所示的这些步骤中产生的蛋白质和不溶性纤维不含芥子油苷和芥子油苷降解产物以及黑芥子酶，并且这些蛋白质和不溶性纤维是本发明的产品。
[0074]从该二相滗析离心机获得的第二酸性水相(例如该第二蛋白质悬浮液)包含水溶性化合物如蛋白质、芥子油苷、黑芥子酶、可溶性膳食纤维以及其他可溶性化合物。可以使从该二相滗析离心机获得的第二酸性水相经受进一步固-液分离(例如过滤或离心)以便获得处于渗余物中的一个富含脂蛋白的部分和一个第三酸性水相(图4和图7中的“酸性水部分”)。所应用的过滤方法可以是适合用于水/蛋白质悬浮液的分离的任何过滤方法。
[0075]该第三酸性水相将根据本发明进行处理以便分离黑芥子酶与芥子油苷，从而提供一个含有黑芥子酶的部分和一个不含黑芥子酶的部分，例如如图7中所展示的。在其他实施例中，该第一或该第二酸性水相直接地进行处理以便分离黑芥子酶与芥子油苷，而无需以上所概述的另外处理步骤。在又一个另外的实施例中，这些破坏的种子与酸水溶液的混合物直接地进行处理，如图7中所展示。该第一、第二以及第三酸性水相通常被称为“酸性水部分”。
[0076]图7展示在该酸性水部分中所发现的芥子油苷和黑芥子酶的进一步处理。在图7的实施例中，该酸性水部分经受一个超滤步骤，以便基于大小上的差异分离芥子油苷与黑芥子酶。超滤被认为是在要求在连续系统中纯化、分离、以及浓缩目标大分子的方法中特别适合用于工业目的。在一个具体实施例中，本发明的方法是连续地进行。该酸性水部分、或更一般地该水性混合物可以经受超滤，该超滤使用在约IOkDa至约300kDa、优选地约50kDa至约200kDa、更优选地约75kDa至约150kDa、甚至更优选地85kDa至约125kDa的范围之内的截留值。在图7的实施例中，使用具有约IOOkDa的截留值的超滤来从芥子油苷去除黑芥子酶。一般来说，超滤膜和它的截留值被选择成使得芥子油苷和某些低分子量(LMW)蛋白质被发现处于渗透物中，而包含黑芥子酶的某些高分子量(HMW)蛋白质并且典型地还有可溶性纤维位于浓缩物(或渗余物)中。
[0077]可替代地，黑芥子酶与芥子油苷的分离还可以通过将这些破坏的种子与酸水溶液的混合物或该酸性水部分与一种吸附材料相接触来进行。在本发明的背景下，术语“接触”应被理解为使该水性酸性混合物与该吸附材料(例如一种色谱树脂)相接触，从而允许植物材料的溶解的或悬浮的组分与含有适当的官能团的吸附材料的表面相互作用。该接触可以在任何适当的接触容器(例如一个搅拌槽或以另外的方式混合的槽)中进行，或当将植物材料与树脂相接触时，可以将该树脂放置在用作一个接触容器的柱中。具有树脂的柱可以是色谱中所使用的任何类型，如填充床柱或膨胀床柱、轴流式柱、或径流式柱，并且这类柱可以根据任何色谱原理进行操作。该树脂不必在该方法的所有步骤中处于同一类型的接触容器中。例如，该接触可以在一个搅拌槽中进行，而对于随后的洗脱步骤来说，将该树脂转移至一个柱。优选使用一个柱作为接触步骤与洗脱步骤二者的接触容器。
[0078]蛋白质和其他聚合型生物分子具有许多官能团，这些官能团可以具有正电荷和/或负电荷。这些官能团典型地具有带弱电荷的性质并且因此它们的电荷将取决于环境pH。因此，在本发明的低PH下，黑芥子酶通常将是处于它们的阳离子形式，因此允许结合至阳离子交换色谱树脂的固定相。相反，芥子油苷是带负电荷的并且将不会结合至阳离子交换材料。因此，可以通过将这些破坏的种子与酸水溶液的混合物与阳离子交换材料或阴离子交换材料相接触来相应地吸附黑芥子酶或芥子油苷来将芥子油苷从黑芥子酶分离。
[0079]吸附至阳离子交换材料的黑芥子酶可以随后通过将周围液体的pH改变至黑芥子酶的等电点之上，以便在蛋白质与树脂上的这些官能团之间引入静电排斥来从该材料洗脱出并且回收。可替代地，可以通过将吸附材料与具有高离子强度的一种溶液(例如在0.1至IM或更高浓度下的NaCl)相接触来从该材料洗脱出黑芥子酶和芥子油苷。
[0080]当各自具有不同特征(如等电点)的几种不同种类的蛋白质或其他化合物结合至同一离子交换树脂时，有可能选择性地洗脱一种或多种结合的种类并且借此将它们从其他结合的种类分级分离。不同种类的选择性洗脱可以通过将具有结合的蛋白质的树脂逐渐暴露于越来越强的洗脱条件来获得。例如，从一种阳离子交换材料选择性洗脱可以通过以下方式来获得:首先增加至高于结合pH的一个pH值,然后增加至又另一个更高的pH等等。这种逐步选择性洗脱也涵盖于本发明的方法中。还有可能逐渐增加洗脱剂溶液的离子强度并且借此获得选择性洗脱。
[0081]考虑使用洗脱梯度。“梯度”应理解为柱的液相经受从一个极限条件至另一个极限条件的逐渐变化。梯度可以通过成比例地混合两种溶液以使得施加至该柱的液体具有增加比例的后一种溶液来产生。该梯度可以是简单线性梯度，其中洗脱剂溶液的比例(随时间的推移)恒定增加，或该梯度可以遵循更复杂的模式。还有可能采用多个条件的逐步变化，其中例如在将该植物材料与该树脂相接触之后首先将洗涤溶液施加至该柱，然后施加第一洗脱剂溶液持续给定时间量，然后施加第二洗脱剂溶液，诸如此类。
[0082]色谱树脂可以是本领域已知的用于不同类型的色谱法的任何类型。例如，该树脂可以是用于膨胀床色谱法的致密类型、用于液相色谱法的所谓的软凝胶、用于高效或高压液相色谱法(HPLC)的树脂。然而，优选的是采用被设计用于在高流速下操作的大容量的的树脂，例如像琼脂糖大珠粒、琼脂糖快速流、琼脂糖XL、Cellthru大珠粒或Rhobust?吸附剂。这些琼脂糖品牌的色谱树脂由GE医疗集团(GEHealthcare) (http://www.gehealthcare.com)出售，并且适当的树脂类型在由GE医疗集团出版的手册“离子交换色谱法 & 色谱聚焦，原理和方法”(“1n Exchange Chromatography&Chromatofocusing, Principlesand Methods”)中进行了详细描述。Cellthru大珠粒由Sterogene生物分离公司(Sterogene Bioseparations) (http://www.sterogene.com)出售。Rhobust?吸附剂由Upfront公司(http://www.upfront-dk.com)出售。然而,在本发明的背景下离子交换分离中所采用的其他类型的吸附剂材料还被认为是在定义“色谱树脂”内。这种吸附剂材料包含带电荷的膜和所谓的色谱整块料。
[0083]适当的操作参数如线性和/或容积流速、色谱柱的适当的直径和高度、给定方法所需要的色谱树脂的量、树脂的平衡和再生、与树脂相接触的材料的缓冲能力等等同样描述于手册“离子交换色谱法&色谱聚焦，原理和方法”以及本领域技术人员熟知的其他参考手册中。
[0084]在一个另外的实施例中，将这些破坏的种子与酸水溶液的混合物与用适当的配体(如一种凝集素，例如伴刀豆球蛋白A)进行功能化的亲和吸附材料相接触，以便吸附黑芥子酶而不吸附芥子油苷。
[0085]在图7的实施例中，可以使包含芥子油苷但无黑芥子酶的渗透物经受具有比前述步骤更低的截留(例如具有IOkDa的截留)的进一步超滤步骤。这将提供具有10至IOOkDa分子量的蛋白质和可溶性纤维的浓缩物。纤维和蛋白质可以通过以下方式来分离:将该浓缩物与一种离子交换材料(例如一种阳离子交换树脂或一种阴离子交换树脂)相接触，以便吸附蛋白质同时保持可溶性纤维流通。可以将处于低PH下的浓缩物与一种阳离子交换材料直接相接触，而在与一种阴离子交换剂相接触之前可以增加pH。
[0086]来自第二 (例如IOkDa截留)超滤的渗透物一般将包含肽和LMW蛋白质以及具有低于IOkDa分子量的碳水化合物以及小分子，如芥子油苷、抗氧化剂以及酚类化合物。该第二渗透物的这些组分可以通过以下方式来进行分离:首先与一种阳离子交换材料相接触并且然后将来自该阳离子交换步骤的穿过流与一种阴离子交换材料相接触。该阳离子交换步骤将吸附蛋白质(“LMW白蛋白”)、氨基酸、以及阳离子抗氧化剂，它们可以通过如以上所描述的洗脱进行回收。在之后的阴离子交换步骤中，芥子油苷和阴离子抗氧化剂将结合至该离子交换剂并且可以通过如以上所描述的洗脱进行回收。来自该阴离子交换步骤的贯通流部分将包含LMW碳水化合物。
[0087]图7中所展示的具体单元操作可以如所希望的针对不同的操作使用方法流的任何必要的修改进行组合，只要黑芥子酶与芥子油苷彼此分离即可。因此，用于从这些植物种子制造产品的方法包括用于达到最终产品的多个不同的步骤。呈现这些步骤的顺序对于本发明来说不应是限制性的。这些步骤可以按任何适合的顺序执行。根据本发明，重要的是将这些破坏的种子与处于低pH下的酸水溶液进行混合。还有可能在不偏离本发明的情况下添加另外的技术助剂如酶、絮凝剂、助滤剂等等，以便例如溶解、净化或水解多种组分，例如碳水化合物、细胞壁组分、蛋白质等等。例如，该混合物可以补充有一种细胞壁降解酶以便改进对多种细胞组分的可及性，或该混合物可以补充有一种絮凝剂以便沉淀所希望的组分。
[0088]在其他方面，本发明涉及在本发明的方法中可获得的产品。
[0089]该方法可以进一步包括纤维的分级分离。如结合本发明使用的术语“纤维”表示对消化道(即胃和小肠)中的酶消化具有抗性并且因此基本上完整地到达大肠的聚合型化合物。这样，“抗性淀粉”可以包括在根据本发明的术语“纤维”中。在摄取时，纤维具有几种有益的生理作用，如防止结肠癌、改善葡萄糖耐性以及胰岛素敏感性、降低血浆胆固醇和甘油三酯浓度、增加饱腹感、并且甚至可能降低脂肪储存。
[0090]膳食纤维是将食物移动通过消化系统的植物从而吸收水并且使排便容易的不可消化的部分。膳食纤维由非淀粉多糖(如纤维素)和许多其他植物组分如糊精、菊粉、木质素、蜡类、几丁质、果胶、β_葡聚糖、以及低聚糖组成。膳食纤维通常根据它们是否是水溶性的来进行分类。不溶性纤维具有被动吸水特性，该特性帮助增加体积、软化粪便并且缩短通过肠道的通行时间。可溶性纤维通常经由发酵在肠中经历代谢处理，从而产生具有广泛的、显著健康作用的最终产物。
[0091]可能希望从一种蛋白质产品(例如一种蛋白质分离物或浓缩物)去除可溶性纤维以便用于制备一种动物饲料。然而，可溶性纤维本身可以构成来自植物材料的潜在商业上感兴趣的组分。可溶性纤维可以用作例如一种糖替代剂。具有当前商业兴趣的可溶性纤维包括例如果聚糖、菊粉、低聚果糖、聚右旋糖、不可消化糊精等等。由于在水中的溶解度，这些产品在食品工业中具有广泛用途，特别是与例如高强度甜味剂组合作为低热量糖替代品。可溶性纤维还可以用于改善不同食物产品的营养品质。
[0092]实例
[0093]实例1-在低pH处理之后黑芥子酶活性的恢复
[0094]将0.5克的甘蓝型油菜(DM8%)全脂种子在一个咖啡碾磨机中进行研磨并且随后与从I至200mM变化的10.0OmL柠檬酸盐缓冲液进行混合。另外制作含有IOOmM柠檬酸盐缓冲液和IOmM硫酸或25mM朽1檬酸盐缓冲液和50mM硫酸的样品。使用Ultra Turrax用湿研磨进行地面种子材料与这些不同缓冲液的混合持续2分钟。将温度保持在20°C。
[0095]在4000x g下离心5分钟以便产生一种上清液和一个沉积物相。测量在所有溶液中的pH。同样在280nm与325nm两者下进行UV吸光度的测量。
[0096]使用分光光度法测量在低pH下处理之后的黑芥子酶活性，其中黑芥子苷(1.2mM，500 μ L)用作底物，抗坏血酸用作反应的活化剂(10禮，75 μ L)，并且磷酸盐缓冲液(50mM，体积可变，PH6.5)用来保持pH恒定，并且最终上清液(体积可变，典型地从10至100 μ L)含有黑芥子酶，其中总体积在0.5cm石英比色皿中保持在1.5mL。测量是使用空白进行，并且根据由底物的酶水解导致的在227nm下的吸光度的减少来计算活性。在20°C下进行测量。[0097]黑芥子酶活性被测量为在暴露于的不同pH值之后有可能恢复的活性，如图1中所示。在上清液中测量的PH值受主要由蛋白质涵盖的这些种子组分的缓冲能力的影响。在暴露于5.5至4.5的pH值之后在pH6.5下测量的黑芥子酶的恢复的活性几乎等于使用pH6.5的提取可以发现的活性。因此，黑芥子酶未通过暴露于这些PH值而被降解，并且活性的完全恢复是可能的。在从PH4至3的更低pH值下，可以观察到恢复的活性黑芥子酶的线性减少，并且仅可以恢复30%的原始黑芥子酶活性。将pH值降低至2.1导致总计低于原始活性的10%的、可恢复的再活化的黑芥子酶的进一步降低，这指示黑芥子酶的不可逆的灭活。
[0098]当将pH从pH5.5降低至3.0时，如在280nm下通过直接UV光谱法所测量的，蛋白质溶解度增加，从而产生总计25%的增加。因此，可恢复的黑芥子酶活性的降低不是上清液相中的黑芥子酶的降低的溶解度的结果。
[0099]实例2-受溶液的pH影响的溶液中的芥子油苷水平
[0100]将0.5克的甘蓝型油菜(DM8%)全脂种子在一个咖啡碾磨机中研磨并且随后与从I至200mM变化的10.0OmL柠檬酸盐缓冲液混合。另外制作含有IOOmM柠檬酸盐缓冲液和IOmM硫酸或25mM柠檬酸盐缓冲液和50mM硫酸的样品。为了实现更低的pH值，还制备具有增加浓度的硫酸的混合物。这些混合物的硫酸是从40mM至150mM范围。使用Ultra Turrax用湿研磨进行地面种子材料与这些不同缓冲液的混合持续2分钟。将温度保持在20°C。
[0101]在4000x g下离心5分钟以便产生一种上清液和一个沉积物相。测量在所有溶液中的pH。
[0102]将上清液(ImL)添加至一个阴离子交换柱(ImL葡聚糖凝胶DEAE，A-25，GE医疗集团)以便将芥子油苷吸附至该离子交换树脂上并且借此将它们从黑芥子酶分离。使用2 X ImL去离子水和2 X 0.5mL0.02M乙酸盐缓冲液pH5.0将包含黑芥子酶的未结合的和松散结合的材料从该柱洗涤出。将75 μ L硫酸酯酶(17mg/mL)添加至该柱并且这被静置过夜并且随后用3X ImL去离子水洗脱由硫酸酯酶活性提供的脱硫芥子油苷。通过使用胶束电动毛细管色谱法来分析脱硫芥子油苷。
[0103]作为脱硫芥子油苷分析的芥子油苷用作在不同pH值下在溶液中的黑芥子酶活性程度的另一个度量。这是重要的，因为目标是避免芥子油苷的降解。
[0104]在图2中示出在暴露于黑芥子酶之后溶液中剩余的完整芥子油苷。这个水平取决于作为所有酶反应提供的反应时间。在暴露于5.5至4.5的pH值之后剩余的芥子油苷是低的。在这些PH值下仅剩下17%完整芥子油苷，这也是预期中的。将pH降低到3和4之间，使剩余的完整芥子油苷减少至最大可获得的约50%。将pH降低至约2提供了完整的芥子油苷的保存以及将完整的芥子油苷保存在溶液中而无需黑芥子酶的预先热灭活的可能性的证明。此外，在低PH下的处理与在阴离子交换色谱法中黑芥子酶从芥子油苷的分离的组合提供了可以在本发明的方法中产生一种不含芥子油苷和芥子油苷降解产物的产品。
[0105]实例3-不同pH和不同缓冲系统中的黑芥子酶活性
[0106]将甘蓝型油菜(DM8%)的0.5克全脂种子在一个咖啡碾磨机中进行研磨并且随后与10.0OmL缓冲液进行混合，使用50mM柠檬酸盐或乙酸盐调整至从pH7至pH2范围的不同pH值。地面种子材料与这些不同缓冲液的混合是用湿研磨使用Ultra Turrax进行2分钟。将温度保持在20°C。
[0107]在4000x g下进行离心5分钟以便产生一种上清液和一个沉积物相。测量在所有溶液中的pH。
[0108]使用分光光度法测量黑芥子酶活性，其中黑芥子苷(1.2mM, 500 μ L)用作底物，抗坏血酸用作反应的活化剂(IOmM, 75 μ L)，并且根据样品条件的缓冲液(柠檬酸盐或乙酸盐)(50mM,体积可变，pH根据样品条件可变)用于保持pH恒定，并且最终上清液(体积可变，典型地从10至100 μ L)含有黑芥子酶，其中总体积在0.5cm石英比色皿中保持在1.5mL。使用空白进行测量，并且根据由底物的酶水解导致的在227nm下吸光度的降低来计算活性。在20°C下进行测量。
[0109]pH对黑芥子酶活性的影响取决于所使用的缓冲液。如在图3中看出，柠檬酸盐缓冲液对黑芥子酶的灭活具有更显著的作用。重要地，在PH4.0下使用柠檬酸盐缓冲液，看出所测量的黑芥子酶活性非常低并且几乎不存在。
[0110]由乙酸盐和柠檬酸盐施加的作用之间的差异可能是源于柠檬酸盐与黑芥子酶中的Zn离子形成一种复合物的螯合能力。
[0111]实例4-用于捕获黑芥子酶和糖蛋白的亲和色谱法
[0112]因此可以通过结合至一种适当的亲和色谱基质或树脂(例如附接有伴刀豆球蛋白A的琼脂糖)来分离糖蛋白和黑芥子酶。伴刀豆球蛋白A将a-D-吡喃葡萄糖基-和α-D-批喃甘露糖基-与C-3、C_4以及C-5位的游离羟基结合。这提供了与黑芥子酶糖蛋白的甘露糖苷部分的特异性结合。
[0113]在一个实验室实验中，可以在底部装备有玻璃棉作为过滤器的巴斯德吸管中制备一个柱。将2mL溶胀的伴刀豆球蛋白A琼脂糖材料添加至该柱并且使其沉降。将该柱用0.02M Tris-HCl+0.5M NaCl (pH7.4)平衡。从悬浮在70mL去离子水的20°C溶液中并且使用ultra turrax湿研磨2分钟的IOg研磨的甘蓝型油菜制备黑芥子酶提取物。在4000x g下将该提取物离心5分钟产生上清液，将该上清液施加至该柱。通过使用平衡缓冲液洗脱未结合的化合物。溶解于该平衡缓冲液中的大约IOmL的0.25M甲基-a -D-吡喃甘露糖苷用于从该柱洗脱结合的黑芥子酶。
[0114]这个工序有利于黑芥子酶从芥子油苷底物的快速分离和随后将黑芥子酶回收为不含芥子油苷的一种产品。使用伴刀豆球蛋白A衍生的树脂进行的黑芥子酶的亲和分离因此可以容易地用于在低PH下处理之后将黑芥子酶从芥子油苷分离出来。
【权利要求】
1.一种用于从来自白花菜目的植物的种子制造一种产品的方法，该方法包括以下步骤: -提供具有按重量计约9%或更少的含水量的种子； -破坏这些种子； -将这些破坏的种子与酸水溶液混合以便提供在约1.0至约5.0的范围之内的混合物pH ； -将黑芥子酶从芥子油苷分离以便提供一个含有黑芥子酶的部分和一个不含黑芥子酶的部分；并且 -从该含有黑芥子酶的部分或从该不含黑芥子酶的部分分离出产物； 其中这些破坏的种子和该水性混合物的温度被维持在从约0°C至约65°C的一个值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中这些种子来自十字花科的一种植物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中这些种子是油菜籽的种子或卡诺拉种子，或卷心菜、绿菜花、花椰菜、芜菁、芥菜、萝卜、辣根、水芹、山葵、以及水田芥的种子。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，进一步包括将一个油部分从一个油耗尽的部分分尚的步骤。
5.根据以上权利要求 中任一项所述的方法，进一步包括将含水量降低至按重量计约9%或更少。
6.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中含水量是在按重量计约2%至约9%的范围之内。
7.根据权利要求4或5中任一项所述的方法，其中含水量是通过超临界提取、通过溶剂提取或通过加热而被降低的。
8.根据权利要求6所述的方法，其中含水量是使用二氧化碳(CO2)通过超临界提取而被降低的。
9.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中黑芥子酶和芥子油苷是基于它们的大小而分离的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中黑芥子酶是通过使该水性混合物经受具有约IOOkDa或更低的截留值的超滤而从芥子油苷分离的。
11.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中黑芥子酶是通过使该水性混合物与一种离子交换树脂相接触而从芥子油苷分离的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中黑芥子酶被吸附至一种阳离子交换树脂。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中芥子油苷被吸附至一种阴离子交换树脂。
14.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中黑芥子酶被吸附至一种亲和树脂，优选一种伴刀豆球蛋白A功能化的树脂。
15.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该水性混合物的pH是约1.0至约3.0、优选约2.0至约2.5、更优选约2.2至约2.3。
16.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该酸水溶液包含一种螯合酸。
17.根据权利要求16所述的方法，其中该螯合酸选自柠檬酸、草酸、乳酸、苹果酸、丙二酸(maleonic acid)、酒石酸、或丁二酸或其组合。
18.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中温度在约0°C至约25°C的范围之内。
19.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该方法在一个连续的基础上操作。
20.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中与酸水溶液混合和破坏种子的步骤是同时进行的。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该产品是天然蛋白质。
22.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该产品是一种芥子油苷。
23.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该产品是一种可溶性或不溶性膳食纤维。
24.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该产品是活性黑芥子酶。
25.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该产品是一种抗氧化剂。
26.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该产品是一种可溶性酚类物质。
27.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该产品是一种脂溶性抗氧化剂或维生素。
28.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该产品是一种两亲性脂质，优选一种磷脂或一种糖脂。
29.—种在根据权利要求1至20中任一项所述的方法中可获得的天然蛋白质产品。
30.一种在根据权利要求1至20中任一项所述的方法中可获得的芥子油苷产品。`
31.一种在根据权利要求1至20中任一项所述的方法中可获得的可溶性或不溶性膳食纤维产品。
32.—种在根据权利要求1至20中任一项所述的方法中可获得的黑芥子酶产品。
33.一种在根据权利要求1至20中任一项所述的方法中可获得的抗氧化剂产品。
34.一种在根据权利要求1至20中任一项所述的方法中可获得的脂溶性抗氧化剂产品O
35.一种在根据权利要求1至20中任一项所述的方法中可获得的两亲性脂质产品。
36.一种在根据权利要求1至20中任一项所述的方法中可获得的可溶性酚类产品。
【文档编号】A23K1/18GK103533842SQ201280021235
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年5月3日 优先权日:2011年5月3日
【发明者】凯尔德·埃德鲁普·安德森, 克里斯蒂安·巴格尔, 希尔默·索伦森, 简斯·克里斯蒂安·索伦森 申请人:哥本哈根大学, 拉哈维加德方登格朗中心