利用柠檬酸废水生产解淀粉芽孢杆菌生防菌剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用柠檬酸废水低成本生产防治植物病害、促进植物生长的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus?amyloliquefaciens）生防菌剂的方法，属于微生物农药和微生物肥料【技术领域】。本发明是采用生物质热电厂的富含碳酸钾的草木灰作为柠檬酸废水的预处理添加剂，在通过好氧培养，大规模获得解淀粉芽孢杆菌发酵液，再以生物碳为载体制备具有防治植物病害、促进植物生长的菌剂，该工艺生产成本低廉，操作简单，还可以使柠檬酸废水得到资源化利用，减少污染排放。本发明生产的菌剂用于蔬菜的生产，不仅可以提高产量，而且可以改善蔬菜的品质，显示出广阔的应用前景。
【专利说明】利用柠檬酸废水生产解淀粉芽孢杆菌生防菌剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株拮抗植物病原菌、促进植物生长的解淀粉芽孢杆菌农用微生物菌剂的低成本生产方法，属于农用微生物菌剂和废水资源化【技术领域】。
【背景技术】
[0002]柠檬酸作为一种重要的化工原料和食品添加剂被广泛应用于食品、医药、化工等行业。目前，中国有柠檬酸生产厂近百家，总年产能力约80万吨，是全球最大的柠檬酸生产国和出口国，出口量在全球柠檬酸贸易总量中的比重超过60%。柠檬酸的生产是以薯干或玉米为原料，依次经原料处理、发酵、提取、精制等工序制得产品。柠檬酸废水主要来自发酵和提取工序产生的中和液、洗糖水、洗罐水和洗滤布水。废水中主要含有淀粉、蛋白质、碳水化合物、各种有机酸、氨氮和脂肪等，COD浓度为20000~30000 mg/L，属于高浓度有机废水。据统计，每生产I吨柠檬酸，产生高浓度废水7.5~15吨。直接排放会对环境将造成严重污染，处理达标排放费用高昂。
[0003]解淀粉芽孢杆菌(feci77w5.amyloli quefaci ens )以其具备产淀粉酶的潜力而得名。解淀粉芽孢杆菌在自然界中分布广泛，是一种重要的生防菌，它通过产生抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物质来抑制植物病原细菌、真菌、病毒、线虫，从而起到生物防治的作用；同时它也是一类重要的植物根际促生细菌，表现出对多种植物促进生长的作用。例如，Idriss等报道解淀粉芽孢杆菌FZB45菌株具有肌醇六磷酸酶(phytase)活性，可以在缺磷的条件下刺激植物生长( Microbiology, 2002, 148: 2097-2109)。申莉莉等报道解淀粉芽孢杆菌Ba33菌株可以促进烟草生产并且抑制烟草花叶病毒的增殖(吉林农业大学学报，2010，32:383~386)。李超等还报道了一株具有溶藻作用的解淀粉芽孢杆菌菌株DCl (环境科学学报，31: 1602-1608)。
[0004]中国发明专利(申请号:201010518034.1)中公开了一株解淀粉芽孢杆菌Lx-1l菌株，保藏编号为CGMCC N0.3789，对水稻细菌性条斑病有良好的防治效果，培养该菌株采用的培养基为:大豆粉1%，豆饼粉2%，淀粉0.5%，酵母膏0.2%，玉米浆0.22%，氯化钠0.1%，碳酸氢钙0.18%。中国发明专利(申请号:200810231406.5)中公开了一株解淀粉芽孢杆菌YN-1菌株，保藏编号为CGMCC N0.2328，能有效防治苹果褐斑病、小麦纹枯病等真菌病害，并筛选出了成本低廉的工业用培养基，组成包括:葡萄糖8~12g/L，玉米粉l(Tl6g/L，黄豆饼粉l(Tl6g/L。中国发明专利(申请号:200910070709.8)中公开了一株解淀粉芽孢杆菌HN菌株，保藏编号为CGMCC N0.3261，能使养殖水体中的硝态氮、亚硝态氮、COD等含量明显降低，该菌株的培养采用肉汤培养基。中国发明专利(申请号:201010264520.5)中公开了一株植物内生解淀粉芽孢杆菌TF28菌株，保藏编号为CGMCC N0.4038，它能在植物体内定殖、繁殖和传导，可产生抗菌蛋白和脂肽类抗生素两种抗菌物质，具有防病促生作用，其液体培养基每1000mL由IOg胰蛋白胨、5g酵母浸粉、IOg NaCl配制而成。中国发明专利(申请号:200910273498.8)中公开了一株解淀粉芽孢杆菌EA19菌株，保藏编号为CCTCC M209316，对小麦根腐病菌、小麦根腐叶枯病菌、小麦全蚀病菌、小麦白絹病菌和小麦纹枯病菌均具有明显的抑菌活性，其发酵培养基组成:葡萄糖20克，牛肉膏8克，L-谷氨酸钠5克，MgSO4 0.5克，KCl 0.5 克，KH2PO4 I 克，FeSO4.6H20 0.15 毫克，MnSO4.H2O 5 毫克，CuSO4.5H20 0.16毫克，水1000毫升。中国发明专利(申请号:201110095116.4)中公开了一株解淀粉芽孢杆菌B-004菌株，保藏编号为CGMCC N0.4557，它对番茄采后早疫病菌具有明显拮抗效果，其培养基中，碳源可为可溶性淀粉、藕粉、葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖等，氮源可为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NH4NO3^ NH4Cl, (NH4)2SO4等，其他营养源可为含钾、铁、锌、钠、锰、镁及钙之类的金属盐等。
[0005]综上所述，具有拮抗植物病害的解淀粉芽孢杆菌的菌株较多，其培养方法也各不相同，但是，未见采用柠檬酸废水培养解淀粉芽孢杆菌并生产生防菌剂的报道。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种能够资源化利用柠檬酸废水生产高效拮抗植物病原菌、促进植物生长的解淀粉芽孢杆菌农用生防菌剂的方法。
[0008]本发明所使用的菌株是由发明人从水草根际土壤中分离筛选出来的一株高效促进植物生长、拮抗植物病原菌的解淀粉芽孢杆菌{Bacillus amyloli quefaci ens ) A3菌株，该菌株于2012年10月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC N0.6676，保藏单位地址:北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编:100101o
[0009]本发明所述的解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂的生产方法如下:
1、柠檬酸废水预处理:用生物质热电厂的富含碳酸钾的草木灰调节废水的PH到7.0~8.0，于110~121°C灭菌10~30分钟。
[0010]2、液体种子制备:向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的解淀粉芽孢杆菌，于25~37°C，120~200转/分振荡培养24~36小时，得到液体种子。
[0011]3、液态发酵:向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种体积比为2%~15%的液体种子，于25~37°C，通无菌空气培养15~36小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到1.5 X IO9 CFU/毫升以上，所得发酵液可以作为液体菌剂直接使用。
[0012]4、固体菌剂制备:以过30目筛的生物碳(生物质热解后剩余的固体物质，主要成分是碳)为载体，按照发酵液:生物碳为1: 1.5~1: 5的重量比，将发酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，通风干燥至菌剂含水量30%以下，包装，存放在阴凉干燥处,备用。
[0013]本发明所述的解淀粉芽孢杆菌生防菌剂的使用方法如下:
1、将发酵液或固体菌剂用灌溉用水稀释到活菌数为2XIO6 CFU/毫升~5X IO7 CFU/毫升，混合均匀，按照每亩I~3立方米稀释液的用量沟施入作物根部附近的土壤中；
2、将发酵液或固体菌剂加入有机肥中，混合均匀，使有机肥中的解淀粉芽孢杆菌活菌数为2 X IO6 CFU/克~IXlO8 CFU/克，按照每亩I~3吨的用量作为基肥施入土壤中。
[0014]【具体实施方式】[0015]由本发明提供的解淀粉芽孢杆菌生防菌剂能有效防治多种土传植物病害，并能够促进作物对养分的吸收和利用，还能提供一定量的钾肥；本发明提供的技术方案生产的农用微生物菌剂应用于农业生产可以减少化肥和农药的使用量，从而改善农田环境质量；而且生产成本很低，使高浓度废水得到资源化利用，减少污染物排放。【具体实施方式】如下:
实施例1:柠檬酸废水生产解淀粉芽孢杆菌生防菌剂
柠檬酸废水预处理:用生物质热电厂的富含碳酸钾的草木灰调节废水的PH到7.5左右，于115°C灭菌15分钟。
[0016]液体种子制备:向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的解淀粉芽孢杆菌，于35°C，150转/分振荡培养28小时，得到液体种子。
[0017]3、液态发酵:向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种体积比为10%的液体种子，于35°C，通无菌空气培养18小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到
1.5 X IO9 CFU/毫升以上，所得发酵液可以作为液体菌剂直接使用。
[0018]4、固体菌剂制备:以过30目筛的生物碳(生物质热解后剩余的固体物质，主要成分是碳)为载体，按照发酵液:生物碳为1: 2的重量比，将发酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，通风干燥至菌剂含水量30%以下，包装，存放在阴凉干燥处，备用。
[0019]实施例2:解淀粉芽孢杆菌微生物菌剂用于防止黄瓜猝倒病
黄瓜猝倒病是由真菌 侵染引起的病害。采集多年种植黄瓜的温室大棚中的土壤，接种瓜果腐霉菌iPythium aphani derma turn ),混合均匀,装入花盆中，设置2组花盆,每组10盆，至于15°C~20°C的温室中，保持较高湿度和较低的光照强度。第I组花盆直接播种黄瓜种子，每盆15粒，作为对照。第2组播种黄瓜种子前向土壤中拌入重量比为0.3%的解淀粉芽孢杆菌生防菌剂，然后每盆播种15粒种子。幼苗出土后统计总数，幼苗长出I片真叶后，2片真叶前统计倒伏苗总数。结果表明，对照幼苗倒伏率超过65%，而添加菌剂的实验组，幼苗倒伏率低于10%。
【权利要求】
1.一种利用柠檬酸废水生产高效拮抗植物病原菌、促进植物生长的解淀粉芽孢杆菌{Bacillus amyloliquefaciens)生防菌剂的方法,其特征在于:生产解淀粉芽孢杆菌生防菌剂包括如下步骤: (O柠檬酸废水预处理:用生物质热电厂的富含碳酸钾的草木灰调节废水的PH到7.0~8.0，于110~121°C灭菌10~30分钟； (2)液体种子制备:向装有预处理好的柠檬酸废水的三角瓶中接种斜面保藏的解淀粉芽孢杆菌，于25~37°C，120~200转/分振荡培养24~36小时，得到液体种子； (3)液态发酵:向装有预处理好的柠檬酸废水发酵罐中接种体积比为2%~15%的液体种子，于25~37°C，通无菌空气培养15~36小时；培养好的发酵液经平板细菌计数，活菌数达到1.5X IO9 CFU/毫升以上，所得发酵液可以作为液体菌剂直接使用； (4)固体菌剂制备:以过30目筛的生物碳(生物质热解后剩余的固体物质，主要成分是碳)为载体，按照发酵液:生物碳为1: 1.5~1: 5的重量比，将发酵液添加到生物碳中，充分混合均匀，得到固态菌剂，通风干燥至菌剂含水量30%以下，包装，存放在阴凉干燥处。
2.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌生防菌剂的使用方法，其特征在于，使用方法包括以下步骤: (I)将发酵液或固体菌剂用灌溉用水稀释到活菌数为2X IO6 CFU/毫升~5X IO7 CFU/毫升，混合均匀，按照每亩 I~3立方米稀释液的用量沟施入作物根部附近的土壤中； (2 )将发酵液或固体菌剂加入有机肥中，混合均匀，使有机肥中的解淀粉芽孢杆菌活菌数为2 X IO6 CFU/克~I X IO8 CFU/克，按照每亩I~3吨的用量作为基肥施入土壤中。
【文档编号】A01P21/00GK103931660SQ201310017340
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2013年1月17日 优先权日:2013年1月17日
【发明者】王栋, 关晓欢, 马双龙, 焦海华, 姜华, 白志辉 申请人:无锡中科活力生物技术有限公司, 中国科学院生态环境研究中心