专利名称：高盐筛选耐盐碱月季植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种高盐筛选耐盐碱月季植株的方法，具体为利用高盐筛选耐盐碱月季的方法得到在青藏高原种植成活的月季。
背景技术：
月季(Rosachinensis)属蔷薇科，为常绿或落叶灌木，被誉为花中皇后，又称“月月红”，自然花期从5至11月。天津素有“月季之乡”之称，月季栽培历史悠久，1984年天津将月季定为市花以后，月季生产和栽培有了很大的发展，遍及市内街头绿地，意寓着“和平、友谊、繁荣、发展”。而位于青藏高原海拔2900米之高的格尔木市不生长鲜花，不仅这儿的人们生活中没有鲜花，就连盛大的庆典会议上，也没有鲜花，一排排装饰假花随风飘倒，严重地影响了庄严场面，这是由于日照时间长，辐射强度大，高寒缺氧，少雨多风，昼夜 温差大，花卉生长极为困难。位于青藏高原的格尔木市地区地理位置非常重要，她是通往西藏的最后一站，是西藏物资储备的重地，也是全国最大的市，面积为139535.85平方公里，比浙江省还大，格尔木又称为盐湖城，跨含巍嵩神秘的昆仑山。格尔木市因高寒缺氧，少雨多风，昼夜温差大，日照时间长，辐射强度大，没有鲜花。虽然天津地处渤海之滨，土壤也有一定的盐碱化，但是格尔木地区的土壤盐碱度更大，不适宜月季生长。要打破鲜花的生长界限，必须从基因改良、个体基因型筛选入手，因为，盐碱地中植物不能很好生长的原因是植物无法吸收足够的水分来完成生长过程。植物具有的耐盐碱基因，会使植物细胞在一定的逆境胁迫范围内，主动积累一些渗透调节物质如脯氨酸来增强细胞的渗透压，阻止细胞失水，保证植物正常的生长和发育。但是只有极少数耐盐基因型个体才能产生有较强亲水性的渗透调节物质，在组织代谢中使植物细胞免受伤害或减轻伤害。耐盐碱生理反应过程需要多个基因、多个代谢途径共同起作用，即便是同一品种的植物，因个体的发育过程、生长环境以及细微的基因型差异，都会导致植物对长日照、盐碱地和高原现有的地质、气候、环境条件不同的反应。利用细胞工程方法，应激细胞中一系列抗逆代谢途径，激发相关基因的生物功能，使有能力的基因型产生渗透调节物质来增强细胞的渗透压，阻止细胞失水，形成耐盐碱功能，这需要做大量的耐盐碱筛选实验，才能将较高抗逆性的月季基因型选择出来。
发明内容
本发明的目的是提供一种高盐筛选耐盐碱月季植株的方法，具体为利用高盐筛选耐盐碱月季的方法，利用高盐培养基诱导月季自身的抗逆基因表达，不需经过基因工程和植物的组织培养，可在较短时间内获得耐盐碱的植株，从而获得在青藏高原种植成活的月季植株，使格尔木地区生长出月季，对格尔木鲜花生产和盐碱地的绿化有很重要的理论和实践意义，并适用于其它盐碱度大的地区月季的大量扩繁。本发明打破了鲜花的生长界限，从基因改良、个体基因型筛选入手，获得5种耐盐碱月季。
本发明提供的高盐筛选耐盐碱月季植株的方法包括的步骤
O月季外植体栽培基质的配制
蛭石、珍珠岩和营养土以5-10:2:1的质量比例配制基质，并在基质上层压O. 5-1厘米的河沙，用0.2-0.5%高锰酸钾消毒后，再用0.1- 0.3%的生根液对基质进行喷洒。蛭石和珍珠岩主要是起透气，保湿性强的作用，给植物提供一个良好的生长条件；压上河沙主要是固定作用(图1)。2)月季外植体的制备
选取维管束较粗的木质纤维化月季枝条，剪成8-15cm的茎段，每个茎段留2-3片叶子。将月季茎段的形态学下端浸入1-3%的生根液中浸泡0.5-1小时，扦插入配制的基质中，并用稀释10倍的培养基A进行浇灌(培养基A为MS + O. 4mg/L 6-BA + 0.8 mg/L NAA)。培养温度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx。3)月季芽组织的诱导和高盐筛选
扦插两周后，月季外植体开始有新的芽长出，依次用含NaCl的芽组织诱导与生根培养基B (培养基B为MS + lmg/L 6-BA + NaCl)进行筛选
第一 二周，NaCl浓度为6.0%。，培养温度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lxo第三 四周，NaCl浓度为7.0%。，培养温度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx。第五 六周，NaCl浓度为8.0%。，培养温度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx。4)筛选后成活月季的移栽
将成活的月季植株(选取能正常生长的植株)种植于盐碱花盆，正常管理，成活后移栽到盐碱地，盐碱地pH值8. 7-9. O ;总盐量为O. 5% -O. 85%;培养基C用水稀释100倍后进行浇灌(培养基C为MS+0. 4mg/L6-BA+0. 8 mg/L NAA+lmg/L IBA),实施正常的粗放型管理。5)抗性分子的检测
绘制脯氨酸的标准曲线，曲线方程y=27. 015x +1. 7929，R2=O. 9936。分别取筛选的耐盐碱月季和防碱槽中种植的月季，每种月季取五棵植株，每棵植株取叶片各O. 5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml 3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取IOmin (提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取之前的提取液2. 5ml，加冰乙酸2. 5ml，2. 5%酸性茚三酮溶液4ml，置100°C水浴lh，冷却后加4ml甲苯混匀，静置12-16小时。第二天，用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度(A)值。从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量
脯氨酸含量(μ g M-1Fw) =[ X X提取液总量(ml) ]/[样品鲜重(g) X测定时提取液用量(ml)]
公式中X —从标准曲线中查得的脯氨酸含量(μ g)
通常情况下植物体内游离脯氨酸含量很低，在逆境条件下脯氨酸含量可猛增十数倍至数十倍，因此植物体内脯氨酸含量已成为抗逆性的一项生化指标。在盐胁迫下，抗逆月季植株中的游离脯氨酸含量会明显升高。6)运输、栽培与移栽
将批量耐盐碱月季苗(将筛选得到的耐盐碱月季苗组织培养扩繁1000株)按正常条件保温、保湿、避光包装好，直接运输格尔木市区室内大棚栽培，将成活月季移栽到室外，正常管理，成活率高达85%。本发明提供了一种利用高盐筛选耐盐碱月季的方法及其产生的在青藏高原种植成活的月季。利用高盐培养基诱导月季自身的抗逆基因表达，不需经过基因工程和植物的组织培养，可在较短时间内获得耐盐碱的植株，本发明打破了鲜花的生长界限，从基因改良、个体基因型筛选入手，获得5种耐盐碱月季，填补了格尔木没有鲜花的空白。从而获得在青藏高原种植成活的月季植株，使格尔木地区生长出月季，对格尔木鲜花生产和盐碱地的绿化有很重要的理论和实践意义，并适用于其它盐碱度大的地区月季的大量扩繁。
图1为获得的月季外植体。图2为月季的芽诱导与盐碱筛选a为有NaCl筛选，b为无NaCl筛选。图3为筛选的月季种植于盐碱花盆。图4耐盐碱苗到达格尔木进行大棚试种并成功。图5格尔木高原首次生长的耐盐碱月季鲜花植株。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。材料与方法
(O月季材料来自天津大学遗传工程研究所实验基地。(2)实验器材营养钵，紫外分光光度计，广口瓶。(3)基质试剂材料蛭石，珍珠岩，河沙，高锰酸钾，MS基本培养基，氯化钠，蔗糖，6-BA (6 -苄氨基嘌呤)，NAA (萘乙酸)，IBA (吲哚乙酸)。生根粉为陕西普思顿农业有限公司生产的碧能系列生根粉，30g装。(4)利用细胞工程方法，通过盐碱刺激应激细胞中一系列抗逆代谢途径，激发相关基因的生物功能，将较高抗逆性的月季基因型选择出来。
实施例以大花月季为材料，经高盐筛选出适于在盐碱地正常生长的月季，筛选过程如下
(O月季外植体栽培基质的配制
蛭石、珍珠岩和营养土以10 2 1的质量比例配制基质，并在基质上层压I厘米的河沙，用O. 5%的高锰酸钾水溶液消毒后，再用O. 3%的生根液对基质进行喷洒。蛭石和珍珠岩主要是起透气，保湿性强的作用，给植物提供一个良好的生长条件；压上约I厘米的河沙，主要是固定作用。(2)月季外植体的制备
选取维管束较粗的木质纤维化枝条，剪成IOcm左右的茎段，每个茎段留2-3片叶子。将月季茎段的形态学下端浸入3%的生根液中浸泡I小时，扦插入配制的基质中，并用稀释10倍的液体培养基A进行浇灌(液体培养基A为MS+ O. 4mg/L 6-BA+ 0.8 mg/L NAA)。培养温度18 26°C，光照12h/d，光照度2 000 4 OOOLx00
(3)月季芽组织的诱导和高盐筛选
扦插两周后，月季外植体开始有新的芽长出，此时用稀释5-10倍的芽组织诱导与生根培养基B (培养基B为MS + I mg/L 6- BA+NaCl)进行筛选，筛选条件
第一 二周，NaCl浓度为6. 0%。，，成活率13. 5% ;培养温度18 26°C，光照12h/d，光照度 2 000 4 OOOLx ；
第三 四周，NaCl浓度为7. 0%。，成活率9. 2% ;培养温度18 26°C，光照12h/d，光照度 2 000 4 OOOLx ；
第五 六周，NaCl浓度为8. 0%。，成活率2. 8%，培养温度18 26°C，光照12h/d，光照度 2 000 4 OOOLx ；
(4)筛选后成活月季的移栽
将成活的植株移栽到盐碱地，pH值8. 7-9. O,总盐量为7. 5%o -8. 5%。；培养基C用水稀释100倍后进行浇灌(培养基C为MS+0. 4mg/L6-BA+0. 8 mg/L NAA+lmg/L IBA)，实施正常的
粗放型管理。(5)抗性分子的检测
绘制脯氨酸的标准曲线，曲线方程y=27. 015x +1. 7929，R2=O. 9936分别取筛选的耐盐碱月季和防碱槽中种植的月季，每种月季取五棵植株，每棵植株取叶片各O. 5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5ml 3%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取IOmin (提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。吸取脯氨酸提取液2. 5ml，加冰乙酸2. 5ml, 2. 5%酸性茚三酮溶液4ml，置100°C水浴lh，冷却后加4ml甲苯混匀，静置过夜。第二天，用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在520mm波长处测定吸光度(A)值。从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量
脯氨酸含量(μ g · g —1Fw) =[ X X提取液总量(ml)]/ [样品鲜重(g) X测定时提取液用量(ml)]
公式中X —从标准曲线中查得的脯氨酸含量(μ g)。表I抗逆月季叶组织游离脯氨酸含量的测定结果
—I耐盐碱月季I防碱槽种植月季—
OD5200.8790.095
Pro(ug/g fw) 丨55.8509 |ll. 5716
上表表明，在盐胁迫下，抗逆月季整株中的游离脯氨酸含量升高5倍。证明了在通常情况下植物体内游离脯氨酸含量很低，但在逆境条件下脯氨酸含量可猛增数十倍至百倍，因此植物体内脯氨酸含量已成为抗逆性的一项生化指标。(6)运输与栽培
将批量耐盐碱月季苗(组织培养耐盐碱苗)按正常条件保温、保湿、避光包装好，直接运输青藏高原格尔木市地区室内大棚栽培，将成活月季移栽到室外，正常管理，成活率高达85%。耐盐碱苗远途运输是成败的关键，需要保温、保湿、根不能干燥见光并保证植物的新陈代谢最基本条件，携带着1000株细胞工程耐盐碱苗，经北京乘坐火车成功抵达格尔木,耐盐碱苗到达格尔木进行试种并成功，图4为耐盐碱苗到达格尔木进行大棚试种并成功，格尔木高原首次生长了鲜花，图5为格尔木高原首次生长的耐盐碱月季鲜花植株。使天津月季登上了青藏高原，填补了格尔木没有鲜花的空白。
按照本发明的方法获得5种耐盐碱月季，在青藏高原种植成活
第(I)种
形态特征粉色伞房花序，花瓣较多，花心色较淡，花期4月下旬至10月，果实成熟期9-11月。因环境常绿或半常绿直立灌木，第一年可高达O. 5-1米，第二年可高达1. 5- 2米。园林用途月季花色艳丽，按月开放，花期较长，可配植于庭园、花坛中，也可制作花篮、花环、盆景及用作切花等。第(2)种
形态特征红色单生或伞房花序，花瓣较多，花期4月下旬至10月，果实成熟期9-11月。因环境常绿或半常绿直立灌木，第一年可高达O. 5-1米，第二年可高达1. 5- 2米。园林用途月季花色艳丽，按月开放，花期较长，可配植于庭园、花坛中，也可制作花篮、花环、盆景及用作切花等。第(3)种
形态特征红色单生花序，花瓣多，花期4月下旬至10月，果实成熟期9-11月。因环境常绿或半常绿直立灌木，第一年可高达O. 5-1米，第二年可高达1. 5- 2米。园林用途月季花色艳丽，按月开放，花期较长，可配植于庭园、花坛中，也可制作花篮、花环、盆景及用作切花等。第(4)种
形态特征粉色单生花序，花瓣多，花期4月下旬至10月，果实成熟期9-11月。因环境常绿或半常绿直立灌木，第一年可高达O. 5-1米，第二年可高达1. 5- 2米。园林用途月季花色艳丽，按月开放，花期较长，可配植于庭园、花坛中，也可制作花篮、花环、盆景及用作切花等。第(5)种
形态特征水粉-红色-浅紫色伞房花序，花瓣较多，花心色较淡，花期4月下旬至10月，果实成熟期扩11月。因环境常绿或半常绿直立灌木，第一年可高达O. 5-1米，第二年可高达1. 5- 2米。园林用途月季花色艳丽，按月开放，花期较长，可配植于庭园、花坛中，也可制作花篮、花环、盆景及用作切花等。本发明提供了一种利用高盐筛选耐盐碱月季的方法及其产生的在青藏高原种植成活的月季，不需经过基因工程和植物的组织培养，可在较短时间内获得耐盐碱的植株， 用于耐盐碱月季的大量扩繁，对格尔木鲜花生产和盐碱地的绿化有很重要的理论和实践意义。
权利要求
1.高盐筛选耐盐碱月季植株的方法，其特征在于它包括的步骤 1)月季外植体栽培基质的配制 蛭石、珍珠岩和营养土以5-10 2 1的质量比例配制基质，并在基质上层压0. 5-1厘米的河沙，用0. 2- 0. 5%高锰酸钾消毒后，再用0.1- 0. 3%的生根液对基质进行喷洒； 2)月季外植体的制备 选取维管束较粗的木质纤维化月季枝条，剪成8-15cm的茎段，每个茎段留2-3片叶子，将月季茎段的形态学下端浸入1-3%的生根液中浸泡0. 5-1小时，扦插入配制的基质中，并用稀释10倍的液体培养基A进行浇灌，培养两周； 3)月季芽组织的诱导和高盐筛选 扦插两周后，月季外植体开始有新的芽长出，依次用含不同浓度NaCl的芽组织诱导与生根培养基B进行筛选； 第一 二周，NaCl浓度为6.0%。，培养温度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx ； 第三 四周，NaCl浓度为7.0%。，培养温度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx ； 第五 六周，NaCl浓度为8.0%。，培养温度18 26°C，光照12h/d，光照度2000 4000Lx ； 4)筛选后成活月季的移栽 选取正常生长的月季植株种植于盐碱花盆，正常管理，成活后移栽到盐碱地，盐碱地PH值8. 7-9. 0 ;总盐量为0. 5% -0. 85%，并浇灌稀释100倍的培养基C，实施正常的管理； 5)按通用的脯氨酸含量的检测方法，对耐盐碱月季的抗性分子的检测 绘制脯氨酸的标准曲线，曲线方程y=27. 015x +1. 7929，R2=O. 9936 ； 从筛选的耐盐碱月季中提取得到脯氨酸的提取液，测定其中的脯氨酸的含量，从标准曲线上查出样品测定液中脯氨酸的含量，按下公式计算样品中脯氨酸含量 脯氨酸含量(U g g —1Fw) =[ X X提取液总量(ml)]/ [样品鲜重(g) X测定时提取液用量(ml)] 公式中X —从标准曲线中查得的脯氨酸含量(Ug); 6)运输、栽培与移栽 将批量耐盐碱月季苗按正常条件保温、保湿、避光包装好，直接运输格尔木室内大棚栽培，将成活月季移栽到室外，正常管理。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的液体培养基A的配方为MS+0. 4mg/L 6-BA+ 0. 8 mg/L NAA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤2)所述的培养条件培养温度18 26。。，光照 12h/d，光照度 2000 4000Lx。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的培养基B的配方为MS+1mg/L6-BA+NaCl。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的培养基C的配方为MS+0. 4mg/L6-BA+O. 8 mg/L NAA+lmg/L IBA。
全文摘要
本发明涉及一种高盐筛选耐盐碱月季植株的方法，具体为利用高盐筛选耐盐碱月季的方法得到在青藏高原种植成活的月季。步骤包括将获得的月季外植体适用的月季外植体栽培基质，诱导出芽组织后用高盐的培养基进行浇灌筛选，得到耐盐碱的月季。维管束较粗的纤维化枝条切成的10厘米的茎段，栽培基质为蛭石、珍珠岩和营养土以1021的比例，用0.5%高锰酸钾消毒，再用0.3%的生根液对基质进行喷洒；高盐筛选指用含不同浓度的氯化钠液体培养基B稀释液浇灌，选取能正常生长的植株。本发明打破了鲜花的生长界限，从基因改良、个体基因型筛选入手，获得5种耐盐碱月季，填补了格尔木没有鲜花的空白。
文档编号A01G1/00GK103004610SQ201310008730
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者王昱蓉, 季静 申请人:王昱蓉, 季静