专利名称：一种分枝虫草菌株及其子实体和人工栽培方法
技术领域：
本发明涉及一种虫草菌株及其子实体和人工栽培方法，具体来说是涉及一种分枝虫草(Cordyceps ramosa Teng)的菌株⑶IM_CR20110521及其子实体和人工栽培方法。
背景技术：
分枝虫草(Cordyceps ramose Teng)也称分枝团囊虫草、大团囊讶，在分类上隶属于子囊菌门(Ascomycota)、果囊菌亚门(Pezizomycotina)、粪壳菌纲(Sordaricomycetes)、肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、线虫草科(Ophiocordycipitaceae)、团囊虫草属(Elaphocordyceps),主要分布在安徽、福建、甘肃和广东等省区，民间常用于治疗妇科出血症包括崩漏、月经过多、更年期子宫出血、产后恶露不绝和宫内节育器所致子宫出血等。现代科学研究表明，虫草中的许多种类都含有对人体有益的营养成分及其虫草素、虫草酸、腺苷等各种有效成份，具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、滋阴壮阳、保肝益肺和提高免疫力等多种功效，尤其以冬虫夏草、蛹虫草最为著名。但野生虫草由于连年采挖，其生态环境不断遭受严重的破坏，野生虫草资源日愈贫乏。分枝虫草是中国特有的具有药用价值的真菌资源，目前野生资源十分稀少，因此，对分枝虫草的野生驯化与人工栽培技术研究具有十分重要的意义，但至今仍没有获得分枝虫草菌株和人工栽培成功的报道。
发明内容
本发明的目的在于开发出一种分枝虫草菌株，另一目的是提供该分枝虫草人工栽培子实体，再一目的是提供该子实体的人工栽培方法。本发明以2011年4月从广东省野外调查发现的一种野生虫草子实体为材料通过组织分离纯化，首次获得了一种虫草菌株，将该菌株(编号为⑶M_CR20110521)接入综合PDA斜面培养基制备斜面母种， 斜面母种再接至液体培养基中制备一级菌种，一级菌种接入液体培养基中制备生产种，生产菌种接种在生产用培养基中经过培育获得了一种含有多种有效成分和营养成分的新的人工栽培虫草子实体，从而实现了本发明的目的。上述野生虫草的子实体特征是:子座多分枝，多弯曲，往往基部相互连接，高3 5cm，粗1.5 3mm，常稍扁，锈褐色至橙褐色；头部与柄无明显分界，多少呈披针形，向上尖肖1J，形成锥形的不孕尖端，与一种中国独有的虫草品种一分枝虫草Cordyceps ramosa Teng的形态特征相似，故定名为分枝虫草。本发明从上述野生虫草分离获得的分枝虫草菌⑶IM_Cr2011521Cordycepsramosa⑶M_Cr2011521已于2013年01月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC，地址是中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO:M2013015。本发明所述的分枝虫草的纯分离物(菌株)在斜面培养基上，基生菌丝发达，气生菌丝较少，微光光照12小时/天，3 4天后，菌丝逐渐转为黄色。本发明所述分枝虫草菌株经分子生物学技术鉴定，包括进行ITS-PCR、测序，并与Genbank中所登录的虫草序列相比对,与它最接近的虫草Cordyceps prolifica的相似性为96%。本发明的分枝虫草子实体，其特征是由分枝虫草菌⑶IM_Cr2011521Cordyc印sramosa⑶頂_Cr2011521CCTCC NO:M2013015或其新鲜子实体进行组织分离后人工栽培获得的，该子实体稍扁状，顶部常见尖状或图纯，不分枝或顶部有短分枝，浅暗黄褐色。所述的新鲜子实体可以是野生或栽培成功后获得的子实体。本发明所述的分枝虫草子实体的栽培方法，其特征包括以下:(I)将分枝虫草菌 fflHM_CR2011052lCordyc印S ramosa fflHM_CR201IO52ICCTCCNO:M2013015或其野生或栽培成功后获得的子实体进行组织分离，取子座按黄豆大小的接种量接入综合PDA斜面培养基，25 28°C，空气相对湿度60% 80%时，进行暗培养7 10天后，光照3 4天，再暗培养15 30天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为母种，保藏于4°C作备用或进一步培养，所述的综合PDA斜面培养基pH6.0
6.5，其原料组成为每IOOOmL水中加入马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2P043g，MgSO4.7Η201.5g，维生素B10.02 0.05g,琼脂15 20g ；(2)将步骤(I)得到的母种按黄豆大小的菌块接入黄豆芽汁马铃薯斜面培养基中继续培养或复壮，于25 28°C，空气相对湿度60% 80%时，进行暗培养7 10天、光照3 4天，再暗培养15 30天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为二级母种，所述的黄豆芽汁马铃薯斜面培养基PH6.0 6.5，其原料组成为每IOOOmL水中加入黄豆芽汁100g，马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15 20g，其制备方法是按原料组成分别称量各组分后，把马铃薯去皮切小长条，再放入黄豆芽汁，加水煮沸20 30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6 8层纱布过滤，余下的滤汁在加热状态下与其余组分混合搅拌均匀，趁热装于试管灭菌后，待冷却至70 80°C，制成斜面；(3)将步骤(2)得到的二级母种按每IOOmL培养基接入10_15块黄豆大小的菌块的接种量接种至液体培养 基中，于20 25°C，以120 150r/min的转速震荡培养6 10天，挑取菌丝球大小均匀一致、直径为2 3mm的菌种作为一级菌种，所述的液体培养基PH6.0 6.5，其组成是每IOOOmL培养基中含葡萄糖10g，酵母浸膏3g，麦芽浸出粉3g，蛋白胨5g和余量的水；(4)将步骤(3)得到的一级菌种按液体培养基体积5% 10%的接种量接入液体培养基中，于20 25°C，以140 150r/min的转速震荡培养7 10天，挑取菌丝球大小均匀一致、直径为2 3mm的菌种作为生产种，所述的液体培养基与步骤(3)的培养基相同；(5)在无菌的环境条件下，将步骤(4)得到的生产种用水稀释，再按每IOOOmL生产种接种到0.5 0.8kg生产用培养基的比例进行接种，在20 25°C，空气相对湿度50% 75%下，先暗培养7 12天，至菌丝基本长满培养基后，进行光照培养，光强400 7001x，8 10h/d，空气相对湿度80% 90%，25 28°C，经7 10天长出子实体原基，再培养50 60天，至部分子实体顶部出现白点，或出现孢子时，即可采收，得到分枝虫草子实体，所述的生产用培养基是按Ikg大米和I 2L营养液的比例组成，其中每升营养液由葡萄糖10g，蛋白胨5g，麦芽浸出粉3g，酵母浸膏3g，以及余量的水组成，pH6.0 6.5。步骤(I)所述的综合PDA斜面培养基的制备可采用通常方法:按原料组成分别称量各组分后，把马铃薯去皮切小长条，加水煮沸20 30分钟至马铃薯软而不烂时，用6 8层纱布过滤，余下的滤汁在加热状态下与其余组分混合搅拌均匀，趁热装于试管灭菌后，待冷却至70 80°C，制成斜面。步骤(3)所述的一级菌种还可以用同样的方法按液体培养基体积5% 10%的接种量接入液体培养基进一步扩大培养为二级菌种。步骤(5)所述的分枝虫草子实体还可以在60°C下烘4 5小时得到干品，以便于保存和再利用，所述的大米和营养液混合后，封口，121°C灭菌40min，冷却至室温备用。本发明所用大米、马铃薯和黄豆芽汁购自农贸市场，酵母浸膏、麦芽浸出粉、蛋白胨均购自广东环凯微生物科技有限公司，葡萄糖、KH2PO4、MgSO4.7Η20、维生素B1和琼脂均由市场购得。本发明的分枝虫草子实体的生物转化率达到10% 20%,即每千克养料能产出IOOg 200g的新鲜子实体。本发明的分枝虫草子实体含有多种有效成分和营养成分，其含量为腺苷0.008% 0.01%，虫草素0.001% 0.005%，虫草酸4.0% 4.82%，粗蛋白15.0% 17.9%，粗纤维10.0% 13.3%，粗多糖1.0% 1.1%，可作为食品或原料使用。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实施例1:称取马铃薯200g，葡萄糖 20g，KH2P043g, MgSO4.7H201.5g，维生素 B10.02g,琼脂15g，水1000mL。将马铃薯去皮切成小条放入锅中，加水煮沸20分钟左右至马铃薯软而不烂，用6层纱布过滤，余下的滤汁于锅中，加入琼脂熔化，再加入葡萄糖、KH2P04、MgSO4.7H20和维生素B1搅拌均勻，调节pH至6.0,趁热按5mL/管的量分装于18mmX 180mm试管里,塞上棉塞，包上牛皮纸或报纸，于121°C，15磅蒸汽压，灭菌20分钟，冷却到60°C倒成斜面，得到综合PDA斜面培养基，备用。将野生的分枝虫草菌GDIM_CR20110521Cordyceps ramosa GDIM_CR20110521CCTCC NO:M2013015子实体进行组织分离，取子座按黄豆大小的接种量接入无菌的综合PDA斜面培养基，250C，空气相对湿度60%，进行暗培养7天后，光照3天，再暗培养15天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为母种。称取黄豆芽汁100g，马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，将马铃薯去皮切成小条放入锅中，再加入黄豆芽汁，加水煮沸20分钟左右至马铃薯软而不烂，用8层纱布过滤，留滤汁于锅中，将琼脂熔化，再加入葡萄糖搅拌均匀，调节PH至6.0，趁热按5mL/管的量分装于18mmX 180mm试管里，塞上棉塞，包上牛皮纸，于121°C，15磅蒸汽压，灭菌20分钟，冷却到60°C倒成斜面，得到黄豆芽汁马铃薯斜面培养基。将母种按黄豆大小的菌块接入黄豆芽汁马铃薯斜面培养基中继续培养或复壮，于250C，空气相对湿度60%时，进行暗培养7天后，光照3天，再暗培养15天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为二级母种。称取葡萄糖10g，酵母浸膏3g，麦芽浸出粉3g，蛋白胨5g，将各成分分别用水溶解后混合，调节pH至6.0，用水定容至1L，按装量为50%的比例装入耐高温的容器内，于121°C下，15分钟常规灭菌，冷却至室温，得到液体培养基。
将二级母种按每IOOmL培养基10块黄豆大小的菌块的接种量接至无菌液体培养基中，20°C下，120r/min,振荡培养6天,选取菌丝球大小均勻一致、直径为2 3mm的菌种作为一级菌种。将5mL —级菌种接种至IOOmL液体培养基中，20°C下，140r/min，振荡培养7天，选取菌丝球大小均匀一致、直径为2 3mm的菌株作为生产种。将葡萄糖10g，蛋白胨5g，麦芽浸出粉3g，酵母浸膏3g混合用水定容到1L，pH调至6.0，得到营养液。将20g大米装入250mL的玻璃培养瓶内，在加入营养液20mL，混合，用聚乙烯薄膜和橡皮筋封口，121°C灭菌40min，冷却至室温，得到生产用培养基。在无菌条件下,将IOOmL的生产菌种用300mL的无菌水稀释,再接入50g无菌的生产用培养基中，在20°C，空气相对湿度50%下，先进行暗培养7天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强4001x，8h/d，空气相对湿度80%，250C，经7天长出子实体原基，再培养50天，待部分子实体顶部出现白点，即进行采收，得到分枝虫草子实体，将子实体在60°C下烘5小时，获得干品(水分含量不高于13%)。经统计，本次生物转化率达到15%，即每千克培养料能产出150g的新鲜子实体，经检测，得到的分枝虫草子实体含腺苷0.008%，虫草素0.001%，虫草酸4.0%，粗蛋白含量为15.0%，粗纤维含量为10.0%，粗多糖含量为1.0%。实施例2:称取马铃薯400g，葡萄糖 40g，KH2P046g, MgSO4.7H203g,维生素 B10.lg，琼脂 40g，水2000mL。将马铃薯去皮切成小条放入锅中，加水，煮沸30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用8层纱布过滤，留滤汁于锅中，将剩余水加入，将琼脂熔化，再加入葡萄糖、KH2PO4,MgSO4.7Η20和维生素B1搅拌均匀，调节pH至6.5，趁热按IOmL/管的量分装于20mmX 200mm试管里，塞上棉塞，包上牛皮纸，于121 °C，15磅蒸汽压，灭菌30分钟，冷却到70°C倒成斜面，得到综合PDA斜面培养基 ，备用。将分枝虫草菌fflHM_CR201 IO52ICordyc 印 s ramosa fflHM_CR201IO52 ICCTCC NO:M2013015从5°C保存下取出，按黄豆大小的接种量接入无菌的综合PDA斜面培养基中，280C，空气相对湿度80%，进行暗培养10天后，光照4天，再暗培养30天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为母种。称取黄豆芽汁200g，马铃薯400g，葡萄糖40g，琼脂40g，将马铃薯去皮切成小条放入锅中，再加入黄豆芽汁，加水煮沸30分钟左右至马铃薯软而不烂，用6层纱布过滤，留滤汁于锅中，将剩余的水加入，将琼脂熔化，再加入葡萄糖搅拌均匀，调节PH至6.5，趁热按5mL/管的量分装于18mmX 180mm试管里,塞上棉塞,包上牛皮纸,于121°C, 15磅蒸汽压,灭菌20分钟，冷却到60°C倒成斜面，得到黄豆芽汁马铃薯斜面培养基。将母种按黄豆大小的菌块接入黄豆芽汁马铃薯斜面培养基中继续培养或复壮，于28 V，空气相对湿度80%时，进行暗培养10天后，光照4天，再暗培养30天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为二级母种。称取葡萄糖10g，酵母浸膏3g，麦芽浸出粉3g，蛋白胨5g，将各成分分别用水溶解后混合，调节pH至6.5，用水定容至1L，按装量为50%的比例装入耐高温的容器内，于121°C下，15分钟常规灭菌，冷却至室温，得到液体培养基。将二级母种按每IOOmL培养基7块黄豆大小的菌块的接种量接至无菌的液体培养基中，25°C，150r/min，振荡培养10天，选取菌丝球大小均匀一致、直径为2 3mm的菌种作为一级菌种。
将IOmL —级菌种接种至IOOmL液体培养基中，于25°C，150r/min，振荡培养10天，挑取菌丝球大小均匀一致、直径为2 3mm的菌株作为生产种。将葡萄糖IOg,蛋白胨5g,麦芽浸出粉3g,酵母浸膏3g,混合用水定容到1L, pH调至6.5，得到营养液。将20g大米装入250mL的玻璃培养瓶内，在加入营养液40mL，混合，用聚乙烯薄膜和橡皮筋封口，121 °C灭菌40min，冷却至室温，得到生产用培养基。在无菌室内，将IOOmL的生产菌种用800mL的无菌水稀释,再接入80g无菌的生产用培养基中，于25°C，空气相对湿度75%下，先进行暗培养12天，待菌丝长满培养基后，进行光照培养，光强7001x，10h/d，空气相对湿度90%，28°C，经10天长出子实体原基，再培养60天，待部分子实体顶部出现孢子，即进行采收，得到分枝虫草子实体，将子实体在60°C下烘5小时，获得干品(水分含量不高于13%)。经统计，本次生物转化率达到20%,即每千克培养料能产出200g的新鲜子实体，经检测，得到的分枝虫草子实体含腺苷0.01%，虫草素0.005%，虫草酸4.82%，粗蛋白含量为17.9%，粗纤维含量为13. 3%，粗多糖含量为1.1%。
权利要求
1.分枝虫草菌⑶M_CR2011052ICordyc印Sramosa fflHM_CR2011052ICCTCC NO:M2013015。
2.一种分枝虫草子实体，其特征是由权利要求1所述的分枝虫草菌或其新鲜子实体进行组织分离后人工栽培获得的，该子实体稍扁状，顶部常见尖状或图纯，不分枝或顶部有短分枝，浅暗黄褐色。
3.根据权利要求2所述的分枝虫草子实体，其特征是所述的新鲜子实体是野生或栽培成功后获得的子实体。
4.权利要求2或3所述的分枝虫草子实体的人工栽培方法，其特征包括以下的步骤: (1)将权利要求1所述的分枝虫草菌或其野生或栽培成功后获得的子实体进行组织分离，取子座按黄豆大小的接种量接入综合PDA斜面培养基，25 28°C，空气相对湿度60% 80%时，先暗培养7 10天后，光照3 4天，再暗培养15 30天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为母种，所述的综合PDA斜面培养基pH6.0 6.5，其原料组成为每IOOOmL水中加入马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2P043g, MgSO4.7H201.5g，维生素B10.02 0.05g,琼脂 15 20g ； (2)将步骤(I)得到的母种按黄豆大小的菌块接入黄豆芽汁马铃薯斜面培养基中继续培养或复壮，于25 28°C，空气相对湿度60% 80%时，先暗培养7 10天后，光照3 4天，再暗培养15 30天，至菌丝长满斜面，挑取基生菌丝发达且转成黄色的斜面作为二级母种，所述的黄豆芽汁马铃薯斜面培养基PH6.0 6.5，其原料组成为每IOOOmL水中加入黄豆芽汁100g，马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15 20g，其制备方法是按原料组成分别称量各组分后，把马铃薯去皮切小长条，再放入黄豆芽汁，加水煮沸20 30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6 8层纱布过滤，余下的滤汁在加热状态下与其余组分混合搅拌均匀，趁热装于试管灭菌后，待冷却至70 80°C，制成斜面； (3)将步骤(2)得到的二级母种按每IOOmL培养基接入10-15块黄豆大小的菌块的接种量接种至液体培养基中，于20 25°C，以120 150r/min的转速震荡培养6 10天，挑取菌丝球大小均匀一致、直径为2 3mm的菌种作为一级菌种，所述的液体培养基pH6.0 6.5，其组成是每IOOOmL培养基中含葡萄糖10g，酵母浸膏3g，麦芽浸出粉3g，蛋白胨5g和余量的水； (4)将步骤(3)得到的一级菌种按液体培养基体积5% 10%的接种量接入液体培养基中，于20 25°C，以140 150r/min的转速震荡培养7 10天，挑取菌丝球大小均匀一致、直径为2 3mm的菌种作为生产种，所述的液体培养基与步骤(3)的培养基相同； (5)在无菌的环境条件下，将步骤(4)得到的生产种用水稀释，再按每IOOOmL生产种接种到0.5 0.8kg生产用培养基的比例进行接种，在20 25°C，空气相对湿度50% 75%下，先暗培养7 12天，至菌丝基本长满培养基后，进行光照培养，光强400 7001x，8 10h/d，空气相对湿度80% 90%，25 28°C，经7 10天长出子实体原基，再培养50 60天，至部分子实体顶部出现白点，或出现孢子时，即可采收，得到分枝虫草子实体，所述的生产用培养基是按Ikg大米和I 2L营养液的比例组成，其中每升营养液由葡萄糖10g，蛋白胨5g，麦芽浸出粉3g，酵母浸膏3g， 以及余量的水组成，pH6.0 6.5。
5.根据权利要求4所述的分枝虫草子实体的人工栽培方法，其特征是步骤(I)所述的综合PDA斜面培养基的制备方法是按原料组成分别确定各组分的重量后，把马铃薯去皮切小长条，煮沸20 30分钟至马铃薯软而不烂时，用6 8层纱布过滤，余下的滤汁在加热状态下与其余组分混合搅拌均匀，趁热装于试管灭菌后，待冷却至70 80°C，制成斜面；步骤(3)所述的一级菌种用同样的方法按液体培养基体积5% 10%的接种量接入液体培养基进一步扩大培养为二级菌种；步骤(5)所述的分枝虫草子实体还在60°C下烘4 5小时得到干品。`
全文摘要
本发明涉及一种分枝虫草菌GDIM_CR20110521(Cordyceps ramosa GDIM_CR20110521)CCTCC NOM2013015及其子实体和人工栽培方法，其特征是通过将该菌株或其野生或栽培成功后获得的子实体进行组织分离，接入综合PDA斜面培养基制备斜面母种，斜面母种再接至液体培养基中制备一级菌种，一级菌种接入液体培养基中制备生产种，生产菌种在生产用培养基中培养获得一种人工栽培的分枝虫草子实体。本发明分枝虫草子实体生物转化率达到10%～20%，含有多种有效成分和营养成分，其含量为:腺苷0.008%～0.01%，虫草素0.001%～0.005%，虫草酸4.0%～4.82%，粗蛋白15.0%～17.9%，粗纤维10.0%～13.3%，粗多糖1.0%～1.1%，可作为食品或原料使用。
文档编号A01G1/04GK103098648SQ20131003758
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者宋斌, 林群英, 李泰辉, 林敏 , 李挺, 邓旺秋, 沈亚恒 申请人:广东省微生物研究所