鸟巢蕨诱导绿色小球高频率植株再生方法
【专利摘要】鸟巢蕨诱导绿色小球高频率植株再生方法，属于植物培养方法【技术领域】。本发明以鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎为外植体材料，在附加苯基脲类细胞分裂素CPPU1.5~2.5mg/L和吲哚丁酸IBA0.1mg/L的MS改良培养基上诱导产生绿色小球，绿色小球的诱导频率达100%。在添加CPPU1.0~1.5mg/L和IBA0.1mg/L的MS改良培养基上进行绿色小球增殖，绿色小球每代增殖系数为5。在附加CPPU0.2~0.5mg/L和IBA0.1mg/L的MS改良培养基上绿色小球萌发形成幼苗。幼苗在附加IBA0.2~0.4mg/L的MS改良培养基上发育成具有根、茎、叶的完整小植株，成株率达95%以上。本方法适用于鸟巢蕨试管苗工厂化生产。
【专利说明】鸟巢蕨诱导绿色小球高频率植株再生方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种鸟巢蕨诱导绿色小球高频率植株再生方法，属于植物培养方法【技术领域】。
【背景技术】
[0002]截止目前，在12000种蕨类植物中，成功进行组织培养的仅占极少一部分，部分属种虽已组织培养成功，但存在繁殖周期长，增殖率低的问题(韩敬，赵莉.蕨类植物繁殖研究进展[J].安徽农业科学，2005, 33(7):1261-1263)。国内鸟巢蕨组织培养技术研究是通过苗的分化和苗丛扩繁、不定芽诱导和增殖途径繁殖试管苗的。以鸟巢蕨的嫩叶为外植体材料，不定芽诱导率达85%，芽丛的增殖率为6.4倍。(秦廷豪，邹宗兰.鸟巢蕨的组织培养[J].植物生理学通讯，2004，40(3):349 ;陈金典.鸟巢蕨组织培养育苗技术研究[J].福建农业科技，2010，2 (44-45))。
[0003]在本实验室进行的重复试验中，未能从所试鸟巢蕨品种的叶片诱导产生不定芽，显示该项技术仅适用于部分品种，因而需研制鸟巢蕨不同植株再生途径的组织培养技术。
[0004]在蕨类植物上利用外植体诱导出绿色小球(green globular bodies,简称GGB),类似于兰花的原球茎，绿色小球再经过培养获得完整的幼小植物个体(陆树刚，张光飞，苏文华，等.蕨类植物学[M].北京:高等教育出版社，2007:33-37)。国内外学者普遍认为GGB途径是蕨类植物一种高效率的繁殖途径。至今，国内外已从鹿角蕨、乌毛蕨、皱叶肾蕨、凤尾蕨等蕨类植物成功地诱导GGB，但鸟巢蕨成功报道仅国外一例(曾霞，庄南生.蕨类植物组织培养研究进展(综述)[J].亚热带植物科学，2002, 31 (增刊):37-43)。
[0005]Higuchi等发现BAP (6_苄基氨基嘌呤)有利于GGB的形成与增殖，并首次提出根状茎尖一苗一GGB —完整苗一移栽的植株再生和微繁殖新途径。Higuchi等以鸟巢蕨的根状茎为外植体，0.5mg/LBAP诱导产生绿色小球，绿色小球诱导率最高达50%，建立起试管苗繁殖技术(HIGUCHI H and AMAKI ff.Effects of 6-Benzhlaminopurine on theorgangenesis of Asplenium nidus L.through in vitro propagation[J].ScientiaHortculture, 1989, 37:351-359)。
【发明内容】
[0006]技术问题本发明要解决的技术问题和提出的技术任务是:
[0007]以鸟巢蕨的无菌苗的顶生短茎为外植体材料，通过选用苯基脲类细胞分裂素CPPU诱导和增殖绿色小球，提高绿色小球的诱导率和增殖率，建立高频率植株再生技术体系。
[0008]技术方案
[0009]鸟巢蕨诱导绿色小球高频率植株再生方法，包括:
[0010]I)材料
[0011]选用鸟桌厥无囷苗为材料；
[0012]2)培养基[0013]MS改良培养基由MS大量元素、MS微量元素与B5维生素组成，添加蔗糖30g/L，活性炭质量比0.l%，8g/L的琼脂条作为固化剂；
[0014]绿色小球诱导培养基:MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU1.5-2.5mg/L和生长素ΙΒΑ0.lmg/L ；
[0015]绿色小球增殖培养基:MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU1.0-1.5mg/L和生长素ΙΒΑ0.lmg/L ；
[0016]绿色小球萌发培养基:MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU0.2-0.5mg/L和生长素ΙΒΑ0.lmg/L ；
[0017]成苗和生根培养基:MS改良培养基附加生长素ΙΒΑ0.2-0.4mg/L ；
[0018]上述各种培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8 ;
[0019]3)方法
[0020]在超净工作台上取圆叶鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎，接种在步骤2 )所述绿色小球诱导培养基上，25d在短茎的表 面诱导产生出绿色小球；绿色小球转到步骤2)所述绿色小球增殖培养基上进行继代增殖培养，30d为一个周期；经过继代增殖培养的绿色小球转移到步骤2)所述绿色小球萌发培养基上，20d左右形成幼苗；在成苗和生根培养基上，幼苗发育成具有根、茎、叶的完整小植株；
[0021]绿色小球的诱导、增殖、萌发、成苗和生根培养均在光照条件下进行，光照强度为15001x，光照时间为12h/d ;培养室温度为26°C ±2°C。
[0022]有益效果本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果:
[0023]国内现有的鸟巢蕨组织培养技术是以嫩叶为外植体材料，6-苄基氨基嘌呤BAP诱导产生不定芽，不定芽诱导率达85%，芽丛的增殖率为6.4倍，但该项技术仅适用鸟巢蕨部分品种。国外鸟巢蕨组织培养技术是以根状茎为外植体材料，6-苄基氨基嘌呤BAP诱导产生绿色小球，绿色小球诱导率为50%。
[0024]本发明选用苯基脲类细胞分裂素CPPU从鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎诱导产生绿色小球，绿色小球诱导率高达100%，绿色小球每代增殖系数为5，绿色小球的成株率达95%以上，达到实用化程度，为开展鸟巢蕨试管苗工厂化生产提供新技术。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1短茎诱导产生绿色小球。
[0026]图2绿色小球增殖。
[0027]图3绿色小球萌发。
[0028]图4完整再生植株。
【具体实施方式】
[0029]1.材料和方法
[0030]1.1试验材料
[0031]圆叶鸟巢蕨(Asplenium nidus)属铁角蕨科(Aspleniaceae)蕨类植物,种苗购自南京万博花卉市场。本实验室采集盆栽植株叶片上的成熟孢子，应用组织培养方法(秦廷豪，邹宗兰.鸟巢蕨的组织培养[J].植物生理学通讯，2004，40 (3):349)获得无菌苗。[0032]1.2培养基
[0033]MS改良培养基由MS大量元素、MS微量元素(MurashigeT，SkoogF.A revisedmedium from rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures[J].Physiol plant, 1962, 15:473 -497)和 B5 维生素(Gamborg O L,Miller R A, OjimaK.Nutrient requirements of suspension cultures of soybeanroot cells[J].Exp.CellRes.，1968.50:151-158)组成，为植物组织培养中一种常用的培养基，蔗糖30g/L，活性炭质量比0.1% (南京助研生物技术有限公司)，琼脂条(乘风牌，福建泉州市泉港化工厂)Sg/L ；
[0034]绿色小球诱导培养基:MS改良培养基附加1.5-2.5mg/L的苯基脲类细胞分裂素(简称CPPU，南京生兴生物技术有限公司)和0.lmg/L生长素吲哚丁酸(简称IBA，上海源聚生物科技有限公司)；
[0035]绿色小球增殖培养基:MS改良培养基附加1.0-1.5mg/L的苯基脲类细胞分裂素(简称CPPU，南京生兴生物技术有限公司)和0.lmg/L生长素吲哚丁酸(简称IBA，上海源聚生物科技有限公司)；
[0036]绿色小球萌发培养基:MS改良培养基附加0.2-0.5mg/L的苯基脲类细胞分裂素(简称CPPU，南京生兴生物技术有限公司)和0.lmg/L生长素吲哚丁酸(简称IBA，上海源聚生物科技有限公司)；
[0037]成苗和生根培养基:MS改良培养基附加0.2-0.4mg/L生长素吲哚丁酸(简称IBA，上海源聚生物科技有限公司)；
[0038]培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整pH值至5.8。
[0039]1.3 方法
[0040]以I)圆叶鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎为外植体材料，在2)绿色小球诱导培养基上25d左右诱导产生绿色小球；绿色小球转移到2)绿色小球增殖培养基上，30d为一个周期，绿色小球继代增殖；绿色小球转移到2)绿色小球萌发培养基上，20d左右形成幼苗；幼苗转到成苗和生根培养基上，25d左右形成具有根、茎、叶的完整再生植株；
[0041]离体培养条件:培养室温度为26±20C，光照强度为15001x，光照时间为16h/d。
[0042]2.结果
[0043]2.1CPPU对短茎诱导绿色小球的影响
[0044]圆叶鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎(带叶或不带叶)，短茎的长度约为0.3-0.5cm，分别接种在附加 CPPU1.5 -2.5mg/L、ΙΒΑ0.lmg/L 和 BAP1.5 -2.5mg/L、ΙΒΑ0.lmg/L 的诱导培养基上。在附加CPPU1.5-2.5mg/L、IBA0.lmg/L的诱导培养基上，25d左右在短茎的表面显现肉眼可见的绿色小球(图1);在附加BAP1.5-2.5mg/L、IBA0.lmg/L的诱导培养基上，25d左右短茎膨大，在继续培养过程中始终未见绿色小球形成。
[0045]表ICPPU对短茎诱导绿色小球的影响
细胞分裂素接种短茎数产生绿色小球的短茎数绿色小球诱导率
[0046]
【权利要求】
1.鸟巢蕨诱导绿色小球高频率植株再生方法，其特征在于: 1)材料 选用鸟巢蕨无菌苗为材料； 2)培养基 MS改良培养基由MS大量元素、MS微量元素与B5维生素组成,添加鹿糖30 g/L,活性炭质量比0.1%，8 g/L的琼脂条作为固化剂； 绿色小球诱导培养基:MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 1.5-2.5 mg/L和生长素IBA 0.1 mg/L ； 绿色小球增殖培养基:MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 1.0-1.5 mg/L和生长素IBA 0.1 mg/L ； 绿色小球萌发培养基:MS改良培养基附加苯基脲类细胞分裂素CPPU 0.2-0.5 mg/L和生长素IBA 0.1 mg/L ； 成苗和生根培养基:MS改良培养基附加生长素IBA 0.2-0.4 mg/L ； 上述各种培养基在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整PH值至5.8 ; 3)方法 在超净工作台上取鸟巢蕨无菌苗的顶生短茎，接种在步骤2)所述绿色小球诱导培养基上，25 d在短茎的表面诱导产生出绿色小球；绿色小球转到步骤2)所述绿色小球增殖培养基上进行继代增殖培养，30 d为一个周期；经过继代增殖培养的绿色小球转移到步骤2)所述绿色小球萌发培养基上，20 d形成幼苗；在成苗和生根培养基上，幼苗发育成具有根、茎、叶的完整小植株； 绿色小球的诱导、增殖、萌发、成苗和生根培养均在光照条件下进行，光照 强度为1500 lx，光照时间为12 h/d ;培养室温度为26°C ±2°C。
【文档编号】A01H4/00GK103444534SQ201310399781
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】叶晓青, 佘建明, 贾新平, 梁丽建, 孙晓波, 邓衍明 申请人:江苏省农业科学院