专利名称：一种4-h-苦皮藤素原药及其制备方法和质量检测方法
技术领域：
本发明属于植物源农药技术领域，具体地，涉及了一种4-H-苦皮藤素原药及其水乳剂，以及它们的制备方法和质量检测方法。
背景技术：
苦皮藤(Celastrusangulatus MaXim)系卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属(Celastrus)多年生藤状灌木植物，分布在河北、山东、河南、陕西、湖北、甘肃、江苏、安徽等省[中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志.科学出版社，1999，45 (3): 102]。苦皮藤是我国特有的杀虫植物，它具有多种功效，对不同的害虫有不同的生理活性，性能稳定、使用安全、不杀伤天敌、无污染。目前，苦皮藤相关产品绝大多数采用根/皮[CN92113104.6 ；CN94103655.3 ；CN99109275.9 ；CN02122988.0]，由于挖根制药，资源开发的规模受到一定限制。研究发现，苦皮藤种子油对黄守瓜、菜青虫、28星瓢虫、缀叶丛螟、斜纹夜蛾、丝绵木金星、黄杨絹野螟等多种害虫显示出良好的拒食作用；对贮粮害虫赤拟谷盗有较强的忌避作用；对玉米象有明显致死和杀卵作用。种子油生物急性毒性很小，进入机体易被排体夕卜。利用苦皮藤种子取代挖根制造农药，有利于植物资源的生态保护，减少水土流失，还可增加农民收入；以种子为原料生产的植物源农药在城乡推广应用，生产无公害食品或绿色食品，具有现实意义[柯治国，等.杀虫植物——苦皮藤种子的研究.第三届湖北湖南植保农药学术研讨会论文集，2004,94-300]。目前文献报道的苦皮藤种子的提取方法均为溶剂回流法，纯化方法大多为甲醇/乙醇萃取法。大孔吸附树脂(macroporous absorption resin)是近40余年来发展起来的一类有机高聚物吸附剂，利用其多孔结构和选择性吸附功能可从中药提取液中分离精制有效成分或有效部位，最大限度地去粗取精，并可实现大规模工业化。目前大孔吸附树脂在植物源农药领域已有应用，但应用于苦皮藤种子相关产品的工业化生产和提取物的分离均未见报道。苦皮藤种子的品质不在于某个单一成分，其效果是多个成分协同配比的结果。研究证明苦皮藤中主要杀虫活性成分是以4-H-P-二氢沉香呋喃倍半萜骨架的多元醇酯化合物及其生物碱，统称4-H-苦皮藤素。苦皮藤素化学成分非常复杂，含有以苦皮藤种素C (Angulateoid C)为主的多种杀虫成分，但目前苦皮藤种子提取物及其产品中4_H_苦皮藤素组分的检测方法尚未建立。而针对单一成分进行定量分析的质量控制模式不能有效控制苦皮藤种子相关产品的内在质量，无法满足当前对于客观有效地评价和控制4-H-苦皮藤素产品质量的迫切要求。指纹图谱技术己成为国际公认的区别评价植物天然产物及其原料的最有效的手段[罗国安，等.中药指纹图谱的分类和发展.中国新药杂志，2002, 11(1):46.]0目前关于苦皮藤种子相关产品的指纹图谱技术未见报道。IGD核磁共振碳谱偶联(I⑶13C NMR coupling)指纹图谱技术，也叫反门控去偶核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术，是在已研究多年的核磁共振氢谱(1H NMR)指纹图谱技术[赵天增，等.1HNMR指纹法鉴定植物中药.中草药，2000，31 (11):868-870.]的基础上联合其他技术(例如目前应用最广泛的高效液相(HPLC)指纹图谱技木)提出的ー种新的非单一手段综合指纹图谱技木。因此，若能开发出新的4-H-苦皮藤素产品，即原药及其制剂，并对它们的IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术进行研究与应用，不仅可以解决其中活性成分的定性问题，也为加强其内在成分研究的系统化与标准化，加快植物源农药4-H-苦皮藤素现代化的发展，实现与国际接轨提供了科学的保证。随着该技术在其他中药材及其提取物、植物源农药中的推广应用，该技术的重大科学价值必将日趋突出。
发明内容
为了解决植物源农药现有技术、质量等方面存在的问题，本发明的目的在于，提供一种优良的植物源农药4-H-苦皮藤素原药及其水乳剤。本发明的另ー目的在干，提供一种所述4-H-苦皮藤素原药及其水乳剂的制备方法。本发明的又一目的在干，提供一种所述4-H-苦皮藤素原药及其水乳剂的质量检测方法。为了实现上述目的，本发明提供的ー种4-H-苦皮藤素原药，其中含有以下质量百分含量的活性成分:苦皮藤种素CXAngulateoid C)15.(Tl8.0%,苦皮藤种素B(AngulateoidB) 4.0 12.0%,苦皮藤种素 E (Angulateoid E) 13.0 21.0%,苦皮种素 I (AngulatinoidI) 4.5 8.0%,苦皮种素 V (Angulatinoid V) 4.5 7.0%,苦皮种素 II (Angulatinoid II)3.0 5.0%,青江藤素 B (Celahin B) 2.0 6.0%,青江藤素 C (Celahin C) 2.0 6.0%。本发明4-H-苦皮藤素原药中的所述活性成分均为4-H-0 - ニ氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。本发明所述4-H-苦皮藤素原药中各活性成分(4-H- ^ - ニ氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物)总的质量百分含量不小于48%，优选不小于55%。进ー步地，苦皮藤原药中各活性成分总的质量百分含量为65.(T75.0%。本发明提供的4-H-苦皮藤素原药为固体状。本发明提供的4-H-苦皮藤素原药的制备方法包括:称取苦皮藤种子，粉碎，加入体积为2飞倍量、石油醚或90、5%的こ醇于6(T80°C下回流或超声提取2 3次，每次提取f 2小时，过滤后合并滤液，减压浓縮；取浓缩后的种子油，用其重量为f 2倍量的大孔吸附树脂装柱，先后以30 40%こ醇、55 65%こ醇、80 85%こ醇和90 95%こ醇冲柱，收集55飞5%こ醇洗脱液，减压蒸干，即得4-H-苦皮藤素原药。这里表示こ醇浓度的百分数均为质量比。进ー步地，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20、SP825、AB_8、D-1OU D-201或SP-70，优选 HP-20，D-101，SP825。
进ー步地，所述大孔吸附树脂的径高比为8: f 15:1，优选1(T12:1。进ー步地，苦皮藤种子粉碎后过1(T24目筛。进ー步地，用于冲柱的こ醇的体积为浓缩后滤液的2(T90倍，优选四次冲柱的体积分别为30 40，80 90，30 40，20 30倍。
苦皮藤种子中的活性成分，除了本发明4-H-苦皮藤素原药所述的成分外，还包括其他4-H-3 - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物，以及黄酮、氨基酸、三萜、脂肪酸等其他类别的成分。本发明提供的苦皮藤原药，可以制成水乳剂、水悬浮剂、可湿性粉剂等各种剂型用于植物源农药杀虫剂。本发明提供的一种4-H-苦皮藤素水乳剂，包含所述4-H-苦皮藤素原药。本发明提供的所述4-H-苦皮藤素水乳剂，包括以下重量份的成分:所述4-H-苦皮藤素原药7、份，乳化剂8 12份，抗冻剂3飞份。本发明提供的所述4-H-苦皮藤素水乳剂，优选地，包括以下重量份的成分:所述4-H-苦皮藤素原药8、份，乳化剂9 10份，抗冻剂5份。其中，所述乳化剂为:烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚或烷基芳基聚氧乙烯聚氧乙烯醚，优选烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚。
其中，所述抗冻剂为:乙二醇或丙二醇，优选乙二醇。本发明提供的一种4-H-苦皮藤素水乳剂，还包括溶剂。其中，溶剂为水。本发明所述的4-H-苦皮藤素水乳剂，其中的辅料，即乳化剂、抗冻剂以及溶剂，也可以是本领域的常规种类及用量。还可以使用助剂，也是本领域的常规选择。本发明所述4-H-苦皮藤素水乳剂中各活性成分(4-H- ^ - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物)的总的质量百分含量不小于4%。优选为5.(T7.0%。本发明提供的所述4-H-苦皮藤素水乳剂的制备方法，包括:将所述4-H-苦皮藤素原药与乳化剂、抗冻剂和溶剂按所述比例混合，即得。本发明提供的4-H-苦皮藤素原药的质量检测方法，包括以下步骤:I)取4-H-苦皮藤素原药直接作为4-H-苦皮藤素原药特征提取物；2)对4-H-苦皮藤素原药特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述4-H-苦皮藤素原药特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式(IGD核磁共振碳谱指纹图谱)测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度；3)通过定量分析手段测定得到4-H-苦皮藤素原药中所述标准参照品的绝对含量;4)利用所述特征峰峰强度(各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度)的比值和所述绝对含量，计算出4-H-苦皮藤素原药中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。其中，步骤I)中，4-H-苦皮藤素原药即为4-H-苦皮藤素特征提取物。4-H-苦皮藤素原药特征提取物检测方法如下:取4-H-苦皮藤素原药特征提取物，溶于CDCl3中，作IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测。其中，步骤2)中，所述4-H-苦皮藤素原药特征提取物中的活性成分特征峰为:C-15吸收峰，其化学位移为8 c60.0^66.00其中，步骤2)中，所述峰强度，可以采用峰高法、面积积分法或重量法计算。其中，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指:用定量分析手段测定的4-H-苦皮藤素原药中标准参照品的质量百分含量。其中，所述定量分析手段为高效液相色谱(HPLC)法。进一步地，HPLC法的条件为:色谱柱以十八烷基键合硅胶为填料，流动相为(甲醇/乙腈):水=[(40/20):40] [(47/23): 30]的混合溶剂，流速为lmL/min，检测波长为231nm。(甲醇/乙腈):水优选(43/22):35。其中，所述标准参照品为苦皮藤种素C (Angulateoid C)。本发明主要测定的是4-H-苦皮藤素原药中4-H-0 - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的含量。其中，4-H-苦皮藤素原药中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量计算是通过偶联计算公式将IGD核磁共振碳谱和定量分析手段偶联，即步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为:
权利要求
1.一种4-H-苦皮藤素原药，含有以下质量百分含量的活性成分:AngulateoidC15.0 18.0%, Angulateoid B4.0 12.0%, Angulateoid E13.0 21.0%, Angulatinoid14.5 8.0%, Angulatinoid V4.5 7.0%, Angulatinoid 113.0 5.0%, Celahin B2.0 6.0%,Celahin C2.(T6.0% ;所述活性成分均为4-H-0 - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物。
2.根据权利要求1所述的4-H-苦皮藤素原药，其特征在于，4-H-0- 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物总的质量百分含量不小于48%，优选不小于55%，更优选65.(T75.0%。
3.权利要求1或2所述的4-H-苦皮藤素原药的制备方法，包括:称取苦皮藤种子，粉碎，加入体积为2飞倍量、石油醚或90、5%的乙醇于6(T80°C下回流或超声提取2 3次，每次提取f 2小时，过滤后合并滤液，减压浓缩；取浓缩后的种子油，用其重量为f 2倍量的大孔吸附树脂装柱，先后以30 40%乙醇、55 65%乙醇、80 85%乙醇和90 95%乙醇冲柱，收集55飞5%乙醇洗脱液，减压蒸干，即得4-H-苦皮藤素原药。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂的型号为HP-20、SP825、AB-8、D-101、D-201或SP-70，所述大孔吸附树脂的径高比为8:1 15:1。
5.—种4-H-苦皮藤素水乳剂,包含权利要求1或2所述的4-H-苦皮藤素原药。
6.根据权利要求5所述的4-H-苦皮藤素水乳剂，其特征在于，包括以下重量份的成分:所述4-H-苦皮藤素原药7、份，乳化剂8 12份，抗冻剂3飞份；优选地，包括以下重量份的成分:所述4-H-苦皮藤素原药8、份，乳化剂扩10份，抗冻剂5份。
7.根据权利要求6所述的4-H-苦皮藤素水乳剂，其特征在于，所述乳化剂为:烷基芳基聚氧乙烯聚氧丙烯醚或烷基芳基聚氧乙烯聚氧乙烯醚，所述抗冻剂为:乙二醇或丙二醇，优选乙二醇。
8.根据权利要求5 7任 意一项所述的4-H-苦皮藤素水乳剂,其特征在于,该4-H-苦皮藤素水乳剂中4-H-0 - 二氢沉香呋喃倍半萜多醇酯类化合物的总的质量百分含量不小于4%，优选为5.0 7.0%。
9.一种权利要求1或2所述的4-H-苦皮藤素原药的质量检测方法，包括以下步骤: 1)取4-H-苦皮藤素原药直接作为4-H-苦皮藤素原药特征提取物； 2)对4-H-苦皮藤素原药特征提取物进行IGD核磁共振碳谱指纹图谱检测，根据指纹图谱得到所述4-H-苦皮藤素原药特征提取物中若干个活性成分特征峰峰强度；并用相同方式(IGD核磁共振碳谱指纹图谱)测定出所述各活性成分相应的标准参照品的特征峰峰强度； 3)通过定量分析手段测定得到4-H-苦皮藤素原药中所述标准参照品的绝对含量； 4)利用所述特征峰峰强度(各活性成分特征峰峰强度及相应的标准参照品的特征峰峰强度)的比值和所述绝对含量，计算出4-H-苦皮藤素原药中各活性成分的含量及该类活性成分的总含量，即活性成分组的含量。
10.根据权利要求9所述的质量检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述4-H-苦皮藤素原药特征提取物中的活性成分特征峰为:C_15吸收峰，其化学位移为8 c60.(T66.0。
11.根据权利要求9或10所述的质量检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述标准参照品的绝对含量是指:用定量分析手段测定的4-H-苦皮藤素原药中标准参照品的质量百分含量，所述定量分析手段为高效液相色谱法。
12.根据权利要求扩11任意一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述标准参照品为 Angulateoid C。
13.根据权利要求扩12任意ー项所述的质量检测方法，其特征在干，步骤4)中，计算各活性成分的含量的偶联公式为:
14.根据权利要求13所述的质量检测方法，其特征在于，计算4-H-苦皮藤素原药中各活性成分的系数和总系数的公式为:
15.一种权利要求51任意一项所述的4-H-苦皮藤素水乳剂的质量检测方法，利用权利要求扩14任意一项所述方法检测得到4-H-苦皮藤素原药中某个活性成分的含量，再利用以下公式推算出4-H-苦皮藤素水乳剂中各活性成分的质量百分含量An=X1Fn;其中: Xn为4-H-苦皮藤素水乳剂中某一活性成分质量百分含量； X1为用定量分析手段測定的4-H-苦皮藤素水乳剂中某一活性成分对应的标准參照品的绝对含量； Fn为权利要求14所述的4-H-苦皮藤素原药中某一活性成分与其对应的标准參照品质量百分含量的比值系数； 4-H-苦皮藤素水乳剂中活性成分组的含量为各活性成分Xn相加之和；该4-H-苦皮藤素水乳剂由4-H-苦皮藤素原药制备得到。
全文摘要
本发明涉及一种4-H-苦皮藤素原药及其水乳剂，以及它们的制备方法和质量检测方法。所述4-H-苦皮藤素原药，含有以下质量百分含量的活性成分Angulateoid C15.0~18.0%，Angulateoid B4.0~12.0%，Angulateoid E13.0~21.0%，Angulatinoid I4.5~8.0%，Angulatinoid V4.5~7.0%，Angulatinoid II3.0~5.0%，Celahin B2.0~6.0%，Celahin C2.0~6.0%。4-H-苦皮藤素原药采用大孔吸附树脂法制备得到，质量检测方法采用IGD核磁共振碳谱偶联指纹图谱技术；本发明的4-H-苦皮藤素原药含量大幅提高，质量检测方法准确性和稳定性、重复性和可行性也较高。
文档编号A01P7/04GK103109813SQ20131003486
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月29日 优先权日2013年1月29日
发明者赵天增, 张海艳, 董建军, 魏悦, 于立芹, 范毅, 常霞, 郭唯, 景炳年, 刘雨晴, 李自红 申请人:河南省科高植物天然产物开发工程技术有限公司