一种原位膀胱癌动物模型以及鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及一种原位膀胱癌动物模型，所述的动物模型的建立方法为：SD大鼠膀胱内灌注20mg/mL致癌剂MNU溶液诱发膀胱癌，每次灌注0.1mL，每周灌注1次，共6次。本发明优点在于：为原位膀胱癌动物模型提供了一种新的构建方法；提供了一种新的通过活体检测膀胱癌建模的方法，可剔除不利于进一步体内实验的肿瘤模型，同时可利用CT扫描来评估膀胱癌动物模型治疗前后的效果；通过CT扫描诊断大鼠原位膀胱癌的方法更加灵敏、准确率更高、更直接方便，为进一步动物模型的实验研究提供便利。
【专利说明】一种原位膀胱癌动物模型以及鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物模型领域，具体地说，是一种原位膀胱癌动物模型以及鉴定方法。
【背景技术】
[0002]在我国，膀胱肿瘤是泌尿系统高发的肿瘤，建立膀胱癌动物模型对于研究人类膀胱癌有重要意义。国内外已有研究和报道证实N-甲基亚硝基脲(N-methyl nitrosourea,MNU)可作为化学致癌剂用于建立原位膀胱癌动物模型。但模型建立后只能通过处死大鼠进行病理学诊断以判断模型是否成功建立，从而无法对建模后的动物进行下一步的体内实验。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种原位膀胱癌动物模型。
[0004]本发明的再一的目的是，提供一种原位膀胱癌动物模型的建立方法。
[0005]本发明的另一的目的是，提供一种原位膀胱癌动物模型的鉴定方法。
[0006]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:一种原位膀胱癌动物模型，所述的动物模型的建立方法为:SD大鼠膀胱内灌注20mg/mL致癌剂MNU溶液诱发膀胱癌，每次灌注
0.lmL，每周灌注I次,共6次。
[0007]所述的动物模型的建立方法包括以下步骤:
a)SD大鼠用2% 50mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，麻醉起效后仰卧固定；
b)75%酒精消毒会阴部；
c)取大鼠导尿管，石蜡油润滑后，从尿道外口插入，经尿道置入膀胱，进入膀胱后可见尿液从导尿管流出；
d)抽尽膀胱内尿液，注入20mg/mL的MNU溶液0.1mL ；
e)拔除导尿管，大鼠平卧，等待麻醉清醒。
[0008]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:一种原位膀胱癌动物模型的建立方法，所述的动物模型的建立方法为:SD大鼠膀胱内灌注20mg/mL致癌剂MNU溶液诱发膀胱癌，每次灌注0.1mL,每周灌注I次，共6次。
[0009]所述的动物模型的建立方法包括以下步骤:
a)SD大鼠用2% 50mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，麻醉起效后仰卧固定；
b)75%酒精消毒会阴部；
c)取大鼠导尿管，石蜡油润滑后，从尿道外口插入，经尿道置入膀胱，进入膀胱后可见尿液从导尿管流出；
d)抽尽膀胱内尿液，注入20mg/mL的MNU溶液0.1mL ；
e)拔除导尿管，大鼠平卧，等待麻醉清醒。
[0010]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:所述的原位膀胱癌动物模型的鉴定方法，所述的鉴定方法是对大鼠进行膀胱CT扫描。
[0011]包括以下步骤:
a)膀胱灌注后第7周，对大鼠进行膀胱CT扫描，膀胱CT扫描方法如下:
b)SD大鼠用2% 50mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，麻醉起效后仰卧固定；
c)经尿道膀胱内置入导尿管，注入l_2mL生理盐水，以充盈膀胱，注入生理盐水后，用丝线轻轻结扎尿道外口，以防膀胱内液体溢出；
d)GElight speed 16层螺旋CT对大鼠下腹部进行扫描，扫描层厚1.25mm ;
e)扫描结束后，抽出膀胱;内液体。
[0012]本发明优点在于:
1、为原位膀胱癌动物模型提供了一种新的构建方法；
2、提供了一种新的通过活体检测膀胱癌建模的方法，可剔除不利于进一步体内实验的肿瘤模型，同时可利用CT扫描来评估膀胱癌动物模型治疗前后的效果；
3、通过CT扫描诊断大鼠原位膀胱癌的方法更加灵敏、准确率更高、更直接方便，为进一步动物1吴型的实验研究提供便利。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1.经尿道膀胱内置管灌注。
[0014]A:雌性SD大鼠会阴部矢状面示意图。B:经尿道膀胱内置管示意图:大鼠平卧固定，向头侧推移下腹部皮肤(红色箭头)以牵拉尿道外口向上前倾，充分暴露尿道外口 ；蘸有石蜡油的导尿管紧贴尿道外口后壁缓缓插入(蓝色箭头)，导尿管与水平成角α〈45度；当遇到阻力时停止插入，松开推移的皮肤，向尾侧旋转导尿管方向，使导尿管方向接近水平(黑色箭头)，再缓缓插入，进入膀胱时有突破感，插入导尿深度2.5_3cm。若旋转导尿管方向后仍有阻力，应立即拔出导尿管改变α角度重复上述步骤。C:导尿管插入尿道外口。D:导尿管进入膀胱，抽出淡黄色尿液。
[0015]图2.膀胱灌注7周后大体观。
[0016]A:正常大鼠膀胱，粘膜光滑，壁薄，厚度均匀，血管纹理清晰，未见肿块新生物等。B:诱癌大鼠膀胱，可见较大的菜花样肿块生长，膀胱粘膜粗糙，局部有出血、坏死组织。C:诱癌大鼠膀胱，粘膜不规则增厚，并有小颗粒状新生物，局部出血、坏死组织，下方为一结石。D:诱癌大鼠肾脓肿，肾实质内多发黄白色脓肿，肾结构遭破坏。
[0017]图3.大鼠膀胱CT扫描结果。
[0018]A:正常大鼠膀胱壁薄，光滑，厚度均一，膀胱内水密度影均一，无异常密度影。B:诱癌大鼠，膀胱壁米粒样突起肿块。C:诱癌大鼠，膀胱壁大块菜花样肿块。D:诱癌大鼠，膀胱后壁明显增厚，膀胱内有絮状飘浮物。
[0019]图4.病理组织学结果
A:Χ200。正常大鼠膀胱粘膜，细胞呈扁平状，大小均一，排列有序，核圆，规则。B:Χ200。诱癌大鼠膀胱粘膜，移行上皮细胞大小不一，细胞层数明显增多，排列紊乱，极向消失，核大不规则，核染色质为颗粒状，分布不均匀，核膜增厚，核仁肥大，核浆比例增大，核分裂像明显。C:X100。肾皮质内多灶性炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主，组织出现变性坏死。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0021]实施例1
一、实验材料 1.实验动物
SD大鼠:SPF级SD大鼠，雌性，10-12周龄，体重200g土 10g，购自中国科学院上海实验动物中心。
[0022]2.主要试剂和材料
N-甲基亚硝基脲(MNU)粉剂=Sigma公司，美国枸橼酸钠粉剂:中国医药集团上海化学试剂公司，中国戍巴比妥粉剂:Serva公司，德国 3.主要仪器
A08120旋转石腊切片机:Leica Microtomes公司，德国
Leica Η?1210摊片机:Leica公司，德国
Beckman Φ32 PH 计:Beckman 公司，美国
Sartorius BP211D 电子天平:Sartorius,德国
Nikon E600光学显微镜:Nikon公司，日本
Nikon DXM 1200F高清晰彩色病理图象系统:Nikon公司，日本
Light speed 16层螺旋CT机:GE公司，美国
二、实验方法
1.动物的饲养
所有SD大鼠饲养在医院动物实验中心SPF级动物实验室，由专门的动物实验技术员进行管理，常规饮食，12h昼夜节律，湿度50-60%，温度24-26 °C。
[0023]2.灌注方案
35只SD大鼠膀胱内灌注致癌剂MNU溶液(20mg/mL)诱发膀胱癌。每次膀胱内灌注上述溶液0.1mL,每周灌注I次，共6次。
[0024]3.MNU溶液的配置
3.1.将Sigma公司原装的MNU粉剂(1.0g/瓶)用避光玻璃瓶分装为200mg/瓶，密闭4°C冰箱保存；
3.2.枸橼酸缓冲液的配置:枸橼酸钠4.2g，氢氧化钠2.lg，加去离子水240mL，振荡溶解，用5mol/L浓盐酸调节PH值至6.0,再加去离子水至250mL,配置成0.lmmol/L的枸橼酸缓冲液；
3.3.临膀胱灌注前，取一瓶分装的MNU粉剂，加入0.lmmol/L的枸橼酸缓冲液1mL中，振荡溶解，配置成20mg/mL的MNU溶液。
[0025]4.经尿道膀胱内灌注
4.1.SD大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉(50mg/kg)，麻醉起效后仰卧固定；
4.2.75%酒精消毒会阴部；
4.3.取自制的大鼠导尿管，石蜡油润滑后，从尿道外口插入，经尿道置入膀胱，进入膀胱后可见尿液从导尿管流出。见图1 ; 4.4.抽尽膀胱内尿液，A、B组大鼠分别注入生理盐水0.1mL或20mg/mL的MNU溶液
0.1mL ；
4.5.拔除导尿管，大鼠平卧，等待麻醉清醒，注意防止窒息。
[0026]5.大鼠膀胱CT扫描
5.1.膀胱灌注后第7周，对大鼠进行膀胱CT扫描。膀胱CT扫描方法如下:
5.2.SD大鼠用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉(50mg/kg)，麻醉起效后仰卧固定；
5.3.如前述方法经尿道膀胱内置入导尿管，注入l_2mL生理盐水，以充盈膀胱，注入生理盐水后，用丝线轻轻结扎尿道外口，以防膀胱内液体溢出；
5.4.GE light speed 16层螺旋CT对大鼠下腹部进行扫描，扫描层厚L 25mm ；
5.5.扫描结束后，抽出膀胱内液体。
[0027]6.病理组织学检查
膀胱灌注后第7周，处死大鼠，取出膀胱及腹腔内肉眼所见有病变的组织，10%甲醛溶液固定。
[0028]6.1.石蜡切片的制作
6.1.1.取出10%甲醛溶液固定的组织，依次经70%、80%、90%酒精各脱水lh，95%和无水酒精各脱水45min ；
6.1.2.置100% 二甲苯I中10min，100% 二甲苯II中20min透明，达到在日光下观测组织均质透明；
6.1.3.将透明好的组织置入已在温箱(60°C)内熔化的石蜡内3h ；
6.1.4.将熔化的石蜡倒入包埋器内，将浸透蜡的组织放入包埋器，冷却；
6.1.5.以6μπι厚度在切片机中切片，将切下的蜡片置于载玻片上，放入60°C烤片箱20mino
[0029]6.2.苏木素-伊红染色(HE染色)
6.2.1.将干燥的切片放入100% 二甲苯I中lOmin，100% 二甲苯II中1min脱蜡；
6.2.2.置入无水酒精2次，各2min，再依次经95%、90%、80%、70%酒精，各2min，蒸馏水浸洗3min ；
6.2.3.置入苏木素染液浸染5-10min ；
6.2.4.自来水冲洗切片至蓝色,再用1%盐酸乙醇溶液分色，再用自来水冲洗1min ；
6.2.5.置入1%伊红水溶液浸染5-10min ；
6.2.6.蒸馏水冲洗，再依次经70%、80%、90%、95%和无水酒精2次脱水，每次2min ；
6.2.7.置 100% 二甲苯 1、100% 二甲苯 II 中各 2min ；
6.2.8.中性树脂封固。
[0030]6.3.光学显微镜观察及拍摄组织学图片
Nikon E600光学显微镜观察，Nikon DXM 1200F高清晰彩色病理图象系统摄片。
[0031]三、结果
1.一般情况
大鼠一般于麻醉后2小时左右开始苏醒，并逐步恢复排尿，4小时能够恢复活动。整个建模过程中，大鼠死亡4只。
[0032]2.大体观 31只大鼠膀胱粘膜均出现异常，其中，17只出现膀胱粘膜菜花样肿块(图2-B)，14只出现粘膜不规则增厚，并有小颗粒状新生物(图2-C)。3只大鼠出现了膀胱或输尿管结石，7只大鼠出现肾盂或输尿管积水，3只大鼠出现肾脓肿(图2-D)或膀胱积脓。
[0033]3.膀胱CT扫描结果
膀胱生理盐水充盈后CT平扫显示良好。如图3所示，正常大鼠膀胱壁薄，光滑，厚度均一，膀胱内水密度影均一，无异常密度影(图3-A);诱癌大鼠膀胱均出现不同程度影像学异常表现，如米粒样突起肿块(图3-B)、大块的菜花样肿块(图3-C)、膀胱壁明显增厚，絮状物飘浮(图3-D)等。
[0034]4.病理组织学结果
组织经固定、石蜡常规包埋切片、HE染色，光镜下观察，如图3所示，A正常大鼠膀胱粘膜为3-4层移行上皮细胞组成，细胞呈扁平状，大小均一，排列有序，核圆，规则，核浆比1:4-6，由内向外依次为粘膜层、固有层、肌层和浆肌层(图3-A)。诱癌大鼠膀胱新生物经病理组织学检查，均诊断为膀胱移行细胞癌。镜下见膀胱粘膜表现为移行上皮细胞大小不一，细胞层次明显增多，排列紊乱，极向消失，核大不规则，核染色质为颗粒状，分布不均匀，核膜增厚，核仁肥大，核浆比例增大，核分裂像明显(图3-B)。取多个有病变器官、组织进行病理学检查，均为炎性浸润，图3-C为肾脓肿病理表现，未见远处癌转移灶。
[0035]结论:本发明可以成功地建立一种大鼠原位膀胱癌模型，CT扫描可以准确鉴定大鼠膀胱内是否有肿瘤形成，并与病理结果相一致。本发明是一种较为简单、快速、安全地建立大鼠原位膀胱癌模型的方法，且CT扫描可以无损伤地鉴定建模是否成功，剔除不利于后续实验的动物，并可以为后续治疗效果作动态观察。
[0036]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种原位膀胱癌动物模型，其特征在于，所述的动物模型的建立方法为:SD大鼠膀胱内灌注20mg/mL致癌剂MNU溶液诱发膀胱癌，每次灌注0.1mL,每周灌注I次，共6次。
2.根据权利要求1所述的动物模型，其特征在于，所述的动物模型的建立方法包括以下步骤: a)SD大鼠用2% 50mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，麻醉起效后仰卧固定； b)75%酒精消毒会阴部； c)取大鼠导尿管，石蜡油润滑后，从尿道外口插入，经尿道置入膀胱，进入膀胱后可见尿液从导尿管流出； d)抽尽膀胱内尿液，注入20mg/mL的MNU溶液0.1mL ； e)拔除导尿管，大鼠平卧，等待麻醉清醒。
3.一种原位膀胱癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述的动物模型的建立方法为:SD大鼠膀胱内灌注20mg/mL致癌剂MNU溶液诱发膀胱癌，每次灌注0.1mL,每周灌注I次，共6次。
4.根据权利要求1所述的动物模型的建立方法，其特征在于，所述的动物模型的建立方法包括以下步骤: a)SD大鼠用2% 50mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，麻醉起效后仰卧固定； b)75%酒精消毒会阴部； c)取大鼠导尿管，石蜡油润滑后，从尿道外口插入，经尿道置入膀胱，进入膀胱后可见尿液从导尿管流出； d)抽尽膀胱内尿液，注入20mg/mL的MNU溶液0.1mL ； e)拔除导尿管，大鼠平卧，等待麻醉清醒。
5.根据权利要求1所述的原位膀胱癌动物模型的鉴定方法，其特征在于，所述的鉴定方法是对大鼠进行膀胱CT扫描。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤: a)膀胱灌注后第7周，对大鼠进行膀胱CT扫描，膀胱CT扫描方法如下: b)SD大鼠用2% 50mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，麻醉起效后仰卧固定； c)经尿道膀胱内置入导尿管，注入l_2mL生理盐水，以充盈膀胱，注入生理盐水后，用丝线轻轻结扎尿道外口，以防膀胱内液体溢出； d)GElight speed 16层螺旋CT对大鼠下腹部进行扫描，扫描层厚1.25mm ; e)扫描结束后，抽出膀胱;内液体。
【文档编号】A61D7/00GK104173115SQ201310196327
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月24日 优先权日:2013年5月24日
【发明者】潘春武, 齐隽 申请人:上海交通大学医学院附属新华医院