制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法，包括：将体细胞在细胞培养液A中培养1-3天；在细胞培养液B中继续培养1-6天；然后在细胞培养液C中继续培养1-6天；以及收集雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞；本发明还提供了一种用于制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的试剂盒。使用本发明的方法及试剂盒在非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的产量、纯度、生产速度方面具有显著优势。
【专利说明】制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法、 试剂盒、干细胞及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体来说，涉及制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体 生殖干细胞的方法、试剂盒、干细胞及应用。
【背景技术】
[0002] 干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多 种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是一 类具备无限自我更新和分化潜能的早期胚胎细胞，是当受精卵分裂发育成囊胚时内层细胞 图案的细胞，其具有可以向各胚层范畴的细胞分化的能力。成体细胞是指存在于人和哺乳 动物特定组织或器官中（包括骨髓、神经、肌肉、表皮、睾丸或肾脏等）的具有修复和再生能 力的干细胞，在特定条件下，成体干细胞产生新的干细胞或按一定的程序化形成新的功能 细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡，与胚胎干细胞不同的是，成体干细胞 只可以向其定居的组织类型分化。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各 种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为"万用细胞"。睾丸里的生殖干细胞，是睾丸中所 有精细胞和内分泌细胞的母亲细胞、种子细胞。睾丸里的生殖干细胞在男性和雄性动物的 生命进程中，是一个进行性和累计性的消耗过程。生殖干细胞的消耗殆尽时，睾丸老化，丧 失生精和排精功能，荷尔蒙降低，男性和雄性动物进入老年。因此，生殖干细胞的消耗，睾丸 功能枯渴，睾丸衰老与男性和雄性动物的整体衰老及寿命的长短有密切关联。
[0003] 现在国际上主要采用两种方法制备生殖干细胞。一种方法是通过自然的胚胎干细 胞体外分化形成异体生殖细胞，应用于研究领域，；第二种方法是从睾丸或卵巢分离培养制 备自体生殖干细胞，应用不孕不育的治疗领域，分离培养耗时困难，生殖细胞来源困难，获 取数量极其稀少。
[0004] 应用自体生殖干细胞移植，进行衰老睾丸的再生和再造，是延缓睾丸衰老，恢复和 提升机体各种机能和延长寿命的有效方法。但是，如何获得足够数量、安全性低的男性和雄 性动物自体生殖干细胞，是一个有待研发的医学生物学难题。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中获取的男性和雄性动物自体生殖干细胞数量少、安全性低的问 题，本发明提供了一种制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法，该方法包 括：
[0006] 将体细胞以5X IO6的密度接种于细胞培养皿中。体细胞包括但不限于雄性动物 的脐带血细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞等。
[0007] 在37°C和5%的CO2的环境中，将体细胞或单个核细胞在细胞培养液A( RPMI 1640 培养液）中培养1-3天。培养液A中含有：
[0008] 1-100 μ M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 (C14H21N3O. 2HC1)，优选值为 10 μ M ;
[0009] l-100ng/ml的干细胞因子，优选值为lOng/ml ;
[0010] l-l〇〇ng/ml的白细胞介素3,优选值为10ng/ml ;
[0011] l-l〇〇ng/ml的白细胞介素6,优选值为10ng/ml ;
[0012] l-100ng/ml的白细胞介素11，优选值为10ng/ml ;
[0013] l-100ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0014] l-100ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0015] 1-100 μ g/ml的岩藻多糖，优选值为10 μ g/ml ;
[0016] 1-100 μ g/ml的葡聚糖硫酸酯，优选值为10 μ g/ml ;
[0017] I-IOOnM 的 AMD 3100 (1，1，-[1,4-亚苯基二（亚甲基）]-二-1,4, 8, 11)，优选 值为IOnM ;
[0018] 1-100 μ M 的 M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE)，优选值为 10 μ M ;以及
[0019] 1-100 μ M的氨羟二磷酸二钠，优选值为10 μ Μ。
[0020] 在37°C和5%的CO2的环境中，将体细胞或单个核细胞在细胞培养液B (DMEM培养 液）中培养1-6天。培养液B中含有：
[0021] 1-100 μ M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 (C14H21N3O · 2HC1)，优选值为 10 μ M ;
[0022] 1-100 μ M的1-磷酸-神经鞘氨醇，优选值为10 μ M ;
[0023] 1-100 μ g/ml的骨形态发生蛋白2 (ΒΜΡ-2)，优选值为10 μ g/ml ;
[0024] 1-100 μ g/ml的生长分化因子-5 (⑶F-5)，优选值为10 μ g/ml ;
[0025] l-1000ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，优选值为100ng/ml ;
[0026] l-1000ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子，优选值为10ng/ml ;
[0027] 100-10000IU/ml的促红细胞生成素（EP0)，优选值为3000IU/ml ;
[0028] l_200ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子）（⑶NF)，优选值为20ng/ml ;
[0029] l-1000ng/ml的干细胞因子，优选值为10ng/ml ;
[0030] l-l〇〇〇ng/ml的白细胞介素3,优选值为10ng/ml ;
[0031] l-l〇〇〇ng/ml的白细胞介素6,优选值为10ng/ml ;
[0032] l-1000ng/ml的白细胞介素11，优选值为10ng/ml ;
[0033] l-1000ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0034] l-1000ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0035] l-1000ng/ml 的激活素 A (activin A)，优选值为 10ng/ml ;
[0036] 1-100 μ M的烟酰胺，优选值为10 μ M ;
[0037] l-1000ng/ml的神经营养因子（ΝΤ4)，优选值为10ng/ml ;
[0038] l-1000ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF)，优选值为10ng/ml ;
[0039] l-1000ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF)，优选值为10ng/ml ;
[0040] l-1000ng/ml的神经生长因子（NGF)，优选值为10ng/ml ;
[0041] l-1000ng/ml的类胰岛素生长因子-I (IGF-1)，优选值为10ng/ml ;以及
[0042] 1-1000 μ g/ml的地塞米松，优选值为10 μ g/ml。
[0043] 在37°C和5%的CO2的环境中，将体细胞或单个核细胞在细胞培养液C (M16培养 液）中培养1-6天。培养C中含有：
[0044] 1-100 μ M的RHO激酶抑制剂Y-27632,优选值为10 μ M ;
[0045] l-1000ng/ml的支持细胞特异蛋白（ΑΜΗ)，优选值为10ng/ml ;
[0046] l-1000ng/ml的支持细胞特异蛋白（I型类固醇原生生长因子（SF1))，优选值为 10ng/ml ；
[0047] l-1000ng/ml的Y染色体性别决定基因（SRY) (Y染色体性别决定区)，优选值为 10ng/ml ；
[0048] 1-100 μ g/ml的高泳动家族性别决定基因9 (S0X9)，优选值为10 μ g/ml ;
[0049] l-1000ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，优选值为100ng/ml ;
[0050] l-1000ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子，优选值为10ng/ml ;
[0051] 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO)，优选值为3000IU/ml ;
[0052] l_200ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF)，优选值为20ng/ml ;
[0053] l-100ng/ml的干细胞因子，优选值为10ng/ml ;
[0054] l-l〇〇ng/ml的白细胞介素3,优选值为10ng/ml ;
[0055] l-l〇〇ng/ml的白细胞介素6,优选值为10ng/ml ;
[0056] l-l〇〇ng/ml的白细胞介素11，优选值为10ng/ml ;
[0057] l-1000ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0058] l-1000ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0059] l-1000ng/ml 的激活素 A (activin A)，优选值为 10ng/ml ;
[0060] 1-100μ M 的烟酰胺（Nicotinamide)，优选值为 10μ M ;
[0061] l-1000ng/ml的表皮生长因子（EGF)，优选值为10ng/ml ;
[0062] l-1000ng/ml的神经营养因子（NT4)，优选值为10ng/ml ;
[0063] l-1000ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF)，优选值为10ng/ml ;
[0064] l-1000ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF)，优选值为10ng/ml ;
[0065] l-1000ng/ml的神经生长因子（NGF)，优选值为10ng/ml ;
[0066] l-1000ng/ml的类胰岛素生长因子-I (IGF-1)，优选值为10ng/ml ;
[0067] l-1000ng/ml的生长因子，优选值为10ng/ml ;以及
[0068] 1-100 μ g/ml的地塞米松，优选值为10 μ g/ml。
[0069] 轻轻吹打分别在细胞培养液A、细胞培养液B及细胞培养液C中培养后的细胞，使 细胞完全悬浮后，收集细胞于离心管中，进行离心操作，然后使用生理盐水对悬浮的细胞进 行清洗操作，重复3次后，将细胞悬浮于生理盐水中，得到非睾丸源性蛋白诱导性雄性自体 生殖干细胞。
[0070] 将得到的非睾丸源性蛋白诱导性雄性自体生殖干细胞以IXlOVml至IX 106/ml 的细胞密度与等体积的二甲基亚砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，将混合物降温 至-80°C，然后转移到_186°C液氮中深低温保存。
[0071] 在本方法中，所使用的优选培养液为：
[0072] 培养液A是RPMI 1640培养液，其中含有：
[0073] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 ;
[0074] 10ng/ml的干细胞因子；
[0075] 10ng/ml的白细胞介素3 ;
[0076] lOng/ml的白细胞介素6 ;
[0077] 10ng/ml的白细胞介素11 ;
[0078] 10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF);
[0079] 10ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF);
[0080] 10 μ g/ml的岩藻多糖；
[0081] 10 μ g/ml的葡聚糖硫酸酯；
[0082] IOnM 的 AMD 3100 (1，1' -[1,4-亚苯基二（亚甲基）]-二-1,4, 8, 11);
[0083] 10 μ M 的 M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及
[0084] 10 μ M的氨羟二磷酸二钠。
[0085] 培养液B是DMEM培养液，其中含有：
[0086] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制剂 Υ-27632 ;
[0087] 10 μ M的1-磷酸-神经鞘氨醇；
[0088] 10μ g/ml的骨形态发生蛋白2 (ΒΜΡ-2);
[0089] 10 μ g/ml的生长分化因子-5 (⑶F-5);
[0090] l〇〇ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；
[0091] l〇ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子；
[0092] 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO);
[0093] 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF);
[0094] 10ng/ml的干细胞因子；
[0095] 10ng/ml的白细胞介素3 ;
[0096] l-1000ng/ml 的白细胞介素 6 ;
[0097] 10ng/ml的白细胞介素11 ;
[0098] 10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF);
[0099] 10ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF);
[0100] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0101] 10 μ M的烟酰胺；
[0102] 10ng/ml的神经营养因子（ΝΤ4);
[0103] 10ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF);
[0104] 10ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF);
[0105] 10ng/ml的神经生长因子（NGF);
[0106] 10ng/ml的类胰岛素生长因子-I (IGF-I);以及
[0107] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0108] 培养液C是M16培养液，其中含有：
[0109] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 ;
[0110] l〇ng/ml的支持细胞特异蛋白（AMH);
[0111] 10ng/ml的支持细胞特异蛋白（I型类固醇原生生长因子（SFl)) ;10ng/ml的Y染 色体性别决定基因（SRY);
[0112] 10 μ g/ml的高泳动家族性别决定基因9 (S0X9);
[0113] 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；
[0114] lOng/ml的酸性成纤维细胞生长因子；
[0115] 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO);
[0116] 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF);
[0117] 10ng/ml的干细胞因子；
[0118] 10ng/ml的白细胞介素3 ;
[0119] 10ng/ml的白细胞介素6 ;
[0120] 10ng/ml的白细胞介素11 ;
[0121] 10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF);
[0122] 10ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF);
[0123] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0124] 10 μ M 的烟醜胺（Nicotinamide);
[0125] 10ng/ml的表皮生长因子（EGF);
[0126] 10ng/ml的神经营养因子（NT4);
[0127] 10ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF);
[0128] 10ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF);
[0129] 10ng/ml的神经生长因子（NGF);
[0130] 10ng/ml的类胰岛素生长因子-I (IGF-I);
[0131] 10ng/ml的生长因子；以及
[0132] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0133] 本发明还提供了一种用于制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的试 剂盒。试剂盒包括细胞培养液A、细胞培养液B和细胞培养液C。其中：
[0134] 培养液A是RPMI 1640培养液，其中含有：
[0135] 1-100 μ M的RHO激酶抑制剂Y-27632,优选值为10 μ M ;
[0136] l-100ng/ml的干细胞因子，优选值为10ng/ml ;
[0137] l-100ng/ml的白细胞介素3,优选值为10ng/ml ;
[0138] l-100ng/ml的白细胞介素6,优选值为10ng/ml ;
[0139] l-100ng/ml的白细胞介素11，优选值为10ng/ml ;
[0140] l-100ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0141] l-100ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0142] 1-100 μ g/ml的岩藻多糖，优选值为10 μ g/ml ;
[0143] 1-100 μ g/ml的葡聚糖硫酸酯，优选值为10 μ g/ml ;
[0144] I-IOOnM 的 AMD 3100 (1，I' -[1,4-亚苯基二（亚甲基）]-二-1,4, 8, 11)，优选 值为IOnM ;
[0145] 1-100 μ M 的 M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE)，优选值为 10 μ M ;以及
[0146] 1-100 μ M的氨羟二磷酸二钠，优选值为10 μ Μ。
[0147] 培养液B是DMEM培养液，其中含有：
[0148] 1-100 μ M的RHO激酶抑制剂Υ-27632,优选值为10 μ M ;
[0149] 1-100 μ M的1-磷酸-神经鞘氨醇，优选值为10 μ M ;
[0150] 1-100 μ g/ml的骨形态发生蛋白2 (BMP-2)，优选值为10 μ g/ml ;
[0151] 1-100 μ g/ml的生长分化因子-5 (⑶F-5)，优选值为10 μ g/ml ;
[0152] l-1000ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，优选值为100ng/ml ;
[0153] l-1000ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子，优选值为10ng/ml ;
[0154] 100-10000IU/ml的促红细胞生成素（EP0)，优选值为3000IU/ml ;
[0155] l_200ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF)，优选值为20ng/ml ;
[0156] l-1000ng/ml的干细胞因子，优选值为10ng/ml ;
[0157] l-1000ng/ml的白细胞介素3,优选值为10ng/ml ;
[0158] l-1000ng/ml的白细胞介素6,优选值为10ng/ml ;
[0159] l-l〇〇〇ng/ml的白细胞介素11，优选值为10ng/ml ;
[0160] l-1000ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0161] l-1000ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0162] l-1000ng/ml 的激活素 A (activin A)，优选值为 10ng/ml ;
[0163] 1-100μΜ的烟酰胺，优选值为ΙΟμΜ;
[0164] l-1000ng/ml的神经营养因子（ΝΤ4)，优选值为10ng/ml ;
[0165] l-1000ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF)，优选值为10ng/ml ;
[0166] l-1000ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF)，优选值为10ng/ml ;
[0167] l-1000ng/ml的神经生长因子（NGF)，优选值为10ng/ml ;
[0168] l-1000ng/ml的类胰岛素生长因子-I (IGF-1)，优选值为10ng/ml ;以及
[0169] 1-1000 μ g/ml的地塞米松，优选值为10 μ g/ml。
[0170] 培养液C是M16培养液，其中含有：
[0171] 1-100μΜ的RHO激酶抑制剂Y-27632,优选值为ΙΟμΜ ;
[0172] l-1000ng/ml的支持细胞特异蛋白（ΑΜΗ)，优选值为10ng/ml ;
[0173] l-1000ng/ml的支持细胞特异蛋白（I型类固醇原生生长因子（SF1))，优选值为 10ng/ml ；
[0174] l-1000ng/ml的Y染色体性别决定基因（SRY)，优选值为10ng/ml ;
[0175] 1-100 μ g/ml的高泳动家族性别决定基因9 (S0X9)，优选值为10 μ g/ml ;
[0176] l-1000ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子，优选值为100ng/ml ;
[0177] l-1000ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子，优选值为10ng/ml ;
[0178] 3000IU/ml的促红细胞生成素（EP0)，优选值为3000IU/ml ;
[0179] l_200ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF)，优选值为20ng/ml ;
[0180] l-100ng/ml的干细胞因子，优选值为10ng/ml ;
[0181] l-l〇〇ng/ml的白细胞介素3,优选值为10ng/ml ;
[0182] l-l〇〇ng/ml的白细胞介素6,优选值为10ng/ml ;
[0183] l-100ng/ml的白细胞介素11，优选值为10ng/ml ;
[0184] l-1000ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0185] l-1000ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF)，优选值为10ng/ml ;
[0186] l-1000ng/ml 的激活素 A (activin A)，优选值为 10ng/ml ;
[0187] 1-100μ M 的烟酰胺（Nicotinamide)，优选值为 ΙΟμΜ ;
[0188] l-1000ng/ml的表皮生长因子（EGF)，优选值为lOng/ml ;
[0189] l-1000ng/ml的神经营养因子（NT4)，优选值为10ng/ml ;
[0190] l-1000ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF)，优选值为10ng/ml ;
[0191] l-1000ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF)，优选值为10ng/ml ;
[0192] l-1000ng/ml的神经生长因子（NGF)，优选值为10ng/ml ;
[0193] l-1000ng/ml的类胰岛素生长因子-I (IGF-1)，优选值为10ng/ml ;
[0194] l-1000ng/ml的生长因子，优选值为10ng/ml ;以及
[0195] 1-100 μ g/ml的地塞米松，优选值为10 μ g/ml。
[0196] 优选地，试剂盒的组成包括：
[0197] 培养液A是RPMI 1640培养液，其中含有：
[0198] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 ;
[0199] 10ng/ml的干细胞因子；
[0200] 10ng/ml的白细胞介素3 ;
[0201] l〇ng/ml的白细胞介素6 ;
[0202] 10ng/ml的白细胞介素11 ;
[0203] 10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF);
[0204] 10ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF);
[0205] 10 μ g/ml的岩藻多糖；
[0206] 10 μ g/ml的葡聚糖硫酸酯；
[0207] IOnM 的 AMD 3100 ;
[0208] 10 μ M 的 M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及
[0209] 10 μ M的氨羟二磷酸二钠。
[0210] 培养液B是DMEM培养液，其中含有：
[0211] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制剂 Υ-27632 ;
[0212] 10 μ M的1-磷酸-神经鞘氨醇；
[0213] 10μ g/ml的骨形态发生蛋白2 (ΒΜΡ-2);
[0214] 10 μ g/ml的生长分化因子-5 (⑶F-5);
[0215] 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；
[0216] 10ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子；
[0217] 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO);
[0218] 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF);
[0219] 10ng/ml的干细胞因子；
[0220] 10ng/ml的白细胞介素3 ;
[0221] l-1000ng/ml 的白细胞介素 6 ;
[0222] 10ng/ml的白细胞介素11 ;
[0223] 10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF);
[0224] 10ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF);
[0225] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0226] 10 μ M的烟酰胺；
[0227] lOng/ml的神经营养因子（NT4);
[0228] 10ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF);
[0229] 10ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF);
[0230] 10ng/ml的神经生长因子（NGF);
[0231] 10ng/ml的类胰岛素生长因子-I (IGF-I);以及
[0232] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0233] 培养液C是M16培养液，其中含有：
[0234] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 ;
[0235] 10ng/ml的支持细胞特异蛋白（AMH);
[0236] 10ng/ml的支持细胞特异蛋白（I型类固醇原生生长因子（SFl));
[0237] 10ng/ml的Y染色体性别决定基因（SRY);
[0238] 10 μ g/ml的高泳动家族性别决定基因9 (S0X9);
[0239] 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；
[0240] 10ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子；
[0241] 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO);
[0242] 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF);
[0243] 10ng/ml的干细胞因子；
[0244] 10ng/ml的白细胞介素3 ;
[0245] 10ng/ml的白细胞介素6 ;
[0246] 10ng/ml的白细胞介素11 ;
[0247] 10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF);
[0248] 10ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF);
[0249] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0250] 10 μ M 的烟醜胺（Nicotinamide);
[0251] 10ng/ml的表皮生长因子（EGF);
[0252] 10ng/ml的神经营养因子（NT4);
[0253] 10ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF);
[0254] 10ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF);
[0255] 10ng/ml的神经生长因子（NGF);
[0256] 10ng/ml的类胰岛素生长因子-I (IGF-I);
[0257] 10ng/ml的生长因子；以及
[0258] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0259] 该试剂盒可以在用于治疗涉及器官再生再造和修复的疾病的药物的自体生殖干 细胞的制备过程中应用，其中可以治疗的涉及器官再生再造和修复的疾病包括睾丸衰老； 自体生殖干细胞包括雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞。可以使用本发明中提供 的制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法制备自体生殖干细胞以及雄性 非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞。
[0260] 通过本发明的上述方法及试剂盒，并且本发明改善了用于获得男性或雄性非睾丸 源性蛋白诱导性自体生殖干细胞生产技术，在男性或雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖 干细胞的产量、纯度、生产速度方面具有显著优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0261] 图1是周围单个核细胞（PBMC)在显微镜下的示图。
[0262] 图2是PBMC逆向分化后得到的非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞(M-PiGSC) 在显微镜下的示图。
[0263] 图3至图6是示出了细胞鉴定结果的表型检测图。
[0264] 图7是M-PiGSC细胞的染色体核型检测图。
[0265] 图8示出了干细胞转化率测定的结果的曲线图。
【具体实施方式】
[0266] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的 范围。
[0267] 实施例1试剂盒的制各
[0268] 在10-100级洁净度的安全操作台里操作，4-10度的低温条件下配制。
[0269] 在500ml的RPMI 640培养液中，分别加入：
[0270] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 ;
[0271] 10ng/ml的干细胞因子；
[0272] 10ng/ml的白细胞介素3 ;
[0273] 10ng/ml的白细胞介素6 ;
[0274] 10ng/ml的白细胞介素11 ;
[0275] 10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF);
[0276] 10ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF);
[0277] 10 μ g/ml的岩藻多糖；
[0278] 10 μ g/ml的葡聚糖硫酸酯；
[0279] IOnM 的 AMD 3100 (1，1' _[1，4-亚苯基二（亚甲基）]-二-1，4, 8, 11);
[0280] 10 μ M 的 M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及
[0281] 10 μ M的氨羟二磷酸二钠。
[0282] 充分溶解，然后经0. 22微米孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液Α。
[0283] 在500ml的DMEM培养液中，分别加入：
[0284] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 ;
[0285] 10 μ M的1-磷酸-神经鞘氨醇；
[0286] 10μ g/ml的骨形态发生蛋白2 (ΒΜΡ-2);
[0287] 10 μ g/ml的生长分化因子-5 (⑶F-5);
[0288] 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；
[0289] 10ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子；
[0290] 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO);
[0291] 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF);
[0292] 10ng/ml的干细胞因子；
[0293] 10ng/ml的白细胞介素3 ;
[0294] l-1000ng/ml 的白细胞介素 6 ;
[0295] 10ng/ml的白细胞介素11 ;
[0296] 10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF);
[0297] 10ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF);
[0298] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0299] 10 μ M的烟酰胺；
[0300] 10ng/ml的神经营养因子（ΝΤ4);
[0301] 10ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF);
[0302] 10ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF);
[0303] 10ng/ml的神经生长因子（NGF);
[0304] 10ng/ml的类胰岛素生长因子-I (IGF-I);以及
[0305] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0306] 充分溶解，然后经0. 22微米孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液B。
[0307] 在500ml的M16培养液中，分别加入：
[0308] 10 μ M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 ;
[0309] 10ng/ml的支持细胞特异蛋白（AMH);
[0310] l〇ng/ml的支持细胞特异蛋白（I型类固醇原生生长因子（SFl));
[0311] l〇ng/ml的Y染色体性别决定基因（SRY);
[0312] 10 μ g/ml的高泳动家族性别决定基因9 (S0X9);
[0313] 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子；
[0314] 10ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子；
[0315] 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO);
[0316] 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF);
[0317] 10ng/ml的干细胞因子；
[0318] 10ng/ml的白细胞介素3 ;
[0319] 10ng/ml的白细胞介素6 ;
[0320] 10ng/ml的白细胞介素11 ;
[0321] 10ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF);
[0322] 10ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF);
[0323] 10ng/ml 的激活素 A (activin A);
[0324] 10 μ M 的烟醜胺（Nicotinamide);
[0325] 10ng/ml的表皮生长因子（EGF);
[0326] 10ng/ml的神经营养因子（NT4);
[0327] 10ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF);
[0328] 10ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF);
[0329] 10ng/ml的神经生长因子（NGF);
[0330] lOng/ml的类胰岛素生长因子-I (IGF-I);
[0331] 10ng/ml的生长因子；以及
[0332] 10 μ g/ml的地塞米松。
[0333] 充分溶解，然后经0. 22微米孔径的滤器过滤、消毒，配制成细胞培养液C。
[0334] 将细胞培养液A、细胞培养液B以及细胞培养液C分别置于试剂盒的三个相互隔离 的容器内，从而制成用于制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的试剂盒。
[0335] 实施例2非睾丸源件蛋白诱导件雄件自体牛葙干细朐（M-PiGSC)的制各
[0336] 如图1所示，抽取男性静脉血液(人静脉血来源于
【发明者】本人及志愿者)50ml，使用 常规Ficoll离心分离技术对男性静脉血液进行离心分离，从而获取血液单个核细胞。将获 得的单个核细胞以5xl0 6的密度，用实施例1中配制的细胞培养液A，在37°C和5%的CO2培 养箱中培养3天；然后换用实施例1中配制的细胞培养液B，继续对单个核细胞以5xl0 6的 密度进行培养6天；然后换用实施例1中配制的细胞培养液C，继续对单个核细胞以5xl06 的密度进行培养6天。轻轻吹打分别在细胞培养液A、细胞培养液B及细胞培养液C中培 养后的体细胞或单个核细胞，使细胞完全悬浮后，收集细胞于离心管中，进行离心操作，然 后使用生理盐水对悬浮的细胞进行清洗操作，重复3次后，将细胞悬浮于生理盐水中。如 图2所示，得到非睾丸源性蛋白诱导性雄性自体生殖干细胞。将得到的非睾丸源性蛋白诱 导性雄性自体生殖干细胞以IXlOVml至IXlO 6Ail的细胞密度与等体积的二甲基亚砜和 10%的低分子右旋糖酐的混合液混合，将混合物降温至-80°C，然后转移到-186°C液氮中深 低温保存。
[0337] 实施例3
[0338] 实施例3使用与实施例2相同的方法制备非睾丸源性蛋白诱导性雄性自体生殖干 细胞。其不同之处仅在于选择3-5月龄的Balb/C雄性小鼠(购买自中国医学科学院放射医 学院(天津)，动物合格证号=SCXK (津）2010-0002)，采集其周围血及股骨血液，从而替代男 性静脉血液。
[0339] 通过以下试验对实施例2及实施例3制得的M-PiGSC进行类型性鉴定及安全鉴 定。
[0340] 实验1细胞鉴定
[0341] 1)用已预先制得的聚-D-赖氨酸的载玻片，选择实施例2中制备的非睾丸源性蛋 白诱导性雄性自体生殖干细胞的最佳的细胞悬液浓度，用细胞制片离心机在1800RCF下 转动抛片2分钟制成玻片并做好标记，抛片上细胞密度(细胞均匀，密度适当)。抛片晾干后 存放于-20度冰箱中冻存。从-20度冰箱中取出细胞玻片在室温晾干，在反面用记号笔划 定区域。然后使用4%多聚甲醒(购买自Solarbio)固定，经过2%的Triton X-IOO打孔10 分钟以及磷酸盐缓冲液（PBS，pH值为7. 4)的清洗后，使用10%正常山羊血清在室温的条件 下封闭1小时，得到样品。将第一抗体试剂加入样品中，所使用的第一抗体为兔抗人c-Kit 多克隆抗体（1:100;购买自Abcam公司，产品编号为ab5506)，在4°C的条件下使样品中的 抗原与第一抗体反应12小时(过夜)。然后在使用磷酸盐缓冲液（PBS)清洗样品后，将与第 一抗体相对应的第二抗体加入到样品中，第二抗体为FITC标记标记的羊抗兔IgG (1:200 ; 购买自Chemicon公司，产品编号为AP132F)使样品中的第一抗体与第二抗体反应1小时。 在室温的条件下使用DAPI (1:1000)进行染核步骤。在使用磷酸盐缓冲液PBS清洗后，对样 品进行封片剂封片操作，所使用封边剂为甘油/PBS封片剂（甘油：PBS=1 :9, pH8. 0-8. 5,美 工生物公司制造)。最后使用尼康荧光显微镜观察拍照，在6-8小时内完成各种拍照。
[0342] 2)使用与1)中相同的方法进行细胞鉴定，其不同之处仅在于所使用的第一抗体为 兔抗人DDX4/MVH多克隆抗体（1:100,购买自Abcam公司，产品编号为abl3840)。
[0343] 3)使用与1)中相同的方法进行细胞鉴定，其不同之处仅在于所使用的第一抗体为 兔抗人Fragilis多克隆抗体（1:100;购买自Abcam公司，产品编号为ab74699)。
[0344] 4)使用与1)中相同的方法进行细胞鉴定，其不同之处仅在于所使用的干细胞为实 施例3中制备的非睾丸源性蛋白诱导性雄性自体生殖干细胞，并且所使用的第一抗体为兔 抗鼠 DAZL多克隆抗体（1:100;购买自Abcam公司，产品编号为ab34139)。
[0345] 实验结果
[0346] 图3至图6是示出了细胞鉴定结果的表型检测图，其中，图3示出了实施例2制得 的细胞在与一抗(兔抗人c-Kit多克隆抗体)及二抗（FITC标记标记的羊抗兔IgG)反应后， 可以在荧光显微镜观察到荧光部分，从而说明实施例2中所制得的细胞为男性非睾丸源性 蛋白诱导性雄性自体生殖干细胞。
[0347] 图4示出了实施例2制得的细胞在与一抗(兔抗人DDX4/MVH多克隆抗体）及二抗 (FITC标记标记的羊抗兔IgG)反应后，可以在荧光显微镜观察到荧光部分，从而说明实施 例2中所制得的细胞为男性非睾丸源性蛋白诱导性雄性自体生殖干细胞。
[0348] 图5示出了实施例2制得的细胞在与一抗(兔抗人Fragilis多克隆抗体）及二抗 (FITC标记标记的羊抗兔IgG)反应后，可以在荧光显微镜观察到荧光部分，从而说明实施 例2中所制得的细胞为男性非睾丸源性蛋白诱导性雄性自体生殖干细胞。
[0349] 图6示出了实施例3制得的细胞在与一抗(兔抗鼠 DAZL多克隆抗体)及二抗（FITC 标记标记的羊抗兔IgG)反应后，可以在荧光显微镜观察到荧光部分，从而说明实施例3中 所制得的细胞为雄性小鼠的非睾丸源性蛋白诱导性雄性自体生殖干细胞。
[0350] 实验2染色体分折
[0351] 挑取十个实施例2中制备的非睾丸源性蛋白诱导性雄性自体生殖干细胞集落，将 其接种于细胞培养液中，在5%的C02, 37°C条件下培养68小时。在培养终止前2-4小时，向 培养液中加入秋水仙素(用Iml注射器5号针尖滴加2滴)，使培养液中的秋水仙素的浓度 为0. 07 μ g/ml。将处理后的培养物全部转移到洁净的离心管中，以IOOOrpm的离心速率在 离心机中进行8-10分钟的离心操作,然后弃上清液。取8ml低渗液在37°C下进行预热,然 后将其加入上述离心管中，并用滴管搅拌均匀，置于37°C的恒温水浴中进行15分钟-25分 钟的低渗处理。向低渗处理后的浊液中加入〇. 5ml的固定液，轻轻振荡试管使其混合均匀， 然后在IOOOrmp的离心速率下在离心机中进行8-10分钟的离心操作。在离心操作之后，去 除试管中的上清液，再向试管中加入5ml的固定液，静置20分钟，然后在IOOOrmp的离心速 率下在离心机中进行8-0分钟的离心操作，去除上清液。将上述加固定液的操作重复进行 3次。最终形成DNA悬液。使用滴管吸取制得的DNA悬液10ml-20ml，将其滴在干燥洁净的 载玻片上，轻轻吹散，气干。然后使用1:10的Giemsa染色剂对其进行5分钟-10分钟的染 色。使用细水洗去多余的染色液，气干。在显微镜下使用低倍物镜进行观察，寻找分散良 好、染色适中的分裂相，然后使用油镜观察染色体形态并计数，数码照相机照相。
[0352] 实验结果
[0353] 如图7所示，实施例2中制得的非睾丸源性蛋白诱导性雄性自体生殖干细胞 (M-PiGSC)的DNA数量及形态均与体细胞中DNA的数量及形态相同。实验结果说明使用本 发明中的方法没有改变细胞DNA基因组。
[0354] 实验3干细胞转化率(生产率）测定
[0355] 根据与实施例2及实施例3中的方法，按下表中分组个方式对人和小鼠的PBMC分 别进行分组培养：
[0356]
【权利要求】
1. 一种制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的方法，包括： 将体细胞在细胞培养液A中培养1-3天； 在细胞培养液B中继续培养1-6天； 然后在细胞培养液C中继续培养1-6天；以及 收集雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞； 其中所述培养液A是RPMI1640培养液，其中含有： 1-100 ii M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 (C14H21N30. 2HC1); l-100ng/ml的干细胞因子； l-100ng/ml的白细胞介素3 ; l-100ng/ml的白细胞介素6 ; l-100ng/ml的白细胞介素11 ; l-100ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l-100ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); 1-100 li g/ml的岩藻多糖； 1-100 g/ml的葡聚糖硫酸酯； l-100nM 的 AMD 3100(1，1，_[1，4_ 亚苯基二（亚甲基）]-二 _1，4,8，11); 1-100 iiM 的 M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 1-100 ii M的氨羟二磷酸二钠； 其中所述培养液B是DMEM培养液，其中含有： 1-100 ii M 的 RH0 激酶抑制剂 Y-27632 (C14H21N30 ? 2HC1); 1-100 ii M的1-磷酸-神经鞘氨醇； l-100ii g/ml的骨形态发生蛋白2(BMP-2); 1-100 ii g/ml的生长分化因子-5 (⑶F-5); l-1000ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l-1000ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 100-10000IU/ml的促红细胞生成素（EP0); l-200ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF); l-1000ng/ml的干细胞因子； l-1000ng/ml的白细胞介素3 ; l-1000ng/ml的白细胞介素6 ; l-1000ng/ml的白细胞介素11 ; l-1000ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l-1000ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); l-1000ng/ml 的激活素 A(activin A); 1-100 ii M的烟酰胺； l-1000ng/ml的神经营养因子（NT4); l-1000ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l-1000ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l-1000ng/ml的神经生长因子（NGF); l-1000ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l);以及 1-1000 li g/ml的地塞米松； 其中所述培养液C是M16培养液，其中含有： 1-100 ii M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 ; l-1000ng/ml的支持细胞特异蛋白（AMH); l-1000ng/ml的I型类固醇原生生长因子（SF1); l-1000ng/ml的Y染色体性别决定区（Y染色体性别决定基因（SRY)); l-100ii g/ml的高泳动家族性别决定基因9(SOX9); l-1000ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l-1000ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO); l-200ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF); l-100ng/ml的干细胞因子； l-100ng/ml的白细胞介素3 ; l-100ng/ml的白细胞介素6 ; l-100ng/ml的白细胞介素11 ; l-1000ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l-1000ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); l-1000ng/ml 的激活素 A(activin A); 1-100 uM 的烟醜胺（Nicotinamide); l-1000ng/ml的表皮生长因子（EGF); l-1000ng/ml的神经营养因子（NT4); l-1000ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l-1000ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l-1000ng/ml的神经生长因子（NGF); l-1000ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l); l-1000ng/ml的生长因子；以及 1-100 ii g/ml的地塞米松。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，在所述培养液A中的培养条件是温度为37°C和 5%的C02环境。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养液A是RPMI 1640培养液，其中含有： 10 ii M的RH0激酶抑制剂Y-27632 ; 10ng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; 10ng/ml的白细胞介素6 ; l〇ng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); l〇yg/ml的岩藻多糖； 10. g/ml的葡聚糖硫酸酯； 10nM 的 AMD 3100(1，1，-[1，4_ 亚苯基二（亚甲基）]-二-1，4,8，11); 10 iiM 的 M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 10 U M的氨羟二磷酸二钠； 所述培养液B是DMEM培养液，其中含有： 10. ii M 的 RH0 激酶抑制剂 Y-27632 (C14H21N30 ? 2HC1); 10. M的1-磷酸-神经鞘氨醇； 10U g/ml的骨形态发生蛋白2(BMP-2); 10. g/ml的生长分化因子-5 (⑶F-5); 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l〇ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 3000IU/ml的促红细胞生成素（EP0); 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF); 10ng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; l-1000ng/ml的白细胞介素6 ; l〇ng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的角质化细胞生长因子（G-CSF); 10ng/ml 激活素 A(activin A); 10. M的烟酰胺； l〇ng/ml的神经营养因子（NT4); l〇ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l〇ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l〇ng/ml的神经生长因子（NGF); l〇ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l);以及 10. ii g/ml的地塞米松； 所述培养液C是M16培养液，其中含有： 10. ii M的RHO激酶抑制剂Y-27632 ; l〇ng/ml的支持细胞特异蛋白（AMH); lOng/ml的支持细胞特异蛋白（I型类固醇原生生长因子（SF1)); l〇ng/ml的Y染色体性别决定基因（SRY); 10U g/ml的高泳动家族性别决定基因9(SOX9); 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l〇ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO); 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF); 10ng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; lOng/ml的白细胞介素6 ; l〇ng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10 uM 的烟醜胺（Nicotinamide); l〇ng/ml的表皮生长因子（EGF); l〇ng/ml的神经营养因子（NT4); l〇ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l〇ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l〇ng/ml的神经生长因子（NGF); l〇ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l); 10ng/ml的生长因子；以及 lOii g/ml的地塞米松。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养液A是RPMI 1640培养液，其中含有： 10 ii M的RHO激酶抑制剂Y-27632 ; 10ng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; 10ng/ml的白细胞介素6 ; l〇ng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); l〇yg/ml的岩藻多糖； 10. g/ml的葡聚糖硫酸酯； 10nM 的 AMD 3100(1，1，_[1，4_ 亚苯基二（亚甲基）]-二 _1，4,8，11); 10iiM 的 M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 10 的氨羟二磷酸二钠。
5. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养液B是DMEM培养液，其中含有： 10. ii M的RHO激酶抑制剂Y-27632 ; 10. M的1-磷酸-神经鞘氨醇； 10U g/ml的骨形态发生蛋白2(BMP-2); 10. g/ml的生长分化因子-5 (⑶F-5); 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l〇ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO); 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF); 10ng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; l-1000ng/ml的白细胞介素6 ; lOng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的角质化细胞生长因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10. M的烟酰胺； l〇ng/ml的神经营养因子（NT4); l〇ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l〇ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l〇ng/ml的神经生长因子（NGF); l〇ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l);以及 lOii g/ml的地塞米松。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养液C是M16培养液，其中含有： 10 ii M的RHO激酶抑制剂Y-27632 ; l〇ng/ml的支持细胞特异蛋白（AMH); lOng/ml的支持细胞特异蛋白（I型类固醇原生生长因子（SF1)); l〇ng/ml的Y染色体性别决定基因（SRY); 10U g/ml的高泳动家族性别决定基因9(S0X9); 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l〇ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO); 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF); 10ng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; 10ng/ml的白细胞介素6 ; l〇ng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10 uM 的烟醜胺（Nicotinamide); l〇ng/ml的表皮生长因子（EGF); l〇ng/ml的神经营养因子（NT4); l〇ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l〇ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l〇ng/ml的神经生长因子（NGF); l〇ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l); 10ng/ml的生长因子；以及 lOii g/ml的地塞米松。
7. 根据权利要求1-6所述的方法，进一步包括： 将收集的所述自体生殖干细胞细胞冷冻保存，所述冷冻保存步骤包括： 将产生的所述自体生殖干细胞以lX105/ml至lX106/ml的细胞密度与等体积的二甲 基亚砜和10%的低分子右旋糖酐的混合液混合； 降温至_80°C ; 然后转移到_186°C液氮中深低温保存。
8. 根据权利要求1-6所述的方法，其中，所述体细胞包括但不限于雄性动物的脐带血 细胞、胎盘细胞、皮肤细胞、血液有核细胞、脂肪细胞等。
9. 一种用于制备雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞的试剂盒，包括： 细胞培养液A、细胞培养液B和细胞培养液C ; 其中所述培养液A是RPMI 1640培养液，其中含有： 1-100 ii M 的 RH0 激酶抑制剂 Y-27632 (C14H21N30. 2HC1); l-100ng/ml的干细胞因子； l-100ng/ml的白细胞介素3 ; l-100ng/ml的白细胞介素6 ; l-100ng/ml的白细胞介素11 ; l-100ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l-100ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); 1-100 li g/ml的岩藻多糖； 1-100 g/ml的葡聚糖硫酸酯； l-100nM 的 AMD 3100(1，1，_[1，4_ 亚苯基二（亚甲基）]-二 _1，4,8，11); 1-100 iiM 的 M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 1-100 ii M的氨羟二磷酸二钠； 其中所述培养液B是DMEM培养液，其中含有： 1-100 ii M 的 RH0 激酶抑制剂 Y-27632 (C14H21N30 ? 2HC1); 1-100 ii M的1-磷酸-神经鞘氨醇； l-100ii g/ml的骨形态发生蛋白2(BMP-2); 1-100 ii g/ml的生长分化因子-5 (⑶F-5); l-1000ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l-1000ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 100-10000IU/ml的促红细胞生成素（EP0); l-200ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF); l-1000ng/ml的干细胞因子； l-1000ng/ml的白细胞介素3 ; l-1000ng/ml的白细胞介素6 ; l-1000ng/ml的白细胞介素11 ; l-1000ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l-1000ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); l-1000ng/ml 的激活素 A(activin A); 1-100 ii M的烟酰胺； l-1000ng/ml的神经营养因子（NT4); l-1000ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l-1000ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l-1000ng/ml的神经生长因子（NGF); l-1000ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l);以及 1-1000 li g/ml的地塞米松； 其中所述培养液C是M16培养液，其中含有： 1-100 ii M 的 RHO 激酶抑制剂 Y-27632 ; l-1000ng/ml的AMH(支持细胞特异蛋白）； l-1000ng/ml的I型类固醇原生生长因子（SF1); l-1000ng/ml的Y染色体性别决定区（Y染色体性别决定基因（SRY)); l-100ii g/ml的高泳动家族性别决定基因9(SOX9); l-1000ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l-1000ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO); l-200ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（⑶NF); l-100ng/ml的干细胞因子； l-100ng/ml的白细胞介素3 ; l-100ng/ml的白细胞介素6 ; l-100ng/ml的白细胞介素11 ; l-1000ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l-1000ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); l-1000ng/ml 的激活素 A(activin A); 1-100 uM 的烟醜胺（Nicotinamide); l-1000ng/ml的表皮生长因子（EGF); l-1000ng/ml的神经营养因子（NT4); l-1000ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l-1000ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l-1000ng/ml的神经生长因子（NGF); l-1000ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l); l-1000ng/ml的生长因子；以及 1-100 ii g/ml的地塞米松。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述培养液A是RPMI 1640培养液，其中含 有： 10. ii M的RH0激酶抑制剂Y-27632 ; 10ng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; 10ng/ml的白细胞介素6 ; l〇ng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); lOng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); lOug/ml的岩藻多糖； 10. g/ml的葡聚糖硫酸酯； 10nM 的 AMD 3100(1，1，_[1，4_ 亚苯基二（亚甲基）]-二 _1，4,8，11); 10iiM 的 M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 10 U M的氨羟二磷酸二钠； 所述培养液B是DMEM培养液，其中含有： 10. ii M的RH0激酶抑制剂Y-27632 ; 10. M的1-磷酸-神经鞘氨醇； 10U g/ml的骨形态发生蛋白2(BMP-2); 10. g/ml的生长分化因子-5 (⑶F-5); 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l〇ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 3000IU/ml的促红细胞生成素（EP0); 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF); 10ng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; l-1000ng/ml的白细胞介素6 ; l〇ng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10. M的烟酰胺； l〇ng/ml的神经营养因子（NT4); l〇ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l〇ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l〇ng/ml的神经生长因子（NGF); l〇ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l);以及 10. ii g/ml的地塞米松； 所述培养液C是M16培养液，其中含有： 10. ii M的RHO激酶抑制剂Y-27632 ; l〇ng/ml的支持细胞特异蛋白（AMH); lOng/ml的支持细胞特异蛋白（I型类固醇原生生长因子（SF1)); l〇ng/ml的Y染色体性别决定基因（SRY); 10U g/ml的高泳动家族性别决定基因9(SOX9); 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l〇ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO); 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF); lOng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; 10ng/ml的白细胞介素6 ; l〇ng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10 uM 的烟醜胺（Nicotinamide); l〇ng/ml的表皮生长因子（EGF); l〇ng/ml的神经营养因子（NT4); l〇ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l〇ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l〇ng/ml的神经生长因子（NGF); l〇ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l); 10ng/ml的生长因子；以及 lOii g/ml的地塞米松。
11. 根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述培养液A是RPMI 1640培养液，其中含 有： 10. ii M的RHO激酶抑制剂Y-27632 ; 10ng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; 10ng/ml的白细胞介素6 ; l〇ng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); l〇yg/ml的岩藻多糖； 10. g/ml的葡聚糖硫酸酯； 10nM 的 AMD 3100(1，1，_[1，4_ 亚苯基二（亚甲基）]-二 _1，4,8，11); 10iiM 的 M-阿仑膦酸钠（M-ALENDRONATE SODIUM TRIHYDRATE);以及 10 的氨羟二磷酸二钠。
12. 根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述培养液B是DMEM培养液，其中含有： 10. ii M的RHO激酶抑制剂Y-27632 ; 10. M的1-磷酸-神经鞘氨醇； 10U g/ml的骨形态发生蛋白2(BMP-2); 10. g/ml的生长分化因子-5 (⑶F-5); 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l〇ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO); 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF); lOng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; 1-lOOOng/ml的白细胞介素6 ; l〇ng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10. M的烟酰胺； l〇ng/ml的神经营养因子（NT4); l〇ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l〇ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l〇ng/ml的神经生长因子（NGF); l〇ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l);以及 lOii g/ml的地塞米松。
13.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述培养液C是M16培养液，其中含有： 10 ii M的RHO激酶抑制剂Y-27632 ; l〇ng/ml的支持细胞特异蛋白（AMH); lOng/ml的支持细胞特异蛋白（I型类固醇原生生长因子（SF1)); l〇ng/ml的Y染色体性别决定基因（SRY); 10U g/ml的高泳动家族性别决定基因9(S0X9); 100ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子； l〇ng/ml的酸性成纤维细胞生长因子； 3000IU/ml的促红细胞生成素（EPO); 20ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF); 10ng/ml的干细胞因子； 10ng/ml的白细胞介素3 ; 10ng/ml的白细胞介素6 ; l〇ng/ml的白细胞介素11 ; l〇ng/ml的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF); l〇ng/ml的粒细胞集落刺激因子（G-CSF); 10ng/ml 的激活素 A(activin A); 10 uM 的烟醜胺（Nicotinamide); l〇ng/ml的表皮生长因子（EGF); l〇ng/ml的神经营养因子（NT4); l〇ng/ml的脑源性神经营养因子（BDNF); l〇ng/ml的角质化细胞生长因子（KGF); l〇ng/ml的神经生长因子（NGF); l〇ng/ml的类胰岛素生长因子-l(IGF-l); 10ng/ml的生长因子；以及 10li g/ml的地塞米松。
14. 权利要求9-13所述的试剂盒在制备自体生殖干细胞以用于治疗涉及器官再生再 造和修复的疾病的药物中的应用。
15. 根据权利要求14所述的应用，其中，所述疾病包括睾丸衰老。
16. 权利要求9-13所述的试剂盒在建立雄性非睾丸源性蛋白诱导性自体生殖干细胞 库的应用。
17. 根据权利要求1-6的方法制备的自体生殖干细胞。
18. 权利要求1-6的方法制备的所述自体生殖干细胞在用于治疗涉及器官再生再造和 修复的疾病的药物中的应用。
19. 权利要求1-6的方法制备的所述自体生殖干细胞在建立雄性非睾丸源性蛋白诱导 性自体生殖干细胞库的应用。
【文档编号】A01N1/02GK104419658SQ201310362164
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】林雄斌, 林柳吟 申请人:林雄斌