水稻转录因子0s02g49250基因的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及水稻转录因子0s02g49250基因的应用，其是利用转录因子激活基序VP64与水稻转录因子0s02g49250基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到农作物如水稻中，从而改良水稻籽粒性状，如增加水稻籽粒长度、宽度。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
【专利说明】水稻转录因子0s02g49250基因的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及水稻转录因子0s02g49250基因的应 用。
【背景技术】
[0002] 水稻（Oryza sativa L.)是我国和全世界最重要的三大粮食作物之一，是世界一 半以上人口的主食，也是一个重要的功能基因研究的模式植物。与其相关的遗传学和分子 生物学研究一直倍受研究者的重视，转录水平的调控是基因表达调控的重要方式。当前水 稻增产的研究较依赖于有限的水稻种质资源，传统的杂交育种优势正在逐渐减弱，而水稻 转基因技术有可能发掘水稻进一步增产的潜力。
[0003] 在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上，作为重要的繁殖 器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表，种子来源于受精后的胚 珠。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过 程。而转录因子在基因表达的精确调控中起到了关键性的作用。
[0004] 近些年，有关籽粒大小性状的分子遗传调控机制研究，已取得了一定进展，如：研 究者们利用QTL定位了一些籽粒大小相关基因，其中GS3编码一个膜蛋白，是籽粒大小和器 官大小的负调控因子；张启发等研究发现GS5编码一个调节籽粒大小的丝氨酸羧肽酶，是 控制籽粒大小的正调节因子，过表达GS5可使水稻籽粒明显变大；转录因子在调控籽粒大 小方面起着非常重要的作用，0sWRKY78可以调节水稻茎的伸长和种子的发育，0sWRKY78突 变体可以使茎杆变矮化影响籽粒发育；螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH)类转录因子能通过调控 外稃和内稃细胞的长度影响谷粒的大小；PGLl碱性螺旋-环-螺旋蛋白（bHLH)异源二聚 体作为结合DNA的bHLH的抑制子过表达后可增加籽粒长度和重量。
[0005] VP64是4个VP16功能域基序融合在一起组成的，是一类增强子。VP16最早在动 物病毒基因中发现，现已被广泛应用到植物中，主要用于植物基因的转录调控的研究中。转 录因子在体内的作用大体上可以分成两种：一种为转录增强子，另一种为转录抑制子。当转 录因子和VP16功能域基序融合之后，它就会增强转录因子的功能，从而在转基因植株中出 现更明显的表型变化。
[0006] Homeoboxes (同源结构域蛋白）HB家族转录因子在动物界首先在果蝇中，植物在 拟南芥中首次被发现。HB家族有300多个成员，参与了生物的生长发育多个方面。从结构 上分析，Homeoboxes拥有DNA识别位点，包括TATA等一系列和DNA结合的结构域。目前HB 家族转录因子0s02g49250对种子大小形状调控机制的研究及认识很少，因此该转录因子 的研究在理论上为进一步理解植物种子和器官发育调控的分子机理提供了新的线索；在实 践上也将为作物高产育种提供理论基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供水稻转录因子0s02g49250基因的应用。
[0008] 为了实现本发明的目的，本发明首先提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白为 (VP16) 4-Linker-0s02g49250 ；
[0009] 其中，Linker由39个柔性氨基酸串联而成，其序列如SEQ ID No. 9所示，其核苷 酸序列如SEQ ID No. 3所示；VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白；0s02g49250为水稻转 录因子 0s02g49250。
[0010] 所述水稻转录因子0s02g49250的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替 换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0011] 其中，（VP16) 4 即 VP64,是由 4个 VP16 功能域基序（Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu)以Gly Ser两个氨基酸间隔融合在一起组成的增强子，其序列如SEQ ID No. 10所示，其核苷酸序列如SEQ IDNo. 4所示。
[0012] 本发明还提供编码所述融合蛋白的基因，以及在严格条件下，可与该基因的核苷 酸序列杂交的核苷酸序列 ；其中，所述严格条件为65°C，在0.1XSSPE或0.1XSSC、0.1%SDS 的溶液中杂交并洗膜。
[0013] 本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的载体。
[0014] 所述载体的构建方法如下：
[0015] (1)在植物转录因子数据库中找到0s02g49250基因，根据其序列设计PCR扩增引 物对，其为正向引物 F : 5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGAGGAGAAGGAGGAGA-3' 和反向引物 R : 5,-CAAGAAAGCTGGGTCGACCGACATGAACGCGAAATC-3，；
[0016] (2)以野生日本晴水稻总cDNA为模板，进行PCR获得0s02g49250全序列；
[0017] (3)将PCR产物克隆到连接pDONER克隆载体上，经测序鉴定得到与目的基因完全 相同的序列；
[0018] (4)以双元表达载体左右边界包含的序列为骨架序列，通过体外重组，将ubi promoter-VP64_Gateway 表达单兀、35S promoter-asRED 表达单兀和 35S promoter-hyg 表 达单元与之融合构建，得到载体nVP64-hyg-asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示；
[0019] (5)通过LR反应将0s02g49250构建到其目地基因的N端融合了 VP64标签的植 物表达载体nVP64-hyg-asRED上，获得载体ubi :VP64-0s02g49250,载体全序列如SEQ ID No. 6所示。
[0020] 携带有编码所述融合蛋白的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、 直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998， Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第 411-463 页； Geiserson 和 Corey, 1998, Plant Molecular Biology,2nd Edition)。
[0021] 本发明还提供含有编码所述融合蛋白的基因的工程菌。
[0022] 本发明还提供一种转基因水稻植株的构建方法，具体为，采用农杆菌介导的方法， 将前述载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的 材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
[0023] 本发明还提供编码所述融合蛋白的基因在改良水稻籽粒性状(如增加水稻粒长、 粒宽及千粒重）中的应用。
[0024] 本发明还提供了用于扩增水稻转录因子0s02g49250基因的引物对，其为 5,-CAAGAAAGCTGGGTCGAC CGACATGAACGCGAAATC-3,。
[0025] 本发明还进一步提供水稻转录因子0s02g49250基因在调控水稻籽粒性状中的应 用。
[0026] 前述的应用，是将水稻转录因子0s02g49250基因的CDS序列通过Gateway系统构 建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，从而改良转基因水稻籽粒的性状。
[0027] 本发明首次利用转录因子激活基序VP64 (即4个转录因子激活基序VP16)与水稻 转录因子0s02g49250基因融合构建得到组成型转录因子，并转化到水稻中，从而改良水稻 籽粒性状，如水稻籽粒长度和宽度增加。对于详细阐明调控种子发育机理具有重要的理论 价值，并且可以通过转基因手段，改良水稻的粒型，因此在生产实践中也具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1为本发明实施例1中nVP64-hyg_asRED载体图谱。
[0029] 图2为本发明实施例1中ubi :VP64-0s02g49250载体图谱。
[0030] 图3为本发明Western blot检测VP64-0s02g49250转基因阳性株系，其中WT为 野生型水稻 'kitaake'，V0476H-05、V0476H-12 为 VP64-0s02g49250 转基因水稻株系。
[0031] 图4为本发明转基因材料籽粒性状的表型长度的比较，其中WT为野生型水稻 'kitaake'，V0476H-05、V0476H-12 为转基因水稻株系。
[0032] 图5为本发明转基因材料籽粒性状的表型宽度的比较，其中WT为野生型水稻 'kitaake'，V0476H-05、V0476H-12 为转基因水稻株系。
[0033] 图6为本发明转基因材料籽粒性状数据统计分析，其中WT为野生型水稻 'kitaake'，V0476H-05、V0476H-12 为转基因水稻株系。
【具体实施方式】
[0034] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0035] 实施例10s02g49250基因的分离和植物表达载体构建
[0036] 在植物转录因子数据库中找到0s02g49250基因，根据其序列设计PCR扩增引物， 根据其序列设计 PCR 扩增引物（Fl :5' -CAAAAAAGCAGGCTTCATGGAGGAGGAGAAGGAGGAGA-3' 和 总cDNA为模板，进行PCR获得0s02g49250全序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0037] 按照PrimeSTAR聚合酶扩增体系和反应程序进行PCR。此过程中包含两轮 PCR，第一轮PCR的引物用加部分adaptor attB接头的基因引物（Fl和R1)，而第二轮 的模板用第一轮的PCR产物，并且引物用完整的adaptor attB引物（attB5' adaptor : 5'-GTGGGGACAAGTTTG TACAAAAAAGCAGGCTTC-3'，attB3' adaptor :5'-GTGGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTC-3'）。将 PCR 产物克隆到连接 pDONER 克隆载体(购自 Invitrogen) 上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列。通过LR反应将0s02g49250构 建到nVP64-hyg-asRED (图1，载体全序列如SEQ ID No. 5所示）上，获得载体ubi : VP64-0s02g49250 (图 2,载体全序列如 SEQ ID No. 6 所示）。
[0038] 实施例2转基因水稻植株的获得
[0039] 取水稻'kitaake'成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒 之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体 材料，采用农杆菌介导法将Ubi :VP64-0s02g49250转入水稻愈伤组织中，用含有100 μ M的 乙酰丁香酮和〇. D.值为0. 7的农杆菌的AAM转化液进行转化，将转化液浸泡过的愈伤组织 置于共培养基上进行共培养，25°C暗培养3d后置于筛选培养基上培养约30d，每IOd继代一 次。然后将筛出的抗性愈伤转移到分化培养基上分化约20d，每IOd继代一次。将分化出绿 色小苗的抗性愈伤转移到生根培养基上生根，待约7d长出发达根系后炼苗，并计算转化所 获转基因苗数。炼苗7d后转移至大田生长。
[0040] 其中，诱导培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0041] 共培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰 胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制，调pH至5. 2后加入植物 凝胶4g/L。灭菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮）100?200μ8/ιΛ。
[0042] 筛选培养基配方为：Ν6大量+Β5微量+NB有机+铁盐+铜钴母液+2. 5mg/ L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制， 调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。灭菌后加入35mg/L潮霉素(购自上海纽津生物 技术有限公司）。
[0043] 分化培养基配方为：MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钴母液+0. 05mg/ L NAA+2. Omg/L Kinetin (激动素）+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配 制，调pH至5. 8?5. 9后加入植物凝胶4g/L。
[0044] 实施例3转基因阳性株系的鉴定
[0045] 为检测ubi :VP64-0s02g49250基因在T2代转基因水稻中的过表达情况，利用 VP64抗体对其在蛋白质水平上进行鉴定，经过SDS-PAGE蛋白电泳一免疫印记一免疫荧光 反应，Western Blot鉴定结果表明转基因植株存在目的蛋白，而野生型未杂出条带（图3)。
[0046] 具体的Western Blot实验流程如下：
[0047] 将适量样品放入液氮冰冻后研磨成粉末，加入适量上样缓冲液混匀，12000rpm离 心10分钟；取5 μ 1上清加样，以90V电压SDS-PAGE电泳30分钟后，120V电泳60-90分钟， 当溴酚蓝到达凝胶的底端即可停止电泳；电泳后采用半干转移法转膜，并用丽春红染色液 对膜进行染色，观察转膜效果；转膜完毕后，将膜放入含5%的脱脂奶粉的PBST溶液中封闭 室温封闭60分钟或4°C过夜；室温下一抗（VP64抗体）孵育1小时或4°C孵育过夜,然后用 PBST洗涤3次，每次5分钟；室温下二抗(羊抗兔，购自Abmart，货号M21002S)孵育1小时， 然后用PBST洗涤3次，每次5分钟；在膜上加入底物，进行曝光。
[0048] 其中，VP64抗体是由艾比玛特生物医药(上海）有限公司根据VP64的氨基酸序列 合成多肽作为特异抗原而制备的兔源多抗。
[0049] 实施例4转基因水稻表型分析和考种分析
[0050] 将转基因和野生型水稻种子进行比较，从表型上可以明显的看出，发现转基因材 料的籽粒明显变长、变宽（图4、图5)。考种数据分析表明（图6)，转基因水稻籽粒的长、宽均 显著大于野生型水稻籽粒。
[0051] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1. 一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为（％16)4-1^111?51-0802849250 ; 其中，Linker由39个柔性氨基酸串联而成；VP16为来自单纯疱疹病毒的VP16蛋白； 0s02g49250为水稻转录因子0s02g49250。
2. 如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述水稻转录因子0s02g49250的氨基 酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3. 编码权利要求1-2任一项所述融合蛋白的基因。
4. 含有权利要求3所述基因的载体。
5. 含有权利要求3所述基因的工程菌。
6. -种转基因水稻植株的构建方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法，将权利要求 4所述的载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM转化液进行转化，转化后的 材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
7. 权利要求3所述的基因在改良水稻籽粒性状中的应用。
8. 用于扩增水稻转录因子0s02g49250基因的引物对，其为正向引物F : 5'-CAAAAAAGCAGGCTTC ATGGAGGAGGAGAAGGAG GAGA-3' 和反向引物 R:5'-CAAGAAAGCTGGGTC GACCGACAT GAACGCGAAATC-3,。
9. 水稻转录因子0s02g49250基因在调控水稻籽粒性状中的应用。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，其是将水稻转录因子0s02g49250基因的 ⑶S序列通过Gateway系统构建到4个转录因子激活基序VP16的下游，转化水稻，从而改良 转基因水稻籽粒的性状。
【文档编号】A01H5/00GK104211813SQ201310217962
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2013年6月3日 优先权日:2013年6月3日
【发明者】赵涛, 张春雨, 刘斌, 李宏宇, 刘军, 林辰涛 申请人:中国农业科学院作物科学研究所