专利名称：一种快速评价草菇受低温伤害程度的方法
技术领域：
本发明属于评价食用菌受低温伤害程度领域，特别涉及一种快速评价草菇受低温伤害程度的方法。
背景技术：
草燕(Volvariellavolvacea (Bull ex Fr.) Sing)又名稻草燕、兰花燕、中国燕，属担子菌纲，伞菌目，光柄菇科，小包脚菇属。草菇味道鲜美，营养丰富，是食用菌中的优质菇种。据研究报道，鲜草菇含水92.39%，蛋白质2.66%，脂肪2.24%，还原糖1.66%，转化糖
0.95%，灰分0.91% ;在草菇蛋白质中含有18种氨基酸，包含人体所不能合成的8种必需氨基酸。除食用价值外，草菇还具有提高人体免疫力、抑制癌细胞生长、解毒等功效。在草菇的栽培中，完全使用天然材料(如稻草、玉米芯、棉籽壳等)，从播种到采收期间，几乎不使用农药，完全符合现代人对食品安全的要求。因此，草菇一直深受人们的喜爱，是我国传统的出口创汇产品，远销至美国、加拿大、英国、日本、新加坡、马来西亚等国家和地区。草菇原产于热带与亚热带地区，属于典型的高温菇种。草菇菌丝对低温的抵抗力差，在10°C以下便停止生长，子实体在常规低温(0-5°C)下会发生自溶而导致其变软、液化直至腐烂。因此对草菇低温应答机制进行研究，有利于草菇菌种的低温保藏、子实体的低温保鲜以及耐低温菌种的选育。虽然目前在分 子水平上已有草菇低温诱导基因的报道，然而尚缺乏一种快速鉴定草菇受低温伤害程度的生理生化方法，间接影响了对草菇低温应答机制的深入研究。细胞膜是生物感知逆境最敏感的部位，低温首先会损伤细胞膜的结构，使膜上的蛋白质功能与脂肪酸组成发生改变，导致细胞膜通透性增大，胞内物质外渗，引起各种生理生化过程的紊乱。相对电导率的高低，能够直接反映出细胞内物质的外渗情况，即细胞膜受损伤的程度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速评价草菇受低温伤害程度的方法，该方法操作简便，易于掌握，整个系统的草菇受低温伤害程度鉴定都在可控条件下进行，使得测定数据更加可靠；还可以用于不同草菇菌株间耐低温性的快速判断，能够大大缩短筛选耐低温突变株的育种周期。本发明的一种快速评价草菇受低温伤害程度的方法，包括:(I)将活化后的草菇菌株接种到灭菌的PDA培养基上，于32 35°C、黑暗条件下静置培养3 4天；待菌丝长满平皿后，将其转接到PDY培养液中，然后在32 35°C、黑暗条件下振荡培养3 4天；(2)将PDY培养液中的菌丝球过滤，并在(T4°C低温下处理(T8h，在各个低温处理时间点分别取菌丝球放入装有2(T30ml双蒸水的离心管中，2(T25°C下振荡，测定初始电导率E1，再在121°C下灭菌20min，2(T25°C下振荡，测定终极电导率E2 ;相对电导率的计算公式EqZKE1-EciV(E2-Eci) X 100%，式中Etl为双蒸水电导率，根据计算结果即能评价出草菇受低温伤害的程度。所述步骤(1)中的PDA培养基的组成为:马铃薯(取汁)200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂条20g/L。所述步骤(1)中的PDY培养液的组成为:马铃薯(取汁)200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物2g/L。所述步骤(1)中的摇床的振荡速度为12(Tl50rpm。所述步骤(2)中的低温处理时间分别为0h、2h、4h和8h。所述步骤(2)中的振荡速度为12(Tl50rpm，振荡时间为18 24h。本发明的思路是:在特定条件下确立草菇菌丝细胞膜的受伤害程度与某个物理量之间的相关性，从而将草菇菌株在低温下所受的伤害程度转化为对该物理量的测定。实验结果表明，本发明采用在一定冷胁迫下的低温处理，根据草菇菌丝相对电导率的数值可以反映出细胞膜受低温伤害的程度，也可以快速鉴定不同草菇菌株间细胞膜受低温伤害程度的差异，加快草菇耐低温菌株的选育进程。为确立草燕菌株耐低温性与相对电导率之间的相关性，本发明通过对已知耐低温差异的两个草菇菌株菌丝低温处理下相对电导率的测定与比较分析，来优化草菇菌丝的低温处理条件、相对电导率的测定方法，获得低温处理时间与草菇菌株相对电导率数值之间的对应关系，最终确立本发明的技术方案。本发明的技术方案包括培养基的配制、草菇菌丝在PDA培养基与PDY培养液中的培养、草菇菌丝低温处理、低温处理后草菇菌丝电导率的测定以及相对电导率的计算。实验结果表明，随着低温胁迫时间的延长，草菇菌丝细胞膜的相对电导率呈上升趋势，不同低温处理时间下，其上升的幅度也不同；在相同的低温处理时间下，耐低温较好的草燕菌株相对电导率比不耐低温的草燕菌株相对电导率要小，说明耐低温草燕菌株的细胞膜完整性相对较好。有益.效果本发明操作简便，易于掌握，整个系统的草菇受低温伤害程度鉴定都在可控条件下进行，使得测定数据更加可靠；此方法还可以用于不同草菇菌株间耐低温性的快速判断，能够大大缩短筛选耐低温突变株的育种周期。
图1为草菇菌株VH3、V23在平皿上长到可以接种到PDY培养液时的状态。图2为草菇菌株VH3、V23在PDY培养液中生长状况，此时为进行低温处理的最佳时期。图3为50ml离心管中菌丝球量。图4为实验所用的电导率测定仪。图5为不同低温处理时间下，草菇菌株VH3、V23相对电导率数据图；其中*表示在此低温处理时间下，VH3与V23的相对电导率差异显著(P=0.05)。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本实施例中所涉及的草菇菌株有2个，名称分别为VH3与V23，均由上海市农业科学院食用菌研究所食用菌保藏中心提供；其中V23菌株为常规生产用菌株，VH3菌株是发明人将V23菌株经紫外线(UV)、6°Co-y射线、硫酸二乙酯(DES)对原生质体进行复合诱变而来，并且已经获得了上海市品种认定。与V23菌株相比，VH3菌株具有出菇所需最适温度低、所需能耗少、产量较高等优点。实施例11、培养基的配制:(1 )PDA固体培养基制备:马铃薯(取汁)200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂条20g/L，加入蒸馏水中，混合均匀后装入三角瓶中，于121°C下灭菌20min ;冷却至45飞(TC，倒入已灭菌的直径9cm的培养皿中，倒入量为培养皿容积的35%，凝固备用。其中马铃薯取汁的具体操作为:挑选马铃薯，将其表面清洗干净，去皮，称取200g ;将马铃薯切块，加蒸馏水煮烂(一般煮沸20-30min，能被玻璃棒戳破即可)，用四层纱布过滤。(2)PDY液体培养基制备:马铃薯(取汁)200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物2g/L，加入蒸馏水中，待完全溶解后分装至三角瓶中，每瓶100ml，于121°C下灭菌20min。马铃薯取汁的操作步骤同上。2、草菇菌丝在PDA培养基与PDY培养液中的培养:(I)清理超净工作台，打开紫外灯灭菌20_30min，然后在无菌条件下将草菇菌株VH3与V23接种于PDA固体培养基中央，标注菌株名称和日期，用封口膜封口。(2)将(I)中接种好的平皿置于32 °C培养箱内，黑暗条件下静置培养4天左右，待菌丝长满平皿(图1)即可用于接种到PDY培养液中。(3)提前将匀质仪、5ml移液枪枪头用报纸包好，121 °C下灭菌20min，然后放入60°C烘箱中烘干备用。(4)清理超净工作台，打开紫外灯灭菌20_30min，然后将长满草菇菌丝的PDA培养基加入到匀质仪中，并加入PDY培养液100ml，打碎。在无菌条件下，用移液枪移取5ml匀浆液加入到装有PDY培养液的三角瓶中，标注菌株名称和日期，用灭菌封瓶膜封口。(5)将(4)中接种好的三角瓶置于32°C摇床中，150rpm，培养4天左右(图2)即可开始草菇菌丝低温处理。3、草菇菌丝低温处理:(I)将培养好的VH3与V23的菌丝球，先用灭菌的无纺布过滤，再用双蒸水冲洗3次，然后置于冰浴中分别低温处理0h、2h、4h、8h。(2)向50ml离心管中加入30ml双蒸水，在各个低温处理时间点时分别取适量菌丝球放入50ml离心管中(图3)，标注好名称、日期以及低温处理时间。4、低温处理后草菇菌丝电导率的测定与相对电导率的计算:(1)将步骤3 (2)中的离心管放入25°C摇床中，150rpm，振荡24h，采用电导率测定仪(图4)测定初始电导率Ep
(2)将测定初始电导率后的离心管在121 °C下灭菌20min，再置于25 °C摇床中，150rpm，振荡24h，使用电导率测定仪(图4)测定终极电导率E2。依据公式EqZKE1-EqV(E2-Eq) X 100% (E0为双蒸水的电导率)，计算VH3与V23的菌丝在不同冰浴处理时间下的相对电导率数值，结果如图5所示。研究结果显示:随着冰浴处理时间的延长，草菇菌株VH3与V23细胞膜的相对电导率均呈上升趋势；在冰浴处理2h时，两菌株的相对电导率上升幅度均较大，分别达到了 64.07%与73.50%,说明冰浴处理前2h内草菇菌丝细胞膜的透性发生了急剧变化，这段时间可能是进行基因水平研究的关键取样点；到冰浴处理8h时，两菌株的相对电导率均在80%左右，说明冰浴处理8h后两菌株细胞膜的选择性通透功能已基本丧失，此时可能是进行代谢水平研究的关键取样点。同时，在冰浴处理2h和4h时，耐低温性较好的VH3菌株的相对电导率显著低于不耐低温的V23菌株，说明VH3菌株的细胞膜完整性相对较好。因此，此方法亦可以用于不同草菇菌株间耐低温能力的快速判断，能够大大 缩短筛选耐低温突变株的育种周期。
权利要求
1.一种快速评价草菇受低温伤害程度的方法，包括: (1)将活化后的草菇菌株接种到灭菌的PDA培养基上，于32 35°C、黑暗条件下静置培养3 4天；待菌丝长满平皿后，将其转接到PDY培养液中，然后在32 35°C、黑暗条件下振荡培养3 4天； (2)将PDY培养液中的菌丝球过滤，并在(T4°C低温下处理(T8h，在各个低温处理时间点分别取菌丝球放入装有2(T30ml双蒸水的离心管中，2(T25°C下振荡，测定初始电导率E1，再在121°C下灭菌20min，2(T25°C下振荡，测定终极电导率E2 ;相对电导率的计算公式EqZKE1-EciV(E2-Eci) X 100%，式中Etl为双蒸水电导率，根据计算结果即能评价出草菇受低温伤害的程度。
2.根据权利要求1所述的一种快速评价草菇受低温伤害程度的方法，其特征在于:所述步骤(I)中的PDA培养基的组成为:马铃薯取汁200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂条20g/L。
3.根据权利要求1所述的一种快速评价草菇受低温伤害程度的方法，其特征在于:所述步骤(I)中的PDY培养液的组成为:马铃薯取汁200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物2g/L。
4.根据权利要求1所述的一种快速评价草菇受低温伤害程度的方法，其特征在于:所述步骤(I)中的摇床的振荡速度为12(Tl50rpm。
5.根据权利要求1所述的一种快速评价草菇受低温伤害程度的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的低温处理时间分别为0h、2h、4h和8h。
6.根据权利要求1所述的一种快速评价草菇受低温伤害程度的方法，其特征在于:所述步骤(2)中的振荡速度 为12(Tl50rpm，振荡时间为18 24h。
全文摘要
本发明涉及一种快速评价草菇受低温伤害程度的方法，包括(1)将活化后的草菇菌株接种到灭菌的PDA培养基上，静置培养3~4天；待菌丝长满平皿后，将其转接到PDY培养液中，然后振荡培养3~4天；(2)将PDY培养液中的菌丝球过滤，低温处理，在各个低温处理时间点分别取菌丝球20~25℃下振荡，测定初始电导率E1，再灭菌，振荡，测定终极电导率E2；根据计算结果即能评价出草菇受低温伤害的程度。本发明操作简便，易于掌握，整个系统的草菇受低温伤害程度鉴定都在可控条件下进行，使得测定数据更加可靠；此方法还可以用于不同草菇菌株间耐低温性的快速判断，能够大大缩短筛选耐低温突变株的育种周期。
文档编号A01G1/04GK103098649SQ20131003951
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月31日 优先权日2013年1月31日
发明者赵妍, 陈明杰, 姜威, 汪虹, 张宝粉 申请人:上海市农业科学院