专利名称：一种借助于光源控制进行桔梗快繁的方法
技术领域：
本发明涉及一种借助于光源控制进行桔梗快繁的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
植物组织培养中使用的光源一般是荧光灯，但是耗电量大，发射光谱不能很好地与植物的光合作用吸收光谱相吻合，含有很多不必要的波长，光效很低；而且产生很多的热辐射，不能对植物接近照射，对植物生长光激励效率不高，使用寿命也不长。同传统的光源相比，近年来发光二极管(LED)作为一种可用于植物照射的新型半导体光源日益受到关注。LED的基本结构是一块电致发光的半导体材料，置于一个有引线的架子上，四周用环氧树脂密封，起到保护内部芯线的作用。LED波宽窄，光色纯，波长种类丰富，与植物光合作用和形态建成的光谱范围吻合。LED还具有较小的质量和体积、较长的寿命，调节其频率和占空比可以节省能源和提高光合效率。由于这些显著的特征，LED近年来在植物组织培养中受到越来越多的青睐。LED用于植物组织培养光源具有以下优势:LED光输出半宽窄，接近单色光，单独使用或组合使用均可，使用LED可以集中特定波长的光均衡地照射作物，不仅可以调控碳氮代谢等生理活动从而调节株高干鲜重等形态指标，还能调节植株叶片气孔开度，根系活力等生理活动，为得到健壮组培苗移栽作准备。另外植物组培中应用的LED属于冷光源，光照系统发热少，实现了低热负荷，可以置于离植物很近的地方而不会把植物烤伤；LED形状极小，可以将不同波长的LED组合制备成多种比例多种形状的器件，占用空间小，安装方便，方便筛选出适合特定品种植物的特定光源；另外，其较强的耐用性也降低了运营成本。桔梗(Platycodon grandif1rum)属桔梗科、多年生草本植物,有白色乳汁。根圆锥形，茎直立，基部叶轮生或对生。具有镇咳与祛痰之功效。其花蕾、花朵形状独特，颜色艳丽，颇具观赏性；根含有多种皂苷，具宣肺、散寒、祛痰、排脓等功效；根和嫩叶还可加工食用。桔梗是集赏、食、药为一身的`多用途经济植物，具有极大的开发利用价值。一般常用种子繁殖或埋根繁殖，但是种子繁殖过程中，会产生品质退化、变异等现象，且当年生苗长势弱，无法形成较高的产量，在长期的埋根的营养繁殖过程中，会受到病毒感染，产量下降。本方法探索了桔梗组培苗快繁光源的筛选，建立了完整可行的试验方法，操作步骤简单，试验效果稳定、清晰，因此无论是在科研、检测以及学生试验中都能得到很好的应用。
发明内容
为解决上述问题，我们以桔梗种发无菌壮苗为材料，进行光质处理，得到最适合桔梗组培苗生理生长的最优光谱能量分布，以期为桔梗的种质资源保存、新品种开发和推广以及工厂化生产提供技术支持。本发明的目的在于提供借助于光源控制的一种较有效的桔梗组培苗快繁技术。—种借助于光源控制进行桔梗快繁的技术，包括以下步骤:
(I)外植体的制备:选取桔梗种子，清洗、消毒，种子接种到MS培养基上培养得到组培苗，将组培苗上的茎段转接到新的MS培养基上，先在黑暗下培养，然后转入白色荧光灯下培养，得到10 15 mm长、带有两片真叶的茎段；(2)光质处理:选取步骤(I)得到的茎段接种在1/2MS + 0.1 mg/1 NAA的培养基上，先在黑暗下培养4 7天，然后转入LED光源下培养35 45天，得到健壮的桔梗组培苗植株，其中所述LED光源为红光或蓝光的一种或两种不同比例的组合光,培养条件:光强45 55μπιο1.πΓ2.s'光周期为8 12小时，温度25±2°C。所述步骤(I)清洗消毒过程具体如下:桔梗种子先用水冲洗2 3个小时，然后在超净工作台中依次用75%的酒精消毒20 30秒，15%的次氯酸钠消毒10 15分钟，15%的双氧水消毒10 15分钟,最后用无菌水冲洗5 6次。步骤(I)中所述茎段在黑暗下培养4 7天；所述茎段在白色荧光灯下培养的培养条件:光强45 55μπιο1.πΓ2.s—1，光周期为8 12小时，温度25±2°C。所述LED光源为单色蓝光(B)、单色红光(R)、蓝红比5:3(蓝光和红光组合比例5:3/BR53)、蓝红比1:1(蓝光和红光组合比例1:1/BR11)或蓝红比3:5(蓝光和红光组合比例3:5/BR35)，优选蓝红比5:3。所述光源是一个47.5X50cm的长方形灯板，在所述长方形灯板的长度方向上设置20个发光套组，在所述长方形灯板的宽度方向上设置19个发光套组，所述每个发光套组由三个发光二极管组成。
所述LED光源受一个可调恒流驱动电源控制，通过调控电流来调控光强。本发明的有益效果:本发明提供了一种借助于光源控制进行桔梗快繁的技术。本发明方法具有以下优点:1)操作简单，效果好；2)节省能源环保；3)植株生长快速健壮。本发明方法和结果为开展与桔梗组培苗快繁有关的生物学研究和开发提供了新的途径和依据。
图1，不同光源对桔梗组培苗整株鲜重的影响。图2，不同光源对桔梗组培苗整株干重的影响。图3，不同光源对桔梗组培苗倒三叶叶片干重的影响。图4，不同光源对桔梗组培苗倒三叶叶面积的影响。图5，不同光源对桔梗组培苗茎长的影响。图6，不同的光源处理对桔梗组培苗VC含量的影响。图7，不同的光源处理对桔梗组培苗根系活力的影响。图8,不同的光源处理对桔梗气孔形态的影响。图8中，Sto代表气孔，Ep代表表皮细胞。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分含量如无特别说明均为体积百分含量。1、首先用本发明方法，借助于LED光源对桔梗(生产用种)进行快繁处理，包括以下两步骤:(I)外植体的制备:选取干净饱满色泽较亮的桔梗种子，先用水冲洗2个小时，然后在超净工作台中用75%酒精消毒30秒，15%的次氯酸钠消毒15分钟，15%的双氧水消毒15分钟，无菌水冲洗5次，种子接种到MS培养基上；30天后，组培苗上的茎段转接到新的MS培养基上，黑暗下培养5天后,转入白色突光灯下培养,培养条件:光强50 μ mol.πΓ2.s_1,光周期为12小时，温度25±2°C，得到15 mm长、带有两片真叶的茎段；(2)光质处理:选取步骤(I)得到的茎段接种在1/2MS + 0.1 mg/1 NAA的培养基上，先在黑暗下培养5天，然后转入单色蓝光(B)、蓝红比5:3(BR53)、蓝红比5:5(BR55)、蓝红比3:5 (BR35)、单色红光(R)的LED光源下培养40天，白色荧光灯(FL)作为对照，培养条件:光强50 μ mol.m_2.s_\光周期为12小时，温度25±2°C，得到桔梗组培苗植株。2、光源:所述光源是一个47.5 X 50cm的长方形灯板，在所述长方板灯板的长度方向上设置20个发光套组，在所述长方板灯板宽度方向设置19个发光套组，所述每个发光套组由三个发光二极管组成，可以根据不同的光源要求调节灯的组成，光强，光质比例。所述LED光源受一个可调恒流驱动电源控制，通过调控电流来调控光强。3、处理效果3.1不同光源处理对桔梗组培苗形态的影响见图1、图2，蓝红比5:3LED处理下桔梗组培苗整株鲜重和干重与其它LED光源处理及白色荧光灯对照相比，无显著差异。见图3，蓝光LED处理下倒三叶叶片干重显著高于其他处理，蓝红比5:3次之，与其它LED光源处理无显著差异。见图4，蓝光LED处理下倒三叶叶面积最大，蓝红比5:3LED次之，均显著高于其它LED光源处理及白色荧光灯对照。见图5，所有处理中株高无显著差异，但是蓝红比5:3LED和蓝红比1:1LED处理下桔梗组培苗株高最高。结果说明，蓝红比5:3LED处理下植株生长较为快速和健壮。3.2不同光源处理对桔梗组培苗VC含量的影响见图6，桔梗组培苗VC含量在蓝红比5:3LED下最高，白色荧光灯对照下最低，其它处理处于中间值。因此，蓝红比5:3LED有利于提高桔梗组培苗中的VC含量。3.3不同光源处理对桔梗组培苗根系活力的影响见图7，桔梗组培苗根系活力在蓝红比5:3LED下最大，蓝光LED下次之，显著高于其它LED处理及白色荧光灯对照。因此，蓝红比5: 3LED有利于提高桔梗组培苗的根系活力。3.4不同光源处理对桔梗组培苗气孔特性的影响见图8和表3，桔梗组培苗气孔频度在蓝红比1:1LED下最大，在红光LED、蓝红比5:3LED、蓝光LED、蓝红比3:5LED下依次减小，在白色荧光灯对照下最小。气孔面积在蓝红比3:5 LED下最大，在蓝光LED、蓝红比5: 3LED、红光LED下依次减小，在蓝红比1:1LED下最小。气孔长宽比在蓝红比1:1LED和红光LED下最大，气孔呈异常的扁圆形，气孔长宽比在蓝红比3:5LED下最小，气孔呈异常的近圆形，而白色荧光灯对照、蓝光LED、蓝红比5:3LED下气孔长宽比处于中间值，呈具有正常功能的椭圆形。以上结果说明，蓝红比5:3LED有利于桔梗组培苗气孔的正常发育。3.5不同光源处理对桔梗组培苗碳氮代谢的影响 见表I，红光LED下可溶性糖含量最高，显著高于其它LED处理和白色荧光灯对照，其它LED光源处理间 无显著差异。所有处理中游离氨基酸含量无显著差异，蓝光LED、蓝红比5:3LED下略高。可溶性蛋白含量在蓝光LED、蓝红比1:1 LED下最高，显著高于其它处理，蓝红比5:3下略低。综上所述，蓝红比5:3LED下碳氮代谢水平较高。3.6不同光源处理对桔梗组培苗叶片解剖结构的影响见表2，蓝光LED下桔梗组培苗叶片厚度最大，蓝红比5:3LED和蓝红比1:1LED下次之，蓝红比3:5LED下最低，其它LED光源处理处于中间值。栅栏组织长度在蓝光LED下最大，白色荧光灯对照和蓝红比5:3LED下次之，蓝红比3:5LED下最低。蓝红比5:3 LED下具有最大的海绵组织厚度，蓝光LED下次之，显著高于其它LED处理和白色荧光灯对照。在许多植物的叶片中，栅栏细胞含有叶绿体总数的大约70%，并且超过海绵细胞大约一到两倍。栅栏组织促使光更好地集中到叶绿体上，而海绵组织通过散射光从而提高了光捕获能力。所以较大的栅栏组织和海绵组织厚度保证了较高的光合作用能力。因此蓝光LED、蓝红比5:3 LED下桔梗组培苗叶片解剖结构发育较好。3.7不同光源处理桔梗组培苗的效果蓝红比5:3LED处理下，桔梗组培苗的叶片大而厚，发育良好，光合能力强，叶干重、整株干鲜重较大，植株生长健壮；可溶性糖、游离氨基酸、可溶性蛋白含量较高，根系活力最高，VC含量最高。总之，蓝红比5:3LED处理下，桔梗组培苗生长快速、健壮，各项生理生化指标基本都要高于对照白色荧光灯处理，因此，蓝红比5:3 LED可以作为桔梗组培苗生产的替代光源。红蓝LED组合光源，可以综合红光和蓝光的优点，弥补单色光的缺点，可以作为桔梗组培苗培养的首选光源。表1.不同光源对桔梗组培苗碳氮代谢的影响
权利要求
1.一种借助于光源控制进行桔梗快繁的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)外植体的制备选取桔梗种子，清洗、消毒，种子接种到MS培养基上培养得到组培苗，将组培苗上的茎段转接到新的MS培养基上，先在黑暗下培养，然后转入白色荧光灯下培养，得到10 15 mm长、带有两片真叶的茎段； (2)光质处理选取步骤(I)得到的茎段接种在1/2MS+ O. I mg/1 NAA的培养基上，先在黑暗下培养4 7天，然后转入LED光源下培养35 45天，得到健壮的桔梗组培苗植株，其中所述LED光源为红光或蓝光的一种或两种不同比例的组合光,培养条件光强45 55 μ mo I · πΓ2 · s—1，光周期为8 12小时，温度25±2°C。
2.根据权利要求I所述的借助于光源控制进行桔梗快繁的方法，其特征在于所述步骤(I)清洗消毒过程具体如下桔梗种子先用水冲洗2 3个小时，然后在超净工作台中依次用75%的酒精消毒20 30秒，15%的次氯酸钠消毒10 15分钟，15%的双氧水消毒10 15分钟，最后用无菌水冲洗5 6次。
3.根据权利要求I所述的借助于光源控制进行桔梗快繁的方法，其特征在于步骤(I)中所述茎段在黑暗下培养4 7天；所述茎段在白色荧光灯下培养的培养条件光强45 55 μ mo I · πΓ2 · s—1，光周期为8 12小时，温度25±2°C。
4.根据权利要求I所述的借助于光源控制进行桔梗快繁的方法，其特征在于所述LED光源为单色蓝光、单色红光、蓝红比5 :3、蓝红比I :1或蓝红比3 :5。
5.根据权利要求4所述的借助于光源控制进行桔梗快繁的方法，其特征在于所述LED光源为蓝红比5 :3。
6.根据权利要求I所述的借助于光源控制进行桔梗快繁的方法，其特征在于所述光源是一个47. 5 X 50cm的长方形灯板，在所述长方形灯板的长度方向上设置20个发光套组，在所述长方形灯板的宽度方向上设置19个发光套组，所述每个发光套组由三个发光二极管组成。
7.根据权利要求I或6所述的借助于光源控制进行桔梗快繁的方法，所述LED光源受一个可调恒流驱动电源控制，通过调控电流来调控光强。
全文摘要
本发明公开了一种借助于光源控制进行桔梗快繁的方法，包括以下步骤(1)选取桔梗种子，清洗、消毒，种子接种到MS培养基上得到组培苗，将组培苗上的茎段转接到新的MS培养基上，黑暗下培养后转入白色荧光灯下培养，得到10～15 mm 长、带有两片真叶的茎段；(2)选取步骤(1)得到的茎段接种在1/2MS + 0.1 mg/l NAA的培养基上，黑暗下培养5～7天后，转入LED光源下培养35～45天，得到桔梗组培苗植株，所述LED光源为红光或蓝光的一种或两种不同比例的组合光，光强45～55μmol·m-2·s-1，光周期为8～12小时，温度25±2℃。本发明方法操作简单、植株生长快速健壮，节省环保。
文档编号A01H4/00GK103250646SQ201310206548
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月29日 优先权日2013年5月29日
发明者徐志刚, 刘梦溪 申请人:南京农业大学