专利名称：一种黄绿蜜环菌的深层发酵及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于食品及生物医药技术领域，尤其涉及一种黄绿蜜环菌的深层发酵方法。
背景技术：
黄绿蜜环菌(Armillarialuteovirens),是一种名贵的野生食用菌,资源量非常有限，目前尚未人工驯化，仍处于野生状态。主要分布于青海、西藏、四川、甘肃，其海拔分布范围约为3000-4300m，其中以祁连的黄蘑菇最为质优。黄绿蜜环菌鲜味独特，口感极佳，颇受世人欢迎。它含有丰富的蛋白质、矿质元素、氨基酸和多种维生素，并含有能够增强机体免疫功能和抑制肿瘤生长等生理活性的化学成分，具有较高的营养价值和食疗保健作用。黄绿蜜环菌集食用、药用和保健功能于一身，迫切需要对黄绿蜜环菌进行有效的开发利用。为了克服黄绿蜜环菌野生资源短缺的现状，进行菌种的深层发酵，实现菌丝体的工业化生产成为必选之路。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供优良的黄绿蜜环菌发酵菌种和一种工艺简单，生产成本低廉、无污染、适合企业化生产的高效黄绿蜜环菌发酵生产工艺。本发明实施例是这样实现的，一种黄绿蜜环菌的深层发酵方法，所述黄绿蜜环菌的深层发酵方法包括以下步骤:采集野生黄绿蜜环菌子实体，分离纯化菌种；纯化的黄绿蜜 环菌菌种进行优良菌种筛选；筛选的优良菌种进行驯化培养；驯化的黄绿蜜环菌菌种进行深层发酵生产；从发酵液收集黄绿蜜环菌菌丝体。进一步、所述采集野生黄绿蜜环菌子实体，分离纯化菌种的具体步骤为:将新鲜子实体菌柄根部泥土剔除，装入无菌牛皮纸袋中，每袋装I个；在无菌条件下，从菌褶和菌柄结合部位用组织分离法或孢子分离法分离黄绿蜜环菌菌种，用PDA培养基培养；对分离的菌种进行转接、纯化。进一步、所述纯化的黄绿蜜环菌菌种进行优良菌种筛选的具体步骤为:对纯化的菌种进行形态、生理生化特征检测，筛选出优良的目标菌株。进一步、所述筛选的优良菌种进行驯化培养的具体步骤为:对优良菌株进行多种碳源、氮源、C/N、无机盐、维生素的培养基组方和培养条件筛选、人工驯化，优选出最佳培养基组方:10 30%马铃薯浸提液、10 30%豆芽浸提液、5 10%葡萄糖、I 5%qKH2P04、
I 5%0 MgSO4^0.1 1%。微量盐、0.1 lmg/L VB1^0.1 lmg/L VB2、pH5.5 7.5，20 30°C培养。进一步、所述驯化的黄绿蜜环菌菌种进行深层发酵生产的具体步骤为:对驯化菌种进行深层发酵，优选出发酵培养基组方:10 30%马铃薯浸提液、10 30%黄豆芽浸提液、0.1 lmg/L复合VB、pH5.5 7.5。发酵条件:5 30%接种量、50 250mL/500mL摇瓶装量、20 30°C摇床温度、50 250rpm摇床转速、7 20d发酵周期。进一步、所述从发酵液收集黄绿蜜环菌菌丝体的具体步骤为:对黄绿蜜环菌发酵液进行离心，离心速度为1000 3000rpm，时间为5 20min，得到沉淀部分菌丝体；菌丝体用纯净水洗3 7次，真空冷冻干燥，温度为40 60°C。本发明的另一目的在于提供一种上述的深层发酵方法制备的黄绿蜜环菌在饮料、口服液、调味品、特殊膳食食品、保健药膳中的应用。本发明通过菌种分离纯化、优良菌种筛选、菌种驯化研究，对优良的驯化菌种进行菌丝体深层发酵工艺研究，以期遴选出一种合理、可行的黄绿蜜环菌菌丝体生产工艺。从采自不同地区的黄绿蜜环菌子实体中，通过菌种分离、形态培养、生理生化特征及菌丝体有效成分等研究，表明菌丝体含有丰富多糖及18种氨基酸，低脂高蛋白，还含有VC、VB1、VB2、VE，钾、钠、钙、铁、锌、锰、铜等17种矿质元素。以菌落形态特征、生长速度、目标产物为评价指标，获得了优良菌株AM-H。通过单因素实验和正交实验，以菌丝体得率为评价指标，筛选出成本低廉，工艺简单的黄绿蜜环菌菌丝体粉生产工艺，为黄绿蜜环菌菌丝体的规模化生产提供了基础资料，也为黄绿蜜环菌的进一步开发应用奠定基础。
图1是本发 明实施例提供的黄绿蜜环菌的深层发酵方法的流程图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。如图1所示，本发明实施例提供的黄绿蜜环菌的深层发酵方法包括以下步骤:SlOl:采集野生黄绿蜜环菌子实体，分离纯化菌种；S102:纯化的黄绿蜜环菌菌种进行优良菌种筛选；S103:筛选的优良菌种进行驯化培养；S104:驯化的黄绿蜜环菌菌种进行深层发酵生产；S105:从发酵液收集黄绿蜜环菌菌丝体。本发明实施例的黄绿蜜环菌的深层发酵方法具体步骤为:步骤一，从青海不同地区采集黄绿蜜环菌子实体，从子实体的菌褶和菌柄结合部位分离黄绿蜜环菌菌种(多采用组织分离法或孢子分离法)，用PDA培养基培养；对分离的菌种进行多次转接，纯化。组织分离法:从黄绿蜜环菌产区采集单生，个体健壮，特征典型的子实体，将子实体菌柄基部切除，在超净台内用75%酒精对子实体表面进行消毒，用经火焰灭菌的解剖刀于菌柄中部纵切，再将菌顺着长度掰开，用接种铲在菌盖与菌柄交界处切为3 7个小方块，随后挑取一小块组织，迅速移接到PDA平板培养基上，置24°C下培养，待组织块长出菌丝，转接至无污染后得到纯种。此分离法可以使后代保持原菌株的优良特性，不易发生变异，生活力更加旺盛。孢子分离法:选择单生，个体健壮，特征典型的子实体，将其浸入0.1 %升汞溶液中消毒约I分钟，用镊子取出后经无菌水冲洗数次，再用75%酒精棉球檫拭菌盖及菌柄，随后用无菌刀切掉多余菌柄(约留下Icm即可)，使菌柄朝下放入预先灭过菌的铺有无菌滤纸条的平皿上，盖上灭过菌的钟罩，将其放在温度为15 20°C的室内，经36小时后，可见到无菌滤纸上有微黄色的孢子印。无菌操作下把有孢子的滤纸条装入无菌的空试管中，真空干燥之后放入冰箱可长期保存备用。按无菌操作方法，取一小块具有孢子的滤纸条，放入装有无菌水的小三角瓶中充分摇匀得孢子悬浮液，再用已灭菌的试管，吸取孢子悬浮液，滴I滴到PDA平板培养基上，用玻璃涂布棒将平板上的悬浮液涂布均匀。孢子在培养基上经24°C恒温培养萌发后，挑选萌发快，长势旺的菌落，转接于新试管培养基上恒温培养即为母种。步骤二，利用PDA、综合马铃薯、查氏、玉米粉、蛋白胨-酵母膏-葡萄糖、黄豆饼粉-葡萄糖等培养基对纯化的菌种进行形态、生理生化特征检测，筛选出优良的目标菌株AM-H。利用多种培养基，可以从菌落形态、生长速度、产孢子时间等指标筛选出菌丝生长旺盛、繁殖快、适应性强的优良菌株。步骤三，对AM-H菌株进行多种碳源、氮源、C/N、无机盐、维生素的培养基组方和培养条件筛选、人工驯化，优选出最佳培养基组方:10 30%马铃薯浸提液、10 30% S 芽浸提液、5 10%葡萄糖、I 5%0KH2P04、1 5%0 MgSO4^0.1 1%。微量盐、0.1 lmg/L VB1'
0.1 lmg/L VB2, pH5.5 7.5，20 30°C培养。优化的培养基组方和培养条件能降低成本，提闻生广效率。步骤四，对上述驯化的AM-H菌株进行深层发酵，优选出发酵培养基组方:10 30%马铃薯浸提液、10 30%黄豆芽浸提液、0.1 lmg/L复合VB、pH5.5 7.5。发酵条件:5 30%接种量、50 250mL/500mL摇瓶装量、20 30°C摇床温度、50 250rpm摇床转速、7 20d发酵周期。科学的发酵培养基营养配比和发酵条件能降低生产成本，提高生产效率。`步骤五,对上述发酵液离心,离心速度为1000 3000rpm,时间为5 20min,得到
沉淀部分菌丝体；菌丝体用纯净水洗3 7次，真空冷冻干燥，温度为40 60°C。用纯净水洗涤菌丝体，可排除发酵液中营养成分的干扰；采用真空冷冻干燥法可避免高温加热对菌丝体有效成分的破坏。本发明还提供了上述黄绿蜜环菌菌丝体的应用，具体如下:本发明的黄绿蜜环菌菌丝体干燥后(或菌丝体连同发酵液经高压均质/膜分离后)可与食品/药品学上常用的辅料制备成饮料、口服液、调味品、特殊膳食食品、保健药膳
坐寸o所述辅料包含蔗糖、乳糖、木糖醇、甘露醇、蜂蜜、淀粉、蛋白质、琼脂等，根据食品/药品的类型的不同，可以按照现有的常规方法选择不同的辅料。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种黄绿蜜环菌的深层发酵方法，其特征在于，所述黄绿蜜环菌的深层发酵方法包括以下步骤: 采集野生黄绿蜜环菌子实体，分离纯化菌种； 纯化的黄绿蜜环菌菌种进行菌种筛选； 筛选的菌种进行驯化培养； 驯化的黄绿蜜环菌菌种进行深层发酵生产； 从发酵液收集黄绿蜜环菌菌丝体。
2.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌的深层发酵方法，其特征在于，所述采集野生黄绿蜜环菌子实体，分离纯化菌种的具体步骤为: 将子实体菌柄根部泥土剔除，装入无菌牛皮纸袋中，每袋装I个；在无菌条件下，从菌褶和菌柄结合部位用组织分离法或孢子分离法分离黄绿蜜环菌菌种，用PDA培养基培养；对分离的菌种进行转接、纯化。
3.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌的深层发酵方法，其特征在于，所述纯化的黄绿蜜环菌菌种进行菌种筛选的具体步骤为:对纯化的菌种进行形态、生理生化特征检测，筛选出目标菌株。
4.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌的深层发酵方法，其特征在于，所述筛选菌种进行驯化培养的具体步骤为: 对菌株进行多种碳 源、氮源、C/N、无机盐、维生素的培养基组方和培养条件筛选、人工驯化，选出最佳培养基组方:10 30%马铃薯浸提液、10 30%豆芽浸提液、5 10%葡萄糖、I 5%。KH2PO4U 5%0 MgSO4^0.1 1%。微量盐、0.1 lmg/L VB1^0.1 lmg/L VB2'pH5.5 7.5，20 30°C培养。
5.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌的深层发酵方法，其特征在于，所述驯化的黄绿蜜环菌菌种进行深层发酵生产的具体步骤为: 对驯化菌株进行深层发酵，优选出发酵培养基组方:10 30%马铃薯浸提液、10 30%黄豆芽浸提液、0.1 lmg/L复合VB、pH5.5 7.5 ;发酵条件:5 30%接种量、50 250mL/500mL摇瓶装量、20 30°C摇床温度、50 250rpm摇床转速、7 20d发酵周期。
6.如权利要求1所述的黄绿蜜环菌的深层发酵方法，其特征在于，所述从发酵液收集黄绿蜜环菌菌丝体的具体步骤为: 对黄绿蜜环菌发酵液进行离心，离心速度为1000 3000rpm，时间为5 20min，得到沉淀部分菌丝体；菌丝体用纯净水洗3 7次，真空冷冻干燥，温度为40 60°C。
7.—种如权利要求1所述的深层发酵方法制备的黄绿蜜环菌在饮料、口服液、调味品、膳食食品、保健药膳中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种黄绿蜜环菌的深层发酵技术及其应用，所述黄绿蜜环菌的深层发酵方法包括以下步骤采集野生黄绿蜜环菌子实体，分离纯化菌种；纯化的黄绿蜜环菌菌种进行优良菌种筛选；筛选的优良种菌进行驯化培养，培养基原料为可食用农产品，价廉安全；驯化的黄绿蜜环菌菌种进行深层发酵生产；从发酵液收集黄绿蜜环菌菌丝体。黄绿蜜环菌菌丝体含有丰富的氨基酸、蛋白质、多糖、生物碱等活性成分，具有广泛的药理活性和保健功能，可作为功能食品、保健品、药品的基料，用途广泛。本发明工艺流程简单，能耗低，设备投入小，生产成本低廉，易于工业化生产。
文档编号C05G1/00GK103190279SQ20131013898
公开日2013年7月10日 申请日期2013年4月22日 优先权日2013年4月22日
发明者王启兰, 党军, 王瑛, 梅丽娟, 陶燕铎, 邵赟 申请人:中国科学院西北高原生物研究所