专利名称：一种高效溶磷促生菌、由其制备的微生物菌剂及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物菌剂领域，具体地说，涉及一种高效溶磷促生菌、由其制备的微生物菌剂及应用。
背景技术：
(一)溶磷微生物菌剂发展现状 我国90%以上的耕地缺磷，使用磷肥是解决作物增产的主要措施，磷肥日益成为限制我国农业可持续发展的瓶颈。我国是世界化肥消费第一大国，也是磷肥第一消费大国，每年磷肥消费量1100万吨左右。众所周知，我国磷矿资源缺乏，保有储量151.98亿吨，再过20年中高品位磷矿开采殆尽(李志宁，2003a，李志宁，2003b)，不得不依靠购买国外高价磷矿石保障粮食生产。一些研究显示，我国磷肥当季利用率仅为3.22 18% (周晓芬，马民强，1994;张李康，1997;崔正忠等，2001;周广业等，1991;李云等，2002)。磷肥施入土壤后80 90%很快被土壤固定(范丙全等，1998，2004a)，石灰性土壤中有效磷转变成溶解度极低的磷灰石(lschmidt&Nixon, 1944;Murrmann&Peech, 1968),而在酸性土壤中形成磷酸铁和磷酸铝(Ford，1933)。我国自20世纪70年代使用磷肥以来，土壤磷积累显著(林葆，2009 )。土壤磷绝大部分以难溶无机磷形态存在，释放缓慢，作物有效性低。随着辚肥用量增力口，磷肥转化为极难利用的闭蓄态磷(来路等，2003)与高稳定性有机磷(黄庆海等，2003)。解决土壤磷的活化与释放是提高土壤磷和磷肥利用效率的关键。因此，增强土壤磷有效性，提高磷肥增产效益，是我国农业可持续发展的必然之路。溶磷微生物是一类具有活化土壤难溶无机磷能力的有益微生物。应用溶磷微生物活化土壤难溶磷是世界公认的安全、经济和有效的生物措施(Kucey, 1988;Kamble&Mohite, 1996 ；Morales 等，2007 ;El_Gawad 等，2009)，倍受各国科学家和政府高度重视。开展高效溶磷微生物研究与利用，对于挖掘土壤磷资源的利用潜力、提高磷肥利用率、节约磷肥、发挥我国有限磷矿资源的增产作用和农业持续发展意义重大。溶憐真菌(Salih等,1989;王延秋等，1993; Vassileva, 1998; Asea 等,1988 ；Abd-AlIa&Omar, 2001;程淑琴等,2003;Wakelin 等,2007;Morales 等,2007)和溶憐细菌(Rasal,等，2004; Raychaudhuri,等，2003; Orhan,等，2006;)都具有显著增加土壤有效磷、提高作物产量能力，以及节约磷肥的效果(El-Lateef，1998; Suri,等，2006)。同时，溶磷微生物提高磷肥利用率(Tomar等，1994;Tomar等，1996;Kamble&Mohite, 1996;范丙全等，2004a)，具有改善作物品质的能力(Hamed，2003;El-Gawad, 2009)，溶磷微生物对于提高土壤难溶磷和磷肥的生物有效性具有巨大应用潜力。以往研究涉及面非常广，为溶磷微生物应用提供了技术支撑。然而，长期以来没有重视溶磷微生物在大范围、大区域与多种土壤、多种作物的广泛适应性进行研究，使得大量溶磷菌种很大程度上无法找到更适合的应用土壤与作物，难以发挥溶解土壤磷和增强磷肥有效性的最大潜力。严重限制了溶磷菌的使用范围和应用潜力发挥。对整体溶磷微生物资源而言，可能造成了巨大浪费，由此导致各国溶磷微生物菌剂研究和生产进入更大误区。一些国家仍然以单株溶磷菌株生产溶磷微生物菌剂，而在全国范围所有土壤和各种上使用。世界上大型溶磷微生物菌剂公司，如加拿大Philom Bios公司使用单株溶磷拜莱青霉菌(Penicillium bilaii) (Kucey, 1988, 1989)生产微生物菌剂 JumpStart。印度Ruchi Biochemicals公司使用并生产一种溶磷微生物,推荐在全国使用。比利时生产一株溶磷细菌生产菌剂Phosphorene (Ahmed等，1999)。我国主要以巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatarium)生产溶磷微生物菌剂(葛诚，吴薇，1995;范丙全，2007)。其他国家情形大致相似。没有考虑溶磷微生物与地域、土壤类型、作物种类的最佳适配性，溶磷微生物菌剂的使用效果受到严重影响。因此，针对我国土壤磷有效性低、难溶磷积累，磷肥利用率持续下降的现状，并且针对我国缺乏高效广谱溶磷微生物菌种资源、微生物菌剂产业仍然使用适应范围窄、溶磷能力低的老菌种的现状，筛选和培育广泛适用我国各类主要土壤、多种作物的新的溶磷微生物菌株，是开发高效溶磷微生物菌剂的重要前提。(二)土传病害防治菌剂发展现状我国土传病害、连作障碍日趋严重，造成大面积减产，土传病害防治是保障粮食安全的必然途径。土传病害、连作障碍发生严重已经成为我国粮食持续增产的威胁因素。尽管我国对土传病害进行了长期研究，但是土传病害、连作障碍防治技术没有得到有效的解决，尤其是防治土传病害、连作障碍的微生物防治技术依然缺乏。发展多功能微生物菌剂，是解决土传病害、连作障碍防治，确保粮食安全的重大需求。由于人口急剧增长和耕地数量的限制，以及人类对高产出、高收入的追求，连作栽培成为我国农业生产中的常用措施。连作种植出现作物生长发育不良、土传病害频繁加重、产量和品质下降等问题，给我国农业生产造成巨大的经济损失，是农业可持续发展急需解决的重大课题。农业生产正在朝着无公害、有机农业方向发展，微生物制剂及其应用技术对于发展绿色农业、建立有机食品安全工程体系具有重要作用。我国蔬菜、果树、花卉已经发展到4亿亩，其中，蔬菜播种面积2.82亿亩，总产量6.37万吨。保护地蔬菜超过5000多万亩，总产量1.68亿吨，而且有机蔬菜出口基地面积急剧增加；西瓜种植约500-1000万亩，西瓜连作障碍是世界上长期存在的难题，产量和品质下降。研究表明，黄瓜、番茄、西葫芦、甜椒等作物连作3年以上，每年产量降低10%-20%，连作4-5年的作物减产40%甚至一半以上。土传病害、连作障碍对粮食作物发展造成了严重危害，我国大豆种植面积大约有1.45亿亩，由于连年种植、病害频繁且发生面积大，引发作物减产甚至绝收。连作障碍已经成为农业生产发展的瓶颈，研究开发高效防治土传病害、消除连作障碍的微生物菌剂迫在眉睫。利用微生物菌剂可提高作物产量、改善作物品质、防治线虫病害、节约化肥，在提高土壤的持续增产潜力中发挥着重要作用。各国非常重视防治土传病害的微生物菌剂的产品研发，己经商品化的产品如澳大利亚的 K84,放射形农杆菌菌株 K84 (Agrobacteriumra diobacterstrain k84)在 1973年就被大规模生产，用 来防治由根癌病土壤(Agrobacterium tumefaciens)引起的感染(Kerr, A, 1980) ; 1988年Gustafson公司在美国注册生产A13的PGPR产品Kodiak，成为作物促生菌商业化生产的拓疆者，商业化最成功的产品是Agrobacterium radiobacter K84。美国研制的Topshield (哈茨木霉T22)和以色列研制的Trichodex (哈茨木霉T39)均是用于防治真菌病害如灰霉病以及以色列Mycontrol公司开发的商品制剂Trichoderma2000主要用于防治立枯丝核菌、齐整小核菌、疫霉等；盾壳霉也是研究较多的一种生防菌，盾壳霉对核盘菌属及葱白腐小菌核菌引起的多种植物病害均有很强的抑制作用。现在国外已有商品化产品出现，如前苏联开发的商品制剂Coniοthyr iη可以用于防治向日葵的菌核病,德国开发的商品制剂ContansWG可以用于防治莴苣的核盘菌菌核病等。此外还有针对粘帚霉的，由美国研制成功的SoilGard,用于防治粹倒病和根腐等,意大利研制的BiofoxC专用于防治镰刀菌属病害等。我国商品化的木霉菌杀菌剂(生菌消，又名灭菌灵)，主要用于防治各种作物的霜霉病(沈寅初，2000)，我国开发的5406抗生菌为链霉菌属，定名为泾阳链霉菌，对黄萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌、猝倒病菌等多种植物病害具有抗性，并且可促进植物生长(包建中，1998)。江苏省农科院植保所防治水稻病害的拮抗细菌(Bacillus subtilis),大面积示范推广试验证明，拮抗菌在水稻植株上定植能力较强，繁殖较快，纹枯病防效达75% 85%，稻曲病防效63.8% 85.7% (陈志谊，2001)。沈阳农业大学生物农药工程中心利用拮抗木霉和拮抗细菌混合发酵制成粉剂，成功防治了保护地蔬菜和甜瓜的苗期病害，其它报道的细菌杀菌剂还有用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，防治甘蔗黑腐病的枯草芽孢杆菌、突光假单孢杆菌(Pseudomonas radiobacter)防治小麦全蚀病等。微生物菌剂防治土传病害、连作障碍是当前主要发展方向。大棚蔬菜土壤、大豆连作农田、棉花产区农田、西瓜生产基地农田等是我国土传病害、连作障碍最为严重的地区，研制、开发和生产防治主要作物土传病害以及连作障碍，对于我国粮食增产、减少农药使用量、保障农产品品安全作用巨大。广适应性(土壤、作物)的溶磷微生物菌种资源为世界范围内稀缺，且未见有关广适应性的溶磷微生物菌剂的报道。
发明内容
本发明主要针对我国缺磷和磷肥利用率低、土传病害严重、增产潜力下降的农田现状，提供一种新的高效溶磷促生菌以及由其制备的微生物菌剂。本发明还通过上述微生物菌剂在防治作物病害及提高产量中的应用。为了实现本发明目的，本发明提供一种高效溶磷促生菌一菠萝泛菌(Pantoeaananatis)P21，其分离自我国湖南省浏阳磷矿区的土壤中，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2012年2月9日，保藏号CGMCC N0.5749。菠萝泛菌P21菌落形态为:在牛肉膏培养基上菌落为圆形，表面光滑，颜色为黄色，菌落边缘整齐，中心隆起。革兰氏染色为阴性，细胞呈杆状，端圆，周生鞭毛，呈运动性。菠萝泛菌P21的微生物学特性为:不能利用丙二酸，可以利用柠檬酸，发酵葡萄糖不产气；利用阿拉伯糖、甘露醇、肌醇、半乳糖、鼠李糖、山梨醇产酸，不能利用卫矛醇；明胶液化、π引哚、H2S产生试验为阳性反应；脲酶、苯丙氨酸脱氨酶、硝酸盐还原试验为阴性反应。本发明还提供含有菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P21的微生物菌剂。本发明还提供菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P21及其微生物菌剂在防治作物病害中的应用。本发明还提供一种复合微生物菌剂,其有效成分为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P21 和明尼苏达被毛抱(Hirsutella minnesotensis)。优选地,其有效成分为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P21和明尼苏达被毛孢,保藏号 ATCC MYA-31。前述复合微生物菌剂中还含有添加剂、粘结剂和保护剂；其中，所述的添加剂为二氧化硅(200目)、高岭土、钾长石粉(200目)、沸石粉(200目)、稻壳粉、麦壳粉、秸杆粉等中的一种或多种；所述粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖等；所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、动物油、海藻酸钠、壳聚糖等中的一种或多种。前述复合微生物菌剂由如下重量份的组分组成:菠萝泛菌P21菌剂 I份；明尼苏达被毛孢菌剂I份；添加剂6 12份；粘结剂0.05-0.1 份；保护剂0.01-0.1 份。优选地，前述复合微生物菌剂由如下重量份的组分组成:菠萝泛菌P21菌剂I份；明尼苏达被毛孢菌菌剂I份；添加剂8 10份；粘结剂0.05-0.1 份；保护剂0.01-0.1 份。其中，菠萝泛菌P21菌剂中活菌数为2X 108-3X 108cfu/g，明尼苏达被毛孢菌菌剂中活菌数为 1 X IO7-1 X 108cfu/g。本发明还提供前述复合微生物菌剂在防治作物病害中的应用，所述作物病害为线虫病、根腐病、枯萎病，疫病、立枯病、猝倒病、纹枯病、白絹病和/或白粉病。本发明还提供前述复合微生物菌剂在提高作物产量中的应用，其是将所述复合微生物菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥混合施用。所述作物优选为水稻、大豆、玉米、小麦、棉花、油菜等。本发明还提供前述复合微生物菌剂在活化土壤难溶磷以及降低化肥用量中的应用。适宜的土壤为黑土、黑钙土、沙姜黑土、白浆土、褐土、潮土、盐潮土、红壤、水稻土、灰钙土、灰漠土等。此外，本发明还提供了上述复合微生物菌剂的不同造粒类型，以满足菌剂与不同作物种子播种的应用，包括与大豆、玉米、小麦等机械化播种匹配的颗粒菌剂。本发明还提供上述复合微生物菌剂与尿素、二铵、红色钾肥、复合肥料等颗粒肥料在机械化施肥中的应用。本发明的菠萝泛菌P21，是一株高效溶磷促生菌，在使用化肥的土壤条件下，它对我国主要土壤和主要作物都表现出显著的增产作用，一般增产10 20%，甚至达到50%以上。以黑土增产最为显著。适用于大豆、蔬菜、玉米、小麦、棉花、油菜、水稻等主要作物。本发明的溶磷复合微生物菌剂中明尼苏达被毛孢(Hirsutella minnesotensis)MYA-31防治作物线虫病害效果显著。本发明以我国主要土壤为研究对象，进行了广谱高效溶磷微生物菌种的筛选，获得了大量溶磷菌株，经过研究比较这些溶磷菌株与我国主要土壤、主要作物的适应性、溶磷能力及增产效果，获得了一株广泛适用于我国主要土壤类型、主要作物的高效溶磷的菠萝泛菌P21菌剂，特别适合我国南方、北方、西北、东北、西南等地区的典型土壤，为溶磷微生物在土壤磷转化、磷肥高效利用和节约磷肥资源等方面提供了菌种资源和技术支撑。本发明将广泛适应性的高效溶磷细菌菠萝泛菌P21与高效防治线虫病害的真菌有机地结合起来，通过施用本发明的复合菌剂，在高效利用土壤磷素、提高磷肥利用率的同时，充分发挥微生物防治线虫病害的作用，达到了溶磷增产、防病增产的效果，对我国粮食持续增产、节约磷肥资源、减少线虫病害和保护农田生态环境具有重要意义，特别对于东北大豆产区孢囊线虫以及全国蔬菜产区的线虫防治，具有巨大的应用价值。本发明的复合微生物菌剂具有高效溶解难溶磷、防治线虫病害和促进作物增产的作用，是一种可有效降低化肥用量、节约化肥资源、防治线虫病害、提高作物产量的复合微生物菌剂，其有益效果为:(一)溶解难溶磷、促进作物生长效果显著；(二)防治作物线虫病害； (三)该菌剂溶磷效果不受化学肥料影响，使用化肥条件下作物持续增产；(四)使用地域范围广，适用于我国黑土、黑钙土、沙姜黑土、白浆土、褐土、潮土、盐潮土、红壤、水稻土、灰钙土、灰漠土等；(五)适合提高玉米、大豆、小麦、水稻、棉花、油菜和蔬菜等主要作物的产量；(六)使用简便，颗粒菌剂可以与大豆、玉米、棉花、小麦播种机一起使用，也可以与多元复合肥、尿素、磷酸二铵、红色钾肥等颗粒肥一起机械施用。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1菠萝泛菌P21菌株的分离、培养以及溶磷菌剂P21的制备菠萝泛菌P21分离自我国云南昆阳(Kunyang RP)磷矿区的土壤中，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期2012年2月9日，保藏号CGMCC N0.5749。溶磷促生菠萝泛菌P21的培养及溶磷菌剂P21的制备:(I)菠萝泛菌P21的培养基发酵液配方(kg/t发酵液):磷酸氢二钾0.1，磷酸二氢钾0.1，氯化钠4.3，硫酸镁0.1，淀粉8.6，牛肉膏4.3，蛋白胨4.3，酵母粉4.3，蔗糖8.6，硫酸铵2.6，碳酸钙10，硫酸亚铁0.001，豆油6.8，以水配制。(2)培养过程 将菠萝泛菌P21菌株接种于牛肉汁蛋白胨培养基上，28 30 V培养48h，然后接入IOOOmL三角瓶，在30°C，220r/min下，培养36h。按5v/v%接种量接入到50L种子罐中，在220r/min, pH7.5，通气量0.5vvm下，培养2d后，再按10v/v%接种量装入到500L的发酵罐中，在200r/min，pH7.5，通气量0.7vvm下，培养3d。发酵完成后，以1:3 6倍的高岭土吸附，即得溶磷菌剂P21。
实施例2高效溶磷抗病增产复合微生物菌剂的制备1.明尼苏达被毛孢MYA-31菌的培养( 1)培养基的组成(kg/t发酵液)可溶性淀粉IOkg,黄豆饼粉IOkg,玉米粉5kg,葡萄糖Ikg,鹿糖IOkg,酵母粉5kg,(NH4) 2S043kg, K2HPO40.2kg, NaC12.5kg, MgSO4.7H200.lkg, CaCO30.5kg, FeSO40.001kg，硼酸(1%) 1L，pH7.0，以水配制。(2)发酵培养过程将明尼苏达被毛孢MYA-31接种于土豆蔗糖(PDA)培养基上，25 28°C培养3d。将明尼苏达被毛孢菌的孢子接入IOOOmL三角瓶，26 28°C，220r/min下液体培养36h。然后按lv/v%接种量接入到50L种子罐中，在200r/min，pH7.0，通气量0.7vvm下，培养36h后，再按10v/v%接种量装入到500L的发酵罐中，在220r/min，pH7.0，通气量0.7 1.0vvm下，培养3d。发酵完成后加入保护剂海藻酸钠，以1:3 6倍的二氧化硅吸附。2.高效溶磷防病增产复合微生物菌剂的制备向菠萝泛菌P21、明尼苏达被毛孢MYA-31中分别加入保护剂海藻酸钠。菠萝泛菌P21以高岭土吸附，活菌数2X IO8 3X108cfu/g。明尼苏达被毛孢MYA-31以二氧化硅吸附，该真菌的活菌数为1\107 1父108(^11/^。然后，按照菠萝泛菌P21、明尼苏达被毛孢菌MYA-31菌剂的体积比1:1混合均匀。3.高效溶磷防病增产复合微生物菌剂造粒向以上吸附、混合好的菌体中加入适量稻壳粉、秸杆粉和膨润土粘结造粒，根据生产需要形成不同的颗粒粒径菌剂，用于与大豆、玉米、棉花种子一起机械播种施入土壤，或者与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥等颗粒肥料一起机械施入土壤。实施例3菠萝泛菌P21培养皿条件下溶磷效果1.从我国云昆阳磷矿区植物根际土壤样品中，分离筛选了溶磷菠萝泛菌P21，同时，从其他地区土壤样品分离筛选了溶磷菌株P40和P40-2。在室内固体培养皿培养、液体培养基培养条件下，测定了它们的溶磷能力。溶磷菌株P21溶磷圈与菌落直径比值达到了 5.43，溶磷圈内溶解的水溶性溶(P2O5)为4.25mg ;菌株P40和P40-2的溶磷圈与与菌落直径比值分别为4.00和1.56，溶磷圈内的溶磷量(P2O5)分别为3.13和1.22mg，菌株P40和P40-2的溶磷量都低于菌株P21(表 1)。表1溶磷菌株在含Ca3(PCM)2培养基上的溶磷圈与菌落的直径比值(d/D)
权利要求
1.菠萝泛菌(Pantoeaananatis)P21,保藏号 CGMCC N0.5749。
2.含有权利要求1所述菠萝泛菌P21的微生物菌剂。
3.权利要求1所述菠萝泛菌P21及权利要求2所述微生物菌剂在防治作物病害中的应用。
4.一种复合微生物菌剂，其有效成分为菠萝泛菌P21和明尼苏达被毛孢(Hirsutellaminnesotensis)。
5.根据权利要求4所述的复合微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌剂中还含有添加剂、粘结剂和保护剂； 其中，所述的添加剂为二氧化硅、高岭土、稻壳粉、麦壳粉、秸杆粉中的一种或多种； 所述粘结剂为膨润土或水溶性微生物多糖； 所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的复合微生物菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成: 菠萝泛菌P21菌剂 I份； 明尼苏达被毛孢菌剂I份； 添加剂6-12份； 粘结剂0.05-0.1份；` 保护剂0.01-0.1份； 其中，菠萝泛菌P21菌剂中活菌数为2X 108-3X 108cfu/g，明尼苏达被毛孢菌菌剂中活菌数为 lX107-lX108cfu/go
7.根据权利要求6所述的复合微生物菌剂，其特征在于，由如下重量份的组分组成: 菠萝泛菌P21菌剂 I份； 明尼苏达被毛孢菌剂I份； 添加剂8-10份； 粘结剂0.05-0.1份； 保护剂0.01-0.1份。
8.权利要求4-7任一项所述的复合微生物菌剂在防治作物病害中的应用，所述作物病害为线虫病、枯萎病和/或白粉病。
9.权利要求4-7任一项所述的复合微生物菌剂在提高作物产量中的应用，其是将所述复合微生物菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥混合施用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述作物为水稻、大豆、玉米、小麦、棉花、油菜。
全文摘要
本发明提供了一种高效溶磷促生菌及由其制备的微生物菌剂，该微生物菌剂的有效成分为菠萝泛菌(Pantoea ananatis)P21和明尼苏达被毛孢菌(Hirsutella minnesotensis)。本发明将广泛适应性的高效溶磷细菌菠萝泛菌P21与高效防治线虫病害的真菌有机地结合起来，通过施用本发明的复合菌剂，在高效利用土壤磷素、提高磷肥利用率的同时，充分发挥微生物防治线虫病害的作用，达到了溶磷增产、防病增产的效果，对我国粮食持续增产、节约磷肥资源、减少线虫病害和保护农田生态环境具有重要意义。
文档编号C05G3/00GK103103150SQ20131001643
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月16日 优先权日2012年2月10日
发明者范丙全 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所