专利名称：一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培
养方法。
背景技术：
为了满足不断增加的人口对食物的需求，促使人们大规模种植遗传背景较为单一的小麦优良品种，这使得栽培小麦的遗传基础变窄，遗传变异减少，对病虫害的抗性及环境适应能力减弱。为解决这一突出问题，育种家们开始把目光转向有着丰富基因资源的小麦近缘物种，希望通过远缘杂交能够向栽培品种中导入不同种属植物的有利基因，提高和改进栽培品种的经济性状，尤其是提高抗生物胁迫和非生物胁迫能力，培育高产、优质、抗病虫和耐逆的作物品种。自从Barelle在1806年进行第一次小麦远缘杂交以来，在小麦远缘杂交方面的研究己经有了长足的发展(李军辉，2002).其中，鹅观草(Roegneria kamojiOhwi) (2n=6x=42)属于小麦族中最大的属一鹅观草属，是一种六倍体多年生禾草，蕴藏着丰富的遗传多样性，具有多花多粒、耐湿、抗寒、耐旱、耐碱及高抗赤霉病等特性，是牧草育种和作物改良的天然基因库，也是一种具有较高经济价值的多年生优质牧草，吸引了众多研究者的关注。鶴观草属Roegneria是C.Koch于1848年以高加索鶴观草R.caucasica C.Koch为模式种建立的。现知全世界130余种，主要分布在北半球的温寒地带。我国约70余个种，主要分布于西北、西南和华北地区。国外学者从18世纪就对该属植物的分类进行了研究，随后国内外 对该属的工作主要集中于利用小麦、大麦等作物与鹅观草远缘杂交进行抗赤霉病育种研究(汪杏芬，1994;吴丽芳，1997);利用形态学、细胞学、同功酶、RAH)和SSR等手段研究鹅观草及其近缘种的遗传变异、种的划分、亲缘关系和系统进化的研究上(肖海峻，小麦族鹅观草属植物研究进展，草业科学，2007，24 (4):)。但针对其穗轴脆，易倒伏，高感白粉病等不良性状，利用现代生物技术，特别是基因工程技术进行研究则少见报道，因此加强从现代生物技术角度对该属植物的研究，探讨如何有效地利用这一丰富的野生牧草资源，具有很高的生态及育种价值。而且利用现代生物技术，特别是转基因技术对植物进行遗传改良具有高效、快捷等特点，在许多植物育种中已成功应用，为鹅观草利用现代生物技术育种提供了重要的借鉴。建立鹅观草高效稳定的组织培养再生系统是利用转基因技术对其进行遗传改良重要前提，但目前报道的鹅观草组织培养及植株再生体系均不完善，再生率偏低，不能满足转基因的需要。鹅观草种子非常小，且种皮结构致密，难以彻底消毒灭菌，特别是鹅观草未成熟种子携带大量内生真菌，主要是在那些植物体内完成其全部或部分生活史，但又不引起任何病症的微生物(Bacon&Siegel，1988)。对于鹅观草组织培养来说内生菌作为污染源，必须通过消毒灭菌和在培养基中加入杀菌剂加以抑制，否则无法获得离体培养的成功。回顾植物体细胞培养研究的历史，人们都是从选择合适的外植体、筛选与此相应的培养条件，特别是培养基成分、激素的配比等着手，同样重要的是找到理想的外植体及其适宜的时期。小麦的体细胞培养系统的突破，最重要的是选择到了授粉后15d左右的未成熟胚和相应的培养基及培养条件。未成熟胚有其简易、方便、能大量取材、再生能力强等明显的优点，成为目前小麦基因转化的主导受体。因此，与小麦类似，本研究将从鹅观草未成熟胚的取材时期、种子消毒、诱导和分化培养基的成分及激素配比等方面入手，建立一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现:一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，以鹅观草未成熟种子剥取的幼胚为外植体，依次进行(I)外植体培养诱导愈伤组织；(2)愈伤组织诱导芽的分化和伸长；(3)生根壮苗获得再生植株三个阶段的培养。阶段(I)外植体培养诱导愈伤组织的培养条件为黑暗培养，培养温度为250C ±1°C，培养时间为28天。阶段(I)外植体培养诱导愈伤组织使用的培养基以MS为基础培养基，添加终浓度为5mg/L的2，4-D (2, 4- 二氯苯氧乙酸),或6mg/L的Dicamber (麦草畏)中的任意一种。阶段(2)和阶段(3) 1500-2000勒克斯的光培养，光照时间为12h/d，整个培养过程，培养温度为25°C ± 1°C，每培养28天换新鲜培养基。阶段(2)愈伤组织诱导芽的分化和伸长使用的培养基为以大量元素减半的MS为基础培养基，添加终浓度为2mg/l的激动素(KT)以及lmg/L的萘乙酸(NAA)，或者添加终浓度为lmg/1的激动素(K T)以及lmg/L的萘乙酸(NAA)。阶段(I)中诱导得到的愈伤组织接种于阶段(2)的培养基中培养28天芽分化后用相同培养基进行一次继代培养。阶段(3)生根壮苗获得再生植株使用的培养基是大量元素减半的MS培养基添加终浓度为lmg/L的NAA，500mg/L的活性炭以及500mg/L的多效唑。本发明将鹅观草(Roegneria kamoji Ohwi)未成熟种子从幼穗上剥离,70%的酒精浸泡30s,,再用0.1%的升萊浸泡并振荡15min,以无菌水冲洗3_5次。无菌条件下在解剖镜下剥离幼胚接种至第(I)阶段的培养基中，黑暗培养28天后在形成白色致密的愈伤组织。在上述第(I)阶段的培养基和培养条件下培养28天，愈伤组织诱导率达到75%以上，选取其中结构较致密的白色或淡黄愈伤组织，转入第(2)阶段的培养基培养28天，芽分化后用相同培养基进行一次继代培养，芽诱导率达75%以上，将带芽的愈伤块转入第(3)阶段的培养基，在光强为1500-2000勒克斯的光照条件下培养28天，植株再生率达85%以上。将再生植株在温度为25°C、湿度75%左右的光照培养箱中揭开封口膜炼苗4-7d。之后取出再生植株，洗净根部附着培养基，移栽到基质(珍珠岩:草碳:大田土 =1:1:1)中用塑料膜覆盖保湿。7d后，揭开塑料膜，成活率达95%。有益效果:本发明从鹅观草未成熟种子的幼胚高效诱导出愈伤组织，严格抑制住内生菌污染并且不影响其分化出大量的稳定、均一的再生植株，因此此体系可用于基因工程或细胞工程育种。
:图1鹅观草未成熟种子图2不同大小的鹅观草未成熟胚图3诱导出的愈伤组织图4愈伤组织的分化图5再生植株诱导图6移栽成活苗
具体实施方式
:在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围:实施例1:鹅观草幼胚诱导愈伤组织过程中内生真菌的抑制将鹅观草开花后12-15天的未成熟种 子从幼穗上剥离(图1)，70%的酒精浸泡30s,，再用0.1%的升汞浸泡并振荡15min，以无菌水冲洗3_5次。无菌条件下在解剖镜下剥离幼胚分别接种至诱导培养基MSD2和添加15mg/L苯莱特(Benlate)的MSD2中，黑暗培养10天后，统计内生真菌污染数的胚数，结果表明在MSD2培养基中，污染率高达66.7%，而在添加15mg/L苯莱特(Benlate)的MSD2培养基中，污染率降至3.3% (表I)。因此在培养基中加入15mg/L苯莱特(Benlate)可有效抑制内生真菌的生长。MSD2培养基的制备是将激素2，4_D (2，4_ 二氯苯氧乙酸)2mg/L直接添加MS培养基的其他成分中，然后高压灭菌而制得的，苯莱特(Benlate)用少量酒精溶解后加水配成15mg/ml母液，待MSD2培养基冷却至60°C左右时加入。所用仪器设备是植物组织培养所公知的超净工作机、自动高压灭菌锅等设备。在整个再生体系培养体过程中，培养基PH值均为5.8，温度均为25±1°C。表I鹅观草幼胚诱导愈伤组织过程中内生真菌的抑制
权利要求
1.一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于以鹅观草未成熟种子剥取的长度100-200um的幼胚为外植体，依次进行(I)外植体培养诱导愈伤组织；(2)愈伤组织诱导芽的分化和伸长；(3)生根壮苗获得再生植株三个阶段的培养。
2.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段(I)外植体培养诱导愈伤组织的培养条件为黑暗培养，培养温度为25°C ± 1°C，培养时间为28天。
3.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段(I)外植体培养诱导愈伤组织使用的培养基以MS为基础培养基，添加终浓度为2-5mg/L的2，4-D,3_6mg/L的麦草畏,0-0.5mg/L的6-BA中的任意一种或两种。
4.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段(I)外植体培养诱导愈伤组织使用的培养基为添加终浓度为5mg/L的2，4-D，或终浓度为6mg/L的麦草畏中的任意一种。
5.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段(2)和阶段(3) 1500-2000勒克斯的光培养，光照时间为12h/d，整个培养过程，培养温度为25°C ±1°C，每培养28天换新鲜培养基。
6.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段(2)愈伤组织诱导芽的分化和伸长使用的培养基为以大量元素减半的MS为基础培养基，添加终浓度为2mg/l的激动素以及lmg/L的NAA，或者添加终浓度为lmg/1的激动素以及lmg/L的萘乙酸NAA。
7.根据权利要求6所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段(I)中诱导得到的愈伤组织接种于阶段(2)的培养基中培养28天芽分化后用相同培养基进行一次继代培 养。
8.根据权利要求1所述的高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法，其特征在于阶段(3)生根壮苗获得再生植株使用的培养基是大量元素减半的MS培养基添加终浓度为lmg/L的NAA,500mg/L的活性炭以及500mg/L的多效唑。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及一种高频的鹅观草幼胚愈伤组织诱导和再生的培养方法。该方法主要步骤包括以鹅观草未成熟种子为材料，消毒灭菌后剥离幼胚置于诱导培养基上培养获得愈伤组织，在芽分化培养基中高频诱导芽丛及在生根壮苗培养基获得再生植株。在整个培养阶段通过添加苯莱特能有效抑制内生真菌的生长。在诱导愈伤组织培养通过添加一定配比的2,4-D、Dicamba、6-BA可有效将愈伤组织的诱导率提高到75%以上。在分化培养到再生培养过程，通过改变植物生长调节剂浓度配比，芽诱导率达90%以上，植株再生率达85%以上。
文档编号A01H4/00GK103210843SQ20131012250
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月9日 优先权日2013年4月9日
发明者邢莉萍, 钱晨, 王苏玲, 曹爱忠, 陈佩度 申请人:南京农业大学