一株乳酸链球菌及在微生物发酵制备饲料添加剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一株能够发酵利用豆粕并产生Nisin的微生物菌种——乳酸链球菌（Streptococcus?lactis）2013-DP1，及其在微生物发酵制备饲料添加剂中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期：2013年6月21日，保藏编号：CCTCC?No：M2013275。利用该菌株可以进行豆粕等饲料原料的发酵处理，既可以提高饲料原料中蛋白质和可溶性小肽（酸溶蛋白）的含量，也产生较高活性的Nisin。该菌株用于饲料产业，具有极大的市场潜力。
【专利说明】一株乳酸链球菌及在微生物发酵制备饲料添加剂中的应用(-)【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及经筛选诱变获得的一株新菌株-乳酸链球菌(Streptococcus
lactis) 2013-DP1，及其在微生物发酵制备饲料添加剂中的应用 。
(二)【背景技术】
[0002]饲料行业及相关产品中，为了畜禽疾病的防治，往往在饲料中添加抗生素。随着抗生素的大量广泛用于饲料中和人们对食品质量的要求越来越高，抗生素的副作用及潜在的危害和风险已经日益暴露出来。抗生素的长期添加使用，能使许多病原菌产生耐药性，同时，在畜产品中产生严重的药物残留，从而对人类健康产生了严重的不利影响，抗生素在饲料业中的应用，已面临着淘汰或禁用的局面。开发无毒无公害的新型微生态制剂和抗菌剂等来代替或降低抗生素使用量，已成为饲料添加剂研发的一项紧迫的任务。
[0003]抗菌肽是生物体内产生的一种具有抗菌活性的小分子多肽，由20~60个氨基酸残基组成，具有强碱性、热稳定性、抗菌活性高和抗菌谱广等特点。抗菌肽具有与抗生素不同的抗菌机制，它主要作用于细胞膜，造成细胞膜的穿孔，这样就不需要一些特殊的受体，因此靶菌株不易产生抗性突变。抗菌肽在医药、食品、饲料中已经开始应用。利用能够产生抗菌肽的微生物来发酵生产饲料微生态添加剂是一条很有潜力的途径，此类添加剂在提高动物的饲料利用率，增加生产性能，调节肠道微生态平衡，增加免疫力等方面具有显著的促进作用。此类添加剂还具有无毒副作用、无残留、不引起抗药性等优点，可以替代或降低抗生素使用，用于动物生产可以大幅提高我国畜产品的国际竞争力。
[0004]乳酸链球菌素(Nisin)是由乳酸链球菌产生的一种抗菌肽,成熟的Nisin分子由34个氨基酸残基组成，其化学结构包含有由5个硫醚桥组成的分子内环，分子量为3510Da。Nisin能够有效地抑制大多数革兰氏阳性细菌的生长，比如金黄色葡萄球菌、小球菌、明串珠菌、李斯特氏菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌等，因而被广泛用作食品绿色防腐剂。然而在饲料产业中，Nisin尚未被广泛应用。Nisin用于饲料添加剂的优点主要体现在两个方面:一是用作添加剂后可以有效的防止沙门氏菌等致病菌的污染，保障饲料的品质，减少防腐剂的应用，降低对于饲养动物以及食用人体的危害；二是对于饲养动物的作用，Nisin可以有效的防止致病菌对动物肠道的影响，可以有效的抑制肠道内致病菌并降低致病率，但不会影响动物肠道内的有益微生物的生长，减少抗生素的使用，而且Nisin进入肠道后会被蛋白酶降解，不会在体内残留。
[0005]此外，近年来我国畜牧业的迅猛发展造成了国内常规饲料资源短缺，尤其是蛋白饲料资源的缺乏显得尤为突出，缺口很大。大豆和鱼粉是主要的饲料蛋白原料，近年来大豆的需求不断增加，据统计，2008年我国进口大豆达到3743万吨，2013年预计全年进口大豆即将突破6000万吨。而进口鱼粉也是量价齐升，给养殖业带来沉重的负担。因此，开发新型的蛋白词料来源和生广闻品质的蛋白词料也已成为词料生广的紧迫任务。
[0006]随着我国农业、食品工业的发展，农产品及食品在加工过程中产生了大量的柏类、糟渣类废弃物。据不完全统计，我国仅酿造、调味品、味精、淀粉、白酒、黄酒、淀粉糖、生物农药、果品加工工业部门每年度可生产糟渣约7000万吨。这些含蛋白的废弃物，常常被人们简单处理，不能发挥其潜有功能。近年来，人们渐渐发现，利用微生物发酵的方法，可以对其进行科学利用，不但可减轻环境压力，减少资源浪费，同时也能够提高企业的经济效益。例如豆柏，它是大豆等提取脂肪类物质后的副产物，豆柏类物质已经成功开发成为可部分替代鱼粉的植物蛋白饲料原料，近年来豆柏已经在养殖业中广泛应用。研究表明利用微生物发酵法处理豆柏后，可以通过微生物生长利用以及分泌的蛋白酶系对豆柏中的抗营养因子和抗原蛋白进行一定程度的降解，降低这些不良物质在豆柏中的水平，显著改善豆柏的营养品质，实现?柏的闻效利用。
(三)
【发明内容】
[0007]针对以上问题，本发明提供了一株能够发酵利用豆柏并产生Nisin的微生物菌
种-乳酸链球菌(Streptococcus lactis)2013-DP1,及其在微生物发酵制备饲料添加剂
中的应用。
[0008]本发明采用的技术方案是: [0009]一株乳酸链球菌(Streptococcus lactis)2013_DPl,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，邮编:430072，保藏日期:2013年6月21日，保藏编号:CCTCC No:M2013275o
[0010]本发明通过紫外诱变法同时对该菌产生Nisin和发酵利用转化豆柏的能力进行了改良育种，获得了乳酸链球菌突变菌株2013-DP1，利用该菌株进行豆柏发酵以生产既产生抗菌肽Nisin又富含酸溶蛋白(可溶性小肽)的蛋白饲料添加剂发酵豆柏。以金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)为指示菌,测定了菌株产生Nisin的能力，发现突变株2013-DP1产Nisin的效价比出发菌株(WT)效价提高了 86.10%(出发菌株平均效价为769.4IU/ml，突变株2013-DP1效价1431.9IU/ml)。乳酸链球菌可以很好地利用豆柏为培养基进行发酵生长，发酵豆柏的粗蛋白含量和酸溶蛋白含量都得到提高。本发明中，选育的突变菌株2013-DP1发酵S.柏后,S.柏的粗蛋白、酸溶蛋白含量也比出发菌株提闻:出发菌株发酵豆柏的粗蛋白含量为50.8%，突变菌株2013-0?1为51.2%;出发菌株发酵豆柏的酸溶蛋白含量为8.8%，突变菌株2013-DP1为11.3%。豆柏发酵后，大分子量的蛋白质降解为可溶性的小肽，便于动物消化吸收，显著提高了饲料原料的营养价值并且改善了动物营养水平和促进了健康。发酵该菌株可以用于饲料蛋白添加剂的生产，同时可以产生抗菌肽Nisin，降低饲料中抗生素的添加量，提高动物养殖水平和动物产品竞争力，给养殖业带来显著经济效益。
[0011]本发明还涉及所述的乳酸链球菌2013-DP1在微生物发酵制备抗菌肽Nisin中的应用。
[0012]乳酸链球菌菌株2013-DP1可以在MSR培养基上生长繁殖，培养温度30°C，在该培养基上生长较好并产生高活性Nisin，因此可以利用本发明菌株直接制备Nisin。
[0013]MSR培养基组成如下:蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠 5g/L，柠檬酸二胺 2g/L，Tween801g/L，K2HP042g/L，MgSO4.7Η200.2g/L, MnSO4.H2O0.05g/L，CaC0320g/L，琼脂15g/L，溶剂为水，pH6.8。培养基在121°C下灭菌20min。
[0014]乳酸链球菌菌株2013-DP1菌落、形态学、培养特征:乳酸链球菌是一种革兰氏阳性细菌，能产生乳酸和乳酸链球菌素Nisin。在MSR培养基上，乳酸链球菌菌落呈现乳白、淡白等颜色，菌落较光滑，湿润。产生的Nisin主要抑制革兰氏阳性细菌的生长，如金黄色葡萄球菌等。乳酸链球菌菌株2013-DP1可以在含有蛋白胨、酵母膏作为氮源、以蔗糖或可溶性淀粉作为碳源、另外添加KH2PO4以及硫酸镁或蛋氨酸、半胱氨酸等物质的培养基上生长良好，并产生Nisin。最适培养温度均为30°C，最适pH为5.5。
[0015]本发明还涉及所述的乳酸链球菌2013-DP1在微生物发酵制备富含抗菌肽Nisin和可溶性小肽的饲料添加剂中的应用。
[0016]具体的，所述的应用为:取豆柏、麸皮、秸杆中的一种或多种，加水至含水量为40~50%，再经高温灭菌制成发酵培养基，接种乳酸链球菌2013-DP1，在发酵容器密封条件下，28~32 °C静置培养48~64h，发酵结束后，发酵产物直接作为饲料添加剂或经自然晾干或在50°C以下适度除水干燥(干燥至含水量为10~15%，w/w)后制成饲料添加剂。
[0017]本发明的有益效果主要体现在:本发明通过紫外诱变选育获得了一株乳酸链球菌2013-DP1，该菌株产生抗菌肽Nisin的能力较出发菌株显著提高，该菌株转化利用豆柏蛋白的能力也得到了提高。利用该菌株可以进行豆柏等饲料原料的发酵处理，既可以提高饲料原料中蛋白质和可溶性小肽(酸溶蛋白)的含量，也产生较高活性的Nisin。乳酸链球菌发酵的豆柏作为蛋白饲料添加剂用于养殖业，既可以减少价格较高的动物蛋白(如鱼粉)的用量，又可以可有效减少抗生素的大量使用，同时帮助提高饲料的消化与吸收，增强对于有害细菌等微生物的抵抗力，改善动物肠道健康，促进其生长。此外，乳酸链球菌2013-DP1对豆柏的转化利用以及分泌的蛋白酶系对豆柏中的抗营养因子和抗原蛋白可以进行一定程度的降解，降低了这些不良物质在豆柏中的水平，显著改善了豆柏的营养品质，实现豆柏的高效利用。该菌株用于饲料产业，具有极大的市场潜力。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为乳酸链球菌素`抑制金黄色葡萄球菌生长结果图。
(五)【具体实施方式】
[0019]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0020]实施例1:
[0021](I)乳酸链球菌分离培养和筛选方法:乳酸链球菌进行一定稀释后涂布在含有指示菌的固体检测培养基平板上，在30°C培养24h后，测量抑菌圈直径，挑取抑菌圈直径与菌落直径比较大的菌株进行保存后，测定产生Nisin的效价。Nisin对于革兰氏阳性细菌具有极强的抑菌性，选用金黄色葡萄球菌作为指示菌，通过乳酸链球菌产生的Nisin对其具有的抑菌性，使其产生抑菌圈，通过观察比较抑菌圈直径来筛选较优的菌株，并对其效价进行评定。
[0022]检测培养基组成如下:胰蛋白胨8g/L,酵母膏5g/L,葡萄糖5g/L, NaC15g/L,Na2HPO4.12H202g/L, Tween8010g/L，琼脂 18g/L，溶剂为水，ρΗ6.8。
[0023](2)乳酸链球菌紫外诱变方法:将超低温冰箱保存的菌种划线接种到MRS培养基上进行活化，在30°C培养箱培养48h。取无菌水1000 μ L加入灭菌EP管，用灭菌牙签挑取少量活化的菌放入其中，混合均匀后，用血球计数板计数(一般为107CFU/mL数量级)，将其稀释到104CFU/mL后取4(^1^稀释菌液，加入到一个灭菌平皿之中，再向其中加入3.61!^无菌水使其稀释到103CFU/mL，将平皿保持打开状态，在距离紫外灯光30cm处照射70s，保持黑暗5min后，将诱变菌液涂布到新鲜制备的混合有金黄色葡萄球菌的检测培养基平板上，将培养皿用黑布包裹后放入培养箱黑暗培养。在30°C培养24h后，取出观察抑菌圈直径，挑选出菌落直径较大、同时抑菌圈直径也较大的菌株。重复多次实验，挑选出多个菌株。部分菌株的抑菌圈效果见图1。
[0024](3) Nisin效价测定方法
[0025]利用管碟法进行各菌株产Nisin的效价测定。将需要检测的乳酸链球菌菌液用
0.02mol/L稀盐酸稀释酸化后,沸水浴5min,再5000r/min离心5min去掉沉淀,取上清,将上清液以100 μ L/杯的量注入到放置在混合有指示菌金黄色葡萄球菌的检测培养基上的牛津杯中，平稳的放入培养箱，在37 °C培养48h后测定抑菌圈直径。
[0026]Nisin的抑菌圈直径与其浓度呈线性关系，利用Nisin标准品以不同浓度配制后测定的对指示菌的抑菌圈直径绘出其标准曲线，将测试菌的抑菌圈直径与标准曲线进行对t匕，计算出其效价。具体方法是将灭菌后冷却至50°C左右的溶化的检测培养基中以2%接入量接入金黄色葡萄球菌悬浮液，利用管碟法，在完全冷却的培养基上放上灭菌牛津杯，向其中加入浓度依次为10、25、50、75、100几/1^的附8丨11标准品100 μ L，加完后将其小心平稳地放入37 °C恒温培养箱中培养48h。
[0027](4)产Nisin较高的乳酸链球菌突变株发酵豆柏筛选
[0028]利用上述方法，筛选出产Nisin效价较高的菌株多株，然后继续进行豆柏、玉米蛋白等饲料原料的发酵研究，筛选获得发酵蛋白的能力也较强的菌株。
[0029]将菌株分别接种到IOOmL的液体CM培养基中，200r/min，30°C培养24h得到种子液；取豆柏，加水至含水量为45 % (w/w), 121°C下灭菌20分钟制成发酵培养基，按照10%体积比的接种量接种种子液，混合均匀后，发酵容器用塑料袋密封进行低氧至无氧发酵，30°C静止培养48h，发酵后的基质低温(40~45°C)适度除水干燥(干燥至含水量约为10%)制成饲料添加剂成品，进行粗蛋白、酸溶蛋白等指标测定。每个菌株独立重复三次实验，每次至少3个平行样。
[0030]CM液体培养基组成:蔗糖10g/L，大豆蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L，K2HP0410g/L,NaC12g/L, MgSO4.7H200.2g/L，溶剂为水，pH6.9。
[0031]发酵豆柏(即前述制备的饲料添加剂成品)用凯氏定氮法测定粗蛋白含量，用三氯乙酸法测定酸溶蛋白含量。几株诱变菌株的Nisin效价以及发酵豆柏的粗蛋白和酸溶蛋白含量测定平均值见表1。从表中可以看出菌株UV-2产Nisin效价较高，该菌株发酵豆柏的粗蛋白和酸溶蛋白含量都得到了提高，说明发酵豆柏的能力得到了改良。因此，选择菌株UV-2进行保藏，命名为乳酸链球菌突变菌株2013-DP1，保藏编号CCTCC No:M2013275。原料豆柏的粗蛋白含量45.93%，酸溶蛋白含量4.58%。
[0032]表1:乳酸链球菌诱变菌株发酵豆柏指标测定
[0033]
【权利要求】
1.一株乳酸链球菌(Streptococcus lactis) 2013-DP1,保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，邮编:430072，保藏日期:2013年6月21日，保藏编号:CCTCC No:M2013275o
2.如权利要求1所述的乳酸链球菌2013-DP1在微生物发酵制备抗菌肽Nisin中的应用。
3.如权利要求1所述的乳酸链球菌2013-DP1在微生物发酵制备饲料添加剂中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为:取豆柏、麸皮、秸杆中的一种或多种，加水至含水量为40~50%，再经高温灭菌制成发酵培养基，接种乳酸链球菌2013-DP1，在发酵容器密封条件下，28~32°C静置培养48~64h，发酵结束后，发酵产物直接作为饲料添加剂或经自然晾干或在50°C以下除水干燥制成饲料添加剂。
【文档编号】A23K1/17GK103642709SQ201310383042
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年8月28日 优先权日:2013年8月28日
【发明者】朱廷恒, 汪琨, 崔志峰, 吴斌, 王渭霞 申请人:浙江工业大学