产量增加的疫霉抗性马铃薯的开发的制作方法
【专利摘要】本发明涉及具有增加的致病疫霉(Phytophthora?infestans)抗性并且与野生型马铃薯植物相比马铃薯块茎产量相当的转基因马铃薯植物，其中blb1基因和blb2基因被整合到马铃薯植物中的特定遗传背景之中。
【专利说明】产量增加的疫霉抗性马铃薯的开发
[0001]本发明涉及具有增加的致病疫霉(Phytophthora infestans)抗性并且与野生型马铃薯植物相比马铃薯块茎产量相当的转基因马铃薯植物，其中blbl基因和blb2基因在特定的遗传背景下被整合到马铃薯植物中。
[0002]由卵菌致病疫霉引起的晚疫病是全世界马铃薯生产最严重的威胁之一。尽管多年来一直在进行抗性育种，但是防止作物欠收或产量降低的唯一有效的方法是应用预防或治愈致病疫霉感染的杀菌剂。由于晚疫病的疾病发展极快，因此执行严密的杀菌剂方案是必需的，其必须在第一次症状出现之前即开始。此外，致病疫霉似乎对于适应特定的杀菌剂并且发展出抗性具有很高的潜能，如在甲霜灵-杀菌剂的案例中所见(Gisi U7Cohen Y(1996)Resistance to phenylamide fungicides:A case study with Phytophthora infestansinvolving mating type and race structure Annual Rev Phytopathol.34:549-572)。
[0003]在一些西欧国家，就特定杀菌剂的应用而言，关于植物保护产品使用的立法变得更具有约束性，这使得疾病的化学控制以及抗性发展的预防更加困难。
[0004]杀菌剂使用的备选的和/或补充性方法是开发对致病疫霉具有改良抗性的马铃薯栽培品种。
[0005]近年来，通过常规育种开发出含有球栗薯(S.bulbocastanum)衍生抗性的两个马铃薯品种。这两个品种,Toluca和Bionica,都含有赋予针对致病疫霉的全部抗性的单个球栗薯抗性基因。但是从农艺学的角度来看，就产量潜能而言这两个马铃薯品种不符合现代马铃薯品种的标准。
[0006]由于将球栗薯衍生抗性渐渗入至现代马铃薯品种中被证实是困难且耗时的，更为有效的方法是分离球 栗薯中编码疫霉抗性的基因，并且通过生物技术方法将它们转移至现有的马铃薯栽培品种中。
[0007]为了产生持久抗性的马铃薯植物，使Rp1-blbl基因和Rpi_blb2基因在其天然调控元件的控制下组合。所得到的载体构建体包含处于天然Rp1-blbl启动子和Rp1-blbl终止子控制之下的Rp1-blbl基因的基因组序列(这些序列全部衍生自球栗薯)以及处于天然Rp1-blb2启动子和Rp1-blb2终止子控制之下的Rpi_blb2基因的基因组序列(这些序列全部来自球栗薯)(W02008/034876)。所获得的表达blbl蛋白和blb2蛋白的转基因马铃薯针对致病疫霉显示出增加的抗性。然而，发现所开发的马铃薯植物的产量降低。
[0008]本发明的一个目的是提供具有改良的致病疫霉抗性并且与野生型马铃薯产量相当的马铃薯植物。
[0009]通过参考本发明优选实施方式的以下详细描述和本文所包括的实施例，可以更容易地理解本发明。除非另有说明，本文所使用的术语将根据相关领域普通技术人员的常规用法进行理解。除了本文所提供的术语定义之外，分子生物学中常见术语的定义也可以在 Rieger 等人，1991Glossary of genetics !classical and molecular,第 5 版，Berlin:Springer-Verlag 和 Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel 等人编著，Current Protocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,Inc.andJohn Wiley & Sons, Inc., (1998Supplement)中找到。将要理解的是，如在说明书和权利要求中所使用，“一个”可以指一个或多个，取决于其被使用的上下文。因此，例如，“一个细胞”可以是指可以利用至少一个细胞。将要理解的是，本文中所使用的术语仅仅出于描述【具体实施方式】的目的，其并非意在进行限制。
[0010]整个申请中引用了多篇出版物。所有这些出版物以及在那些出版物中所引用的那些参考文献的公开内容在这里作为整体通过引用并入到本申请中，以更完整地描述本发明所属领域的状况。克隆、DNA分离、扩增和纯化的标准技术，涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等酶促反应的标准技术以及多种分离技术是已知的并且本领域技术人员常用的那些 。一些标准技术描述于Sambrook等人，1989Molecular Cloning,第二版，ColdSpring Harbor Laboratory, Plainview, Ν.Y.；Maniatis 等人，1982Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Ν.Y.;Wu(编著)1993Meth.Enzymol.218，Part I ；ffu(Ed.) 1979Meth Enzymo1.68 ；ffu 等人，(编著)1983Meth.Enzymo1.100 和 101 ；Grossman 和 Moldave (编著)1980Meth.Enzymo1.65 ；Miller (编著)1972Experiments inMolecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.；Old 和 Primrose,1981Principles of Gene Manipulation, University of CaliforniaPress, Berkeley ；Schleif和 Wensink,1982Practical Methods in Molecular Biology ；Glover (编著)1985DNA Cloning Vol.1 和 II, IRL Press, Oxford, UK ；Hames 和Higgins (编著)1985Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK 以及 Setlow和 Hollaenderl979Genetic Engineering !Principles and Methods, Vols.1-4, PlenumPress, New York.中。当采用缩写和命名时,则被视为是本领域标准的和专业期刊(例如本文所引用的那些)中常用的。
[0011]本发明的目的通过提供具有blbl基因和blb2基因特异性整合位点的疫霉抗性转基因马铃薯植物或其种子、块茎、植物细胞或组织而解决。
[0012]根据本发明的一个实施方式提供了疫霉抗性的转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组织，优选其包含与SEQ ID NO:1具有至少80%同一性的核苷酸序列(参见图2a)。
[0013]根据本发明的一个实施方式提供了疫霉抗性的转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组织，其包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的核苷酸序列，所述核苷酸序列的侧翼为与SEQ ID NO:20和/或SEQ ID NO:21具有至少80%同一性的侧翼区域(参见图2b、c、e)。
[0014]SEQ ID NO:1是指插入到植物基因组中的重组构建体的一部分，其包含blbl基因、blb2基因和ahas基因，其中SEQ ID NO:1进一步包含植物的侧翼基因组序列(参见图2a)。
[0015]SEQ ID NO:2是指插入到植物基因组中的重组构建体的一部分，其包含blbl基因，blb2基因和ahas基因。优选地，如果将与SEQ ID NO:2具有至少80%同一性的序列插入到植物基因组中，则blbl基因、blb2基因以及任选地ahas基因表达。优选地，如果将与SEQ ID NO:2具有至少80%同一性的序列插入到植物基因组中，则其表达blbl基因、blb2基因和/或ahas基因会表达(参见图2b)。
[0016]SEQ ID NO:3是指插入到植物基因组中的重组构建体的一部分，其包含blbl基因、blb2基因，但无ahas标志基因。优选地，如果将与SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的序列插入到植物基因组中，则blbl基因、blb2基因表达(参见图2c)。
[0017]SEQ ID NO:2和/或3在后文中可称作插入片段。
[0018]SEQ ID NO:20是指具有序列SEQ ID NOs:2或3的插入片段的左侧翼区域。
[0019]SEQ ID NO:21是指具有序列SEQ ID NOs:2或3的插入片段的右侧翼区域。
[0020]术语“侧翼区域”是指位于整合到植物基因组中的插入片段右侧或左侧位点的侧翼的植物基因组区域。
[0021]根据本发明的一个实施方式提供了疫霉抗性转基因马铃薯植物或其种子、块茎、植物细胞或组织，其包含:[0022]a)与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重组构建体，以及进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列:
[0023]b)
[0024]i)能用于利用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于126和136个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0025]ii)能用于利用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于505和515个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0026]iii)能用于利用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于625和635个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0027]iv)能用于利用具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于4752和4762个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0028]和/或进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列:
[0029]ν)能用于利用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于282和292个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0030]vi)能用于利用具有SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于877和887个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0031]vii)能用于利用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于827和837个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0032]viii)能用于利用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于9905和9915个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列。
[0033]本发明的优选实施方式提供了疫霉抗性的转基因马铃薯或其种子、块茎、植物细胞或组织
[0034]a)与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重组构建体，以及进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列:
[0035]b)
[0036]i)能用于利用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增131个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
[0037]ii)能用于利用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增510个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
[0038]iii)能用于利用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增630个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或[0039]iv)能用于利用具有SEQ ID NO:10和SEQ ID NO: 11核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增4757个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
[0040]和/或进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列:
[0041]ν)能用于利用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增287个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
[0042]vi)能用于利用具有SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增882个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
[0043]vii)能用于利用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增832个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
[0044]viii)能用于利用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增9910个碱基对的核苷酸片段的核酸序列。
[0045]可用于利用两条引物进行聚合酶链反应从而扩增特定长度的核苷酸片段的核酸序列是指利用两条引物进行所述聚合酶链反应的产物。特别地，其是指利用两条引物进行聚合酶链反应从而扩增至特定长度的核苷酸片段的核酸序列。
[0046]连接序列包括插入到植物基因组中的重组构建体的右侧或左侧部分，并且部分地包括重组构建体的所述右 侧或左侧部分的侧翼区域的植物基因组序列。特别地，连接序列包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重组构建体的左侧部分以及与SEQ ID NO:20具有至少80%同一性的侧翼区域部分，或者与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重组构建体的右侧部分以及与SEQ ID NO:21具有至少80%同一性的侧翼区域部分。在这种情况下，关于重组构建体部分序列的同一性是指对于所述重组构建体左侧或右侧部分的全长而言的同一性(图2e)。
[0047]特别地，与SEQ ID NO:2或3具有至少80%同一性的重组构建体左侧部分的一部分和与SEQ ID NO:22具有至少80%同一性的连接序列之间，或者与SEQ ID NO:2或3具有至少80%同一性的重组构建体右侧部分的一部分和与SEQ ID NO:23具有至少80%同一性的连接序列之间，至少有部分重叠。在这种情况下，关于重组构建体部分序列的同一性是指对于重组构建体左侧或右侧部分的全长而言的同一性(图2e)。
[0048]PCR是指聚合酶链反应，即利用所述核酸的特异性引物通过采用Taq聚合酶等从核酸的混合物中选择性富集指定长度的核酸(US5, 656，493 ;Sambrook等人，1989,Molecular Cloning,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, Ν.Υ.)。
[0049]备选的实施方式提供了疫霉抗性的转基因马铃薯、种子、块茎、植物细胞或组织，其包含
[0050]a)与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重组构建体，以及进一步包含选自由与SEQ ID N0:22和/或SEQ ID NO:23具有至少80%同一性的序列组成的组中的连接序列。
[0051]可以通过繁殖或使马铃薯植物与由原种事件D的上述植物种子所获得的马铃薯植物杂交并随后使用上面所定义的引物对进行PCR检测来选择携带重组构建体的植物，来获得根据本发明的、包含可进行如上所定义扩增的重组构建体的转基因马铃薯植物、种子、块茎、植物细胞或组织。含有的浆果可以就近手工收获、提取和干燥。种子可以储藏于室温。可用0.04% GA(赤霉素)处理种子，以打破休眠并且促进发芽。[0052]在杂交的一个实施方式中，父本植物的花粉从其雄蕊中转移到母本植物分离的雌蕊中。收获真正含有种子的浆果，并将种子从浆果的外壳和果肉中分离出来。重新种植种子，生长成植株，随后通过使用上面所定义的引物对进行PCR检测从而选择携带重组构建体的植物。
[0053]母本植物和/或父本植物可以是根据本发明的疫霉抗性转基因马铃薯植物。在一个实施方式中，母本植物是根据本发明的疫霉抗性转基因马铃薯植物，父本植物可以是例如选自 Agria、Sarpo Mira、Cara、Valor、Innovator、Diamant 和 Bintje 的非转基因植物。在备选的实施方式中，父本植物是根据本发明的疫霉抗性转基因马铃薯植物，母本植物可以是例如选自 Agria、Sarpo Mira、Cara、Valor、Innovator、Diamant 和 Bintje 的非转基因植物。
[0054]本发明的一个实施方式提供了一种提供疫霉抗性转基因马铃薯植物或其部分的方法，其包括以下步骤:
[0055]a)将与SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%同一性的重组核酸序列导入到马铃薯植物细胞的基因组中，
[0056]b)将所述重组核酸整合到基因组中，
[0057]c)由所述植物细胞再生植物，
[0058]d)选择包含与SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%同一性的核酸序列和如下连接序列的植物，所述连接序列选自与SEQID N0.22和/或SEQ ID N0.23具有至少80%同一性的序列组成的组。
[0059]本发明的一个实施方式提供了一种提供疫霉抗性转基因马铃薯植物或其部分的方法，其包括以下步骤: [0060]a)将与SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%同一性的重组核酸序列导入到马铃薯植物细胞的基因组中，
[0061]b)将所述重组核酸整合到基因组中，
[0062]c)由所述植物细胞再生植物，
[0063]d)选择包含与SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%同一性的核酸序列和选自由以下组成的组中的连接序列的植物:
[0064]i)能用于利用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于126和136个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0065]ii)能用于利用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于505和515个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0066]iii)能用于利用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于625和635个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或
[0067]iv)能用于利用具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于4752和4762个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0068]和/或进一步包含选自由以下组成的组中的连接序列:
[0069]ν)能用于利用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于282和292个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0070]vi)能用于利用具有SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于877和887个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，
[0071]vii)能用于利用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于827和837个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或
[0072]viii)能用于利用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增介于9905和9915个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列。
[0073]本发明的一种方法提供了一种提供疫霉抗性转基因马铃薯植物或其部分的方法，
[0074]其中，在步骤d)中，选择包含与SEQ ID N0.2或SEQ ID N0.3具有至少80%同一性的核酸序列和选自由以下组成的组中的连接序列的植物:
[0075]i)能用于利用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增131个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
[0076]ii)能用于利用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增510个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
[0077]iii)能用于利用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增630个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
[0078]iv)能用于利用具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增4757个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
[0079]和/ 或:
[0080]ν)能用于利用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增287个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
[0081]vi)能用于利用具有SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增882个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，
[0082]vii)能用于利用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增832个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或
[0083]viii)能用于利用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应从而扩增9910个碱基对的核苷酸片段的核酸序列。
[0084]本发明的一个实施方式提供了用于检测特定整合位点，特别是用于检测原种事件D的试剂盒，其包含引物对:
[0085]SEQ IDNO:4 和 5，
[0086]SEQ ID NO:6 和 7，
[0087]SEQ ID NO:8 和 9，
[0088]SEQ ID NO: 10 和 11，
[0089]SEQ ID NO: 12 和 13，
[0090]SEQ ID NO: 14 和 15，
[0091]SEQ ID NO: 16 和 17，和 / 或
[0092]SEQ ID NO: 18 和 19。
[0093]所公开的试剂盒可以用于质量控制(例如种子批次的纯度)、检测植物材料中或者包含或衍生自植物材料的材料(例如炸薯条、马铃薯粉、马铃薯泥等，但不限于食物或饲料产品)中特定整合位置的目的。[0094]简而言之，通过PCR对基因组DNA进行扩增，其中利用特异性识别原种事件D中插入位点5’或3’侧翼序列的引物，特别是上述引物对，例如分别为引物对SEQ ID NO:4和5、SEQ ID NO:6 和 7、SEQ ID NO:8 和 9、SEQ ID NO:10 和 11、SEQ ID NO:12 和 13、SEQ IDNO:14和15、SEQ ID NO:16和17、SEQ ID NO:18和19。如果使用上述引物组合对植物材料进行的PCR分别产生如下片段:
[0095]126 至 136bp (131bp)，
[0096]505 至 515bp (510bp)，
[0097]625 至 536bp (630bp)，
[0098]282 至 292bp (287bp)，
[0099]877 至 887bp (882bp)，
[0100]827 至 837bp(832bp)，
[0101]4752 至 4762bp(4757bp)，
[0102]9905 至 9915bp(9910bp)，
[0103]则确定转基因植物具有本文所定义的特定整合位置，例如所选择的原种事件D。可以通过凝胶电泳使用标记物从而确定片段长度(Sambrook等人，1989Molecular Cloning,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, plainview, N.Y.)。
[0104]本发明的一个实施方式提供了一种检测特定整合位置，优选鉴定原种事件D的方法，其包括如下步骤:
[0105]a)从马铃薯植物中分离DNA作为测试样品，
[0106]b)将测试样品、阳性和阴性样品、如上所定义的引物对暴露于PCR条件之下，以及
[0107]c)评估与所述阳性和阴性对照相比时如下DNA片段的扩增:
[0108]i)当使用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于126和136个碱基对的片段，
[0109]ii)当使用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于505和515个碱基对的片段，
[0110]iii)当使用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于625和635个碱基对的片段，和/或
[0111]iv)当使用具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于4752和4762个碱基对的片段，
[0112]和/或
[0113]ν)当使用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于282和292个碱基对的片段，
[0114]vi)当使用具有SEQ ID N0:14和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于877和292个碱基对的片段，
[0115]vii)当使用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于827和837个碱基对的片段，和/或
[0116]viii)当使用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于9905和9915个碱基对的片段。
[0117]在一个优选实施方式中，在步骤e)中评估是指与所述阳性和阴性对照相比时选自由以下核苷酸片段组成的组中的核苷酸片段的扩增:
[0118]i)当使用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有131个碱基对的片段，
[0119]ii)当使用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有510个碱基对的片段，
[0120]iii)当使用具有SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有630个碱基对的片段，和/或
[0121]iv)当使用具有SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有4757个碱基对的片段，
[0122]和/或选自如下的核苷酸片段的扩增:
[0123]ν)当使用具有SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有287个碱基对的片段，
[0124]vi)当使用具有SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有882个碱基对的片段，
[0125]vii)当使用具有SEQ ID N0:16和SEQ ID NO:17的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有832个碱基对的片段，
[0126]viii)当使用具有SEQ ID N0:18和SEQ ID NO:19的核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有9910个碱基对的片段。
[0127]测试样品包含从转化的植物材料中，例如从植物、其种子、块茎、植物细胞或组织中分离的基因组DNA。阳性样品是包括从包含SEQ ID NO:1的植物中分离出的基因组DNA的样品。阴性样品是包括从用于转化的非转基因原始品种(例如，Fontane品种)中分离出的基因组DNA的样品。
[0128]可以用多种DNA聚合酶运行PCR反应,例如Pfu Ultra、Pfu Turbo或HerculaseDNA 聚合酶(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, US)。用于 Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA聚合酶操作方案的组合物可以如下:1 XPCR缓冲液，每种dNTP各0.2mM，I μ g样品基因组DNA, 50pmol正向引物，50pmol反向引物，Iu Pfu Ultra、Pfu Turbo或Herculase DNA 聚合酶。
[0129]扩增循环可以如下:
[0130]98°C 60秒I个循环，随后以98°C 10秒，下面表格所示退火温度30秒，以及72°C每1000bp产物长度(见下面的表格)60秒进行35个循环，随后72°C 10分钟I个循环，然后 4。。。
[0131]表1
[0132]
【权利要求】
1.包含与SEQID NO:1具有至少80%同一性的核苷酸序列的疫霉抗性转基因马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织。
2.疫霉抗性转基因马铃薯植物、或其种子、块茎、植物细胞或组织，包含: a)与SEQID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重组构建体， b)以及还包含选自以下组中的连接序列: i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于126和136个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列， ?)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于505和515个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列， iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO:8和SEQ ID NO:9的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于625和635个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列,和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:10和SEQ ID NO:11的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于4752和4762个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列， 和/或还包含选自以下组中的连接序列: ν)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于282和292个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列， vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:14和SEQ ID NO: 15的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于877和887个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列， vii)能用于利用具有核苷酸序列`SEQID NO:16和SEQ ID NO:17的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于827和837个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或 viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO:18和SEQ ID NO: 19的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于9905和9915个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列。
3.根据权利要求1的疫霉抗性转基因马铃薯、其种子、块茎、植物细胞或组织，包含 a)与SEQID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重组构建体，以及还包含选自以下组中的连接序列:
b) i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的两条引物进行聚合酶链反应扩增131个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， ?)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的两条引物进行聚合酶链反应扩增510个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO:8和SEQ ID NO:9的两条引物进行聚合酶链反应扩增630个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:10和SEQ ID NO:11的两条引物进行聚合酶链反应扩增4757个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， 和/或还包含选自以下组中的连接序列: ν)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的两条引物进行聚合酶链反应扩增287个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:14和SEQ ID NO: 15的两条引物进行聚合酶链反应扩增882个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，Vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO ：16和SEQ ID NO ：17的两条引物进行聚合酶链反应扩增832个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或 viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:18和SEQ ID NO : 19的两条引物进行聚合酶链反应扩增9910个碱基对的核苷酸片段的核酸序列。
4.提供疫霉抗性转基因马铃薯植物的方法，包括如下步骤： a)将与SEQID NO. 2或SEQ ID NO. 3具有至少80%同一性的重组核酸导入到马铃薯植物细胞的基因组中， b)将所述重组核酸整合进基因组， c)由所述植物细胞再生植物， d)选择包含与SEQID NO. 2或SEQ ID NO. 3具有至少80%同一性的核酸和选自以下组中的连接序列的植物： i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO ：4和SEQ ID NO ：5的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于126和136个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列， ?)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7的两条引物进行聚合酶`链反应扩增介于505和515个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列， iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO :8和SEQ ID NO :9的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于625和635个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列,和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:10和SEQ ID NO :11的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于4752和4762个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列， 和/或还包含选自以下组中的连接序列： ν)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:12和SEQ ID NO :13的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于282和292个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列， vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:14和SEQ ID NO : 15的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于877和887个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列， vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO ：16和SEQ ID NO ：17的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于827和837个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列，和/或 viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO:18和SEQ ID NO : 19的两条引物进行聚合酶链反应扩增介于9905和9915个碱基对之间的核苷酸片段的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的、提供疫霉抗性转基因马铃薯植物的方法，其中在步骤d)中，选择包含与SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3具有至少80%同一性的核酸和选自以下组中的连接序列的植物： i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO ：4和SEQ ID NO ：5的两条引物进行聚合酶链反应扩增131个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， ?)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7的两条引物进行聚合酶链反应扩增510个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO :8和SEQ ID NO :9的两条引物进行聚合酶链反应扩增630个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:10和SEQ ID NO :11的两条引物进行聚合酶链反应扩增4757个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或还包含选自以下组中的连接序列: V)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13的两条引物进行聚合酶链反应扩增287个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:14和SEQ ID NO: 15的两条引物进行聚合酶链反应扩增882个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:16和SEQ ID NO:17的两条引物进行聚合酶链反应扩增832个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或 viii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:18和SEQ ID NO: 19的两条引物进行聚合酶链反应扩增9910个碱基对的核苷酸片段的核酸序列。
6.包含用于检测特定整合位置的引物对的试剂盒，所述引物对选自由如下组成的组中:
SEQ ID NO:4 和 5，`
SEQ ID NO:6 和 7，
SEQ ID NO:8 和 9，
SEQ ID NO:10 和 11，
SEQ ID NO:12 和 13，
SEQ ID NO:14 和 15，
SEQ ID NO:16 和 17，和 / 或
SEQ ID NO:18 和 19。
7.检测特定整合位置的检测方法，包括: a)从马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织中分离核酸序列作为测试样品， b)在PCR条件下将所述测试样品、阳性和阴性样品暴露于选自权利要求6所定义的引物对中至少一组的核苷酸序列，以及评估与所述阳性和阴性对照相比时选自如下组的核苷酸片段的扩增: i)当使用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于126和135个碱基对的核苷酸片段， ?)当使用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于505和515个碱基对的核苷酸片段， iii)当使用具有SEQID NO:8和SEQ ID NO:9核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于625和635个碱基对的核苷酸片段，和/或 iv)当使用具有SEQID N0:10和SEQ ID NO:11核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于4752和4762个碱基对的核苷酸片段， 和/或选自如下组的核苷酸片段的扩增: ν)当使用具有SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于282和292个碱基对的核苷酸片段， vi)当使用具有SEQID N0:14和SEQ ID NO:15核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于877和292个碱基对的核苷酸片段， vii)当使用具有SEQID NO:16和SEQ ID NO:17核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于827和837个碱基对的核苷酸片段，和/或viii)当使用具有SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有介于9905和9915个碱基对的核苷酸片段。
8.根据权利要求7的检测方法，评估与所述阳性和阴性对照相比时选自以下组的核苷酸片段的扩增: i)当使用具有SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有131个碱基对的核苷酸片段， ?)当使用具有SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有510个碱基对的核苷酸片段， iii)当使用具有SEQID NO:8和SEQ ID NO:9核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有630个碱基对的核苷酸片段，和/或 iv)当使用具有SEQID N0:10和SEQ ID NO:11核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有4757个碱基对的核苷酸片段， 和/或评估与所述阳性和阴性对照相比时选自以下组的核苷酸片段的扩增:ν)当使用具有SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有287个碱基对的核苷酸片段， vi)当使用具有SEQID N0:14和SEQ ID NO:15核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有882个碱基对的核苷酸片段， vii)当使用具有SEQID NO:16和SEQ ID NO:17核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有832个碱基对的核苷酸片段，和/或 viii)当使用具有SEQID NO:18和SEQ ID NO:19核苷酸序列的两条引物进行聚合酶链反应时具有9910个碱基对的核苷酸`片段。
9.可被权利要求6的试剂盒或权利要求7或8的检测方法检测的植物、其种子、块茎、植物细胞或组织。
10.稳定整合进马铃薯植物细胞核中的多核苷酸，其包含: a)与SEQID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少80%同一性的重组核酸，以及 b)还包含选自以下组的连接序列: i)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的两条引物进行聚合酶链反应扩增131个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， ?)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的两条引物进行聚合酶链反应扩增510个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， iii)能用于利用具有核苷酸序列SEQID NO:8和SEQ ID NO:9的两条引物进行聚合酶链反应扩增630个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQID N0:10和SEQ ID NO:11的两条引物进行聚合酶链反应扩增4757个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， 和/或 iv)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID NO:12和SEQ ID NO: 13的两条引物进行聚合酶链反应扩增287个碱基对的核苷酸片段的核酸序列， ν)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:14和SEQ ID NO:15的两条引物进行聚合酶链反应扩增882个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，Vi)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:16和SEQ ID NO : 17的两条引物进行聚合酶链反应扩增832个碱基对的核苷酸片段的核酸序列，和/或 vii)能用于利用具有核苷酸序列SEQ ID N0:18和SEQ ID NO : 19的两条引物进行聚合酶链反应扩增13234个碱基对的核苷酸片段的核酸序列。
11.稳定整合进马铃薯植物细胞核中的多核苷酸，其包含与SEQID NO :1具有至少80%同一'丨生的核苷酸序列。
12.权利要求10或11的多核苷酸，其中与SEQID NO ：1具有至少80%同一性的核苷酸序列包含blbl基因和blb2基因。
13.权利要求12的多核苷酸，其中多核苷酸序列还包含SEQID NO :4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18 和 / 或 19 中的一个或多个。
14.包含权利要求10、11、12或13的多核苷酸的疫霉抗性转基因马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织。
15.权利要求1、2或3的疫霉抗性转基因马铃薯植物、其种子、块茎、植物细胞或组织，其中核苷酸序列或重组构建体包含blb`l基因和blb2基因。
【文档编号】A01H5/00GK103842499SQ201280022213
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年5月24日 优先权日:2011年5月24日
【发明者】H·舒尔塞斯, T·伯梅 申请人:巴斯夫植物科学有限公司