一个白粉病抗性相关蛋白及其编码基因和其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种白粉病抗性相关蛋白AT5G05190及其编码基因与应用。该蛋白AT5G05190,是具有下述氣基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQIDNs.2的氨基酸残基序列;2)将序列表中的SEQIDNs.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由1)衍生的蛋白质。降低植物中本发明蛋白或其编码基因的表达，可实现植物对病原菌抗性的提高和品种的改良，对农业生产具有重要的理论和现实意义。
【专利说明】一个白粉病抗性相关蛋白及其编码基因和其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，涉及一种白粉病抗性相关蛋白及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 植物生长在自然界中，受到各种植物病害的威胁。识别和抵抗病原菌的侵染对于 多细胞生物的存活是至关重要的（Aderem and Ulevitch，2000)。动物中的受体如Toll样 受体，对病原菌配体的识别就可以诱导先天性免疫反应。植物不同于动物，由于缺乏可移动 的保卫细胞（如巨噬细胞和粒细胞）和适应性的免疫系统（如产生抗体的B淋巴细胞），所 以只能依赖每个细胞自身的先天免疫系统和局部抗病反应引发的整个植株非感染组织抵 抗广谱病原菌随后的侵染（Cao et al.，1997)。
[0003] 植物为了适应环境，也逐渐形成了类似于动物的多层次的防御体系，形成了自己 的先天免疫系统（innate immunity)。它主要包括基础抗性（basal immunity)和R基因介 导的抗性（R gene-mediated immunity) (Chisholm et al.，2006)。
[0004] 基础抗性又名基于病原相关分子模式激发的抗性（Pathogen-associated molecular pattern Triggered Immunity, PTI)。主要是利用寄主细胞膜上的模式识别受 体（PRRs，Pattern recognition receptors)识别病原菌的 PAMPs(Pathogen_associated molecular patterns) /MAMPs (Microbe-associated molecular patterns)，进而激活下游 的丝裂原激活蛋白激酶（MAPKs，Mitogen_activated protein kinases)的级联信号通路或 者是1丐依赖性蛋白激酶（<3^1^，〇31(3；[11111(16。6116(161^口1'(^6；[111^311868)，最终将信号传递 入核，激活转录因子蛋白从而诱导病程相关基因 PR基因的表达、活性氧（Reactive Oxygen Species,R0S)的产生和葡聚糖（callose)在侵入点的积累，引发植物的抗病反应抗拒各种 病原菌（Tena et al.，2011)。
[0005] 在寄主进化出PTI之后，病原菌也相应的产生了新的致病机制。例如，一些病原菌 利用自身的 III 型分泌系统（Type III Secretion System, TTSS)或者吸器（haustoria) 使效应因子进入寄主细胞并抑制PTI，从而能有效地侵染植物，促进自身的生长和繁衍，即 效应因子触发的感病性（ETS，Effector-Triggered Susceptibility) (Jones and Dangl, 2006)。
[0006] 为了防御病原菌的侵染，植物进化出了 R基因 （Resistance gene), R基因的产物 可特异地识别病原菌的效应蛋白（Flor，1971)，并激活下游的免疫反应，诱导产生过敏反 应（Hypersensitive Response, HR)来限制病原菌的生长和蔓延，即第二道防御系统R基 因介导的抗性，或者叫做效应因子激发的免疫反应（Effector Triggered Immunity，ETI) (Chisholm et al. ，2006)。
[0007] 尽管已经发现了很多蛋白在植物抗病中起重要作用。但是，在植物抗病网络的很 多蛋白组分还不为人知。通过遗传学，生物化学，细胞生物学，基因组学等的方法，可以有效 的寻找抗病反应中新的蛋白组分。而遗传学的方法被证明非常行之有效，很多抗病相关的 蛋白的编码基因都是通过遗传学的方法分离克隆得到。
[0008] 白粉菌广泛分布于世界各地且侵染的宿主众多，包括小麦、大麦、葡萄和月季等多 种粮食作物、经济作物和花卉植物。白粉菌感染的植物生长发育会受到极大的影响，造成植 株的减产甚至枯死。故对白粉病抗性的研究不仅具有重要的理论价值，对发展农业生产也 有重要意义。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种白粉病抗性相关蛋白AT5G05190及其编码基因与应用。 AT5G05190 蛋白来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana)。
[0010] 本发明所提供的蛋白，是如下1)或2)的蛋白：
[0011] 1)序列表中的SEQ ID Ns . 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0012] 2)将序列表中的SEQ ID Ns . 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由1)衍生的蛋白质。
[0013] 本发明所提供的编码基因具有下述核苷酸序列之一：
[0014] 1)序列表中SEQ ID Ns :1的第1498-3520位所示的核苷酸序列；
[0015] 2)编码序列表中SEQ ID N2 :2蛋白质序列的多核苷酸序列；
[0016] 3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID N2 :1限定的DNA序列杂交的核苷酸序 列；
[0017] 4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性。
[0018] 上述高严谨条件可为用6 X SSC，0. 5 % SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2 X SSC， 0· 1 % SDS 和 I X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0019] 本发明的还一个目的是提供包含所述编码基因的表达盒。所述表达盒具有SEQ ID N2 :1的第10-4741位所示的核苷酸序列。
[0020] 本发明的又一个目的是提供所述蛋白、所述编码基因或所述表达盒在使植物的白 粉病抗性增强中的应用。
[0021] 本发明的再一个目的是提供所述蛋白、所述编码基因或所述表达盒在培育白粉病 抗性增强植物中的应用。
[0022] 具体的，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
[0023] 本发明通过图位克隆的方法在拟南芥中分离得到一个与白粉病抗性相关的基 因。该基因编码区总共有1848个核苷酸组成，两个外显子。它的序列如SEQ ID No. 1的第 1498-1618位和第1794-3520位核苷酸所示。所述基因编码的蛋白共有615个氨基酸组成。 它的序列如SEQ ID No. 2所示。
[0024] 上述培育白粉病抗性增强植物（如拟南芥）的方法，具体是将基因的功能丧失，使 植物（如拟南芥）对白粉病的抗性增强。
[0025] 可通过T-DNA (或者是类似如，TALEN和RNA干扰）技术降低内源所述基因的表达。
[0026] 利用RNA干扰或定点敲除技术或TALEN技术降低作物中本发明基因的表达，可实 现作物对病原菌抗性的提高和品种的改良，所以本发明基因和蛋白对农业生产具有重要意 义。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为生长4周的野生型和突变体植株接种白粉菌的表型。
[0028] 图2为AT5G05190基因的功能验证图。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031] 实施例1、白粉病抗性相关基因 AT5G05190的制备
[0032] ( -）、白粉病抗性增强突变体拟南芥的筛选
[0033] 0. 03%甲基磺酸乙酯（EMS)诱变野生型拟南芥Col-Ο,从诱变群体中筛选白粉 病抗性增强的突变体。具体筛选方法为：在短光照（9小时光照/15小时黑暗）光照强度 为800011^，相对湿度为70 |%的生长环境下，用白粉菌（6.(3；[(3110四0631'111111103(]1)(4(1已111 et al.，1999)对生长四周的野生型和突变体进行接种实验，观察实验结果（图1)。实验 结果显示：接菌7天后，不同于产生大量白粉菌分生孢子的野生型，菌丝和分生孢子梗不 能在突变体的叶片表面生长，并且突变体的叶片细胞出现大面积的死亡（图la);台盼蓝 (Trypan-Blue)染色也证实了上述结果（图Ib)。接菌7天后，分生孢子梗的定量实验表明， 突变体中单个孢子所形成的分生孢子梗数显著少于野生型（图Ic)。对白粉菌接种48小时 后的新鲜叶片进行Trypan Blue-DAB双染，发现突变体在白粉菌孢子入侵点处出现大量过 氧化氢积累，而野生型植物仅出现少量积累（图Id)。Aniline Blue染色试验中显示，突变 体中胼胝质的积累较野生型提高了约7倍（图Ie)
[0034] (二）、基因扩增
[0035] 以野生型拟南芥Col-O基因组DNA作为模板，PCR扩增含有启动子和终止子序列 的AT5G05190基因片段，引物序列为 ：
[0036] 上游引物：5 ' -GCTCTAGAGGACTTGAGATAGCCCTACAAAACTT-3 ' 含酶切位点 XbaI (T/ CTAGA)
[0037] 下游引物：5 ' -GCGTCGACGTGCCTACTTACCTCTGACTCATCTA-3 ' 含酶切位点 Sal I (G/ TCGAC)
[0038] PCR反应体系为：
[0039] DNA ： 2. 0 μ 1
[0040] IOxbuffer ： 5. 0 μ 1
[0041] dNTPs (2. OmM) ： 5. 0 μ I
[0042] MgSO4 (25mM) ： 2. 0 μ I
[0043] 引物 F(IOyM) : 1. 6μ I
[0044] 引物 R(IOyM) : 1. 6μ 1
[0045] KOD Taq(IU) ： 1. 0μ I
[0046] H2O ： 31. 8μ I
[0047] PCR反应程序：预变性，96°C 3分钟；热循环，变性96°C 30秒钟，退火55°C 30秒钟， 延伸68 °C 8分钟，循环数30个。
[0048] 将PCR扩增产物进行测序。测序结果表明，上述PCR产物共4750bp，具有序列表 中SEQ ID N2 :1所示的核苷酸序列。其中SEQ ID N2 :1的第10-4741位核苷酸为表达盒序 列，包含启动子序列、外显子序列、内含子序列和终止子序列；SEQ ID Ns :1的第1498-3520 位核苷酸为AT5G05190的基因序列，SEQ IDNs :1的第1498-1618位和第1794-3520位核苷 酸为外显子，共1848bp核苷酸序列，编码序列表中SEQ ID Ns :2所示的氨基酸序列，共615 个氨基酸残基。
[0049] 实施例2、白粉病抗性相关基因 AT5G05190的功能验证 [0050](一）、回复突变实验
[0051] 用Xbal和Sail酶切实施例1所得PCR扩增产物；用Xbal和Sail酶切 PCAMBIAL1300,收集载体大片段；用T4连接酶在16°C连接，转化DHlOb感受态细胞，经测 序发现没有碱基突变后提取质粒（Sambrook，1989)，质粒中插入的外源基因序列是SEQ ID No. 1所示，之后冻融法转化农杆菌感受态GV3101，再用该农杆菌用花滴浸的方法（Clough and Bent，1998)转化实施例1筛选出的突变体，用潮霉素筛选转基因植株得到25个阳性植 株。这25个阳性植株接种白粉菌，有22个转基因植物回复到野生型表型（图2b)。
[0052] (二）、AT5G05190基因插入突变实验
[0053] 自ABRC订购并鉴定了插入AT5G05190基因内部的3个T-DNA插入突变体 SALK_009370、SALK_048465 和 SALK_064750。这三个突变体中的 AT5G05190 基因均因 T-DNA 插入而被沉默，但是基因组上其它序列与野生型一致。
[0054] 用Trizol试剂分别提取三个突变体植株的RNA并反转录产生cDNA，以该cDNA为 模板，扩增AT5G05190基因 CDS序列，引物序列为：
[0055] 上游引物：5 ' -ATGGCGAGCCAGACGGGTC-3 '
[0056] 下游引物：5 ' -CTATATAGAAGGAGGACGCTGTGAAA-3 '
[0057] 结果显示，这3个T-DNA插入突变体中都无法扩增出所述基因（图2a)。从而表明 T-DNA的插入使得基因的表达丧失，失去自身功能。
[0058] 随后对这3个插入突变体接种白粉菌具体方法为：在短光照（9小时光照/15小时 黑暗）光照强度为800011^，相对湿度为70 (%的生长环境下，用白粉菌（6.〇：[〇11〇四〇63；1〇1111 UCSC1)对生长四周的野生型和突变体进行接种实验，7天后观察实验结果。结果显示，与野 生型相比，三个T-DNA插入突变体都出现了植物叶片细胞死亡、和分生孢子梗生长较少的 表型，与实施例1筛选出的突变体类似，表现出白粉病抗性增强的表型（图2b)。由于实施 例1筛选出的突变体与三个T-DNA插入突变体都是AT5G05190的等位突变体，并且接种白 粉菌后表型类似，进一步证明突变体表现出白粉病抗性增强的表型是由于AT5G05190基因 表达提如终止进而造成基因功能缺失广生的。
【权利要求】
1. 一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白： 1) 序列表中的SEQ ID Ns . 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2) 将序列表中的SEQ ID N2 . 2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代 和/或缺失和/或添加且与植物白粉病抗性相关的由1)衍生的蛋白质。
2. 权利要求1所述蛋白的编码基因。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因具有下述核苷酸序列 之一： 1) 序列表中SEQ ID Ns :1的第1498-3520位所示的核苷酸序列； 2) 编码序列表中SEQ ID N2 :2蛋白质序列的多核苷酸序列； 3) 在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID N2 :1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列； 4) 与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性。
4. 包含权利要求2或3所述编码基因的表达盒，其特征在于：所述表达盒具有SEQ ID N2 :1的第10-4741位所示的核苷酸序列。
5. 权利要求1所述的蛋白、权利要求2-3任一所述的编码基因或权利要求4所述的表 达盒在使植物的白粉病抗性增强中的应用。
6. 权利要求1所述的蛋白、权利要求2-3任一所述的编码基因或权利要求4所述的表 达盒在培育白粉病抗性增强的植物中的应用。
7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植 物。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。
【文档编号】A01H5/00GK104211792SQ201310213227
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年5月31日 优先权日:2013年5月31日
【发明者】武广珩, 刘斯穆, 赵婷, 陈永芳, 李娟 , 唐定中 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所