铁线莲贝蒂·里斯登的组织培养方法
【专利摘要】本发明是一种铁线莲栽培品种“贝蒂·里斯登”的组织培养方法，包括如下步骤：1）外植体消毒处理；外植体消毒处理，2）芽诱导和芽增殖，具体包括：①诱导培养，②不定芽增殖培养，③壮苗培养，④生根培养，⑤炼苗和移栽。本发明的优点是：应用组织培养方法，能较好地保持母本的观赏价值，有效地提高“贝蒂·里斯登”铁线莲的繁殖系数；与扦插繁殖相比，生长周期大幅缩短，组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的50~60倍；品种优质、产量可观和便于实地推广。
【专利说明】铁线莲贝蒂.里斯登的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种铁线莲“贝蒂.里斯登”的组织培养方法(一种铁线莲栽培品蜗Clermtis ‘Betty Risdon’的组织培养方法),属于植物组织培养【技术领域】。
【背景技术】
[0002]铁线莲属(Clematis L.)隶属于毛茛科(Ranunculaceae)毛茛亚科(Subfam.Ranunculoideae)银莲花族(Trib.Anemoneae)铁线莲亚族(Subtrib.Clematidinae),常为多年生木质藤本。世界约有355种，我国有147种，其中93种为我国特有种，特有率为63.3%。
[0003]其萼片花瓣状，色彩丰富，形态多变，茎蔓生，利用叶柄攀援，生长适应性强，园艺用途广泛，观赏价值高，在垂直绿化中具有重要地位，享有“攀援植物皇后”之美称。在日本和西方园林中，铁线莲已占有十分重要的地位，大部分植物园、公园和家庭花园都能见到它们绚丽多彩的身影。此外，该属植物中的许多种如女萎{Clematis、威灵仙(Cchinensis)等作为药用植物使用已久。
[0004]其种子较难发芽，多用扦插繁殖。采取组织培养法进行铁线莲“贝蒂.里斯登”(英文商品名为:Clematis ‘Betty Risdon’)的快速繁殖,建立丛生芽生根的无性繁殖体系，有利于增大繁殖系数，对于铁线莲“贝蒂.里斯登”走向园艺应用具有较强的生产应用价值。
【发明内容】
[0005]本发明提出的是一种 铁线莲栽培品种‘Betty Risdon’的组织培养方法，其目的是针对铁线莲“贝蒂.里斯登”现有繁殖技术较为陈旧的问题，提高其繁殖系数以适应其引种推广及园林应用的需求。
[0006]本发明的技术解决方案:一种铁线莲栽培品种CVeffiaii1S ‘Betty Risdon’的组织培养方法，包括如下步骤:
1)外植体消毒处理；
2)芽诱导和芽增殖。
[0007]所述的步骤I)外植体消毒处理，具体包括:
取铁线莲“贝蒂.里斯登”当年生的幼嫩茎节和顶芽，依次进行自来水冲洗lh，毛笔来回刷洗20次，于超净工作台上用质量浓度75%乙醇灭菌20 S，无菌水冲洗2次，之后用质量浓度0.1%氯化萊灭菌7 min,立即用无菌水冲洗4次；用灭菌滤纸吸干外植体表面水分,切除叶柄和两端受伤部位，实验统计的污染率分别为62%、49%，褐化率为24%、31% ；
所述的步骤2)芽诱导和芽增殖，具体包括:
①诱导培养，
冲洗后将外植体置于培养皿中，用剪刀、镊子切除叶柄、两端受伤部位后，将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L上5周，质量浓度为3 %的蔗糖2(T30 g/L，质量浓度为0.7 %的琼脂7 g/L, pH 5.7，培养温度25°C ;光照条件:光照/黑暗，其中光照16 h/d，光照度为2400 Ix ；
②不定芽增殖培养，
将诱导培养基中诱导出的丛生芽分成单芽，接入1/2 MS+生长调节物质6-BA 0.2 mg/L+生长调节物质KT 0.5 mg/L+生长调节物质NAA 0.05 mg/L增殖培养基中培养4周，光照条件同①诱导培养；
③壮苗培养，
将增殖培养基中叶色浓绿、长度为2 cm左右的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养25天，光照条件同①诱导培养；
④生根培养
将壮苗培养后长势旺盛的芽切去茎基部褐色物质后接入生根培养基1/2 MS+生长调节物质IBA 0.3 mg/L，培养6周后生根，光照条件同①诱导培养；
⑤炼苗和移栽，
将生根植株的培养瓶瓶盖打开，室温下炼苗6d后，取出试管苗，洗净，移栽到由珍珠岩、蛭石、泥炭组成的苗床上，所述的珍珠岩、蛭石、泥炭的重量比为1:1:1，保持温度20^250C，湿度85%~95%，适当遮荫，成活率达90%。
[0008]本发明的优点:应用组织培养方法，能较好地保持母本的观赏价值，有效地提高铁线莲“贝蒂.里斯登”的繁殖系数。与扦插繁殖相比，生长周期大幅缩短，组织培养法的繁殖系数为扦插繁殖的50-60倍 。品种优质、产量可观和便于实地推广。
【具体实施方式】实施例
[0009]铁线莲“贝蒂.里斯登”组织培养方法，其培养步骤如下:
步骤I)外植体消毒处理
选取当年生幼嫩茎节和顶芽，依次冲洗1.5 h，于超净工作台上用质量浓度为75%乙醇灭菌20 S，用无菌水冲洗2次，之后用0.1%升汞灭菌7 min,立即用无菌水冲洗3_4次。
[0010]步骤2)芽诱导和芽增殖 ①诱导培养
冲洗后将外植体置于培养皿中，用剪刀、镊子切除叶柄、两端受伤部位后，将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L上5周，质量浓度为3 %的蔗糖2(T30 g/L,质量浓度为0.7 %的琼脂7g/L，pH 5.7，培养温度25°C ;光照条件:光照/黑暗，其中光照16 h/d，光照度为24001x。
[0011]②不定芽增殖培养
将诱导培养基中诱导出的丛生芽分成单芽，接入1/2 MS+生长调节物质6-BA 0.2 mg/L+生长调节物质KT 0.5mg/L+生长调节物质NAA 0.05mg/L增殖培养基中培养4周光照条件同①诱导培养。
[0012]③壮苗培养
将增殖培养基中叶色浓绿、长度为2 cm左右的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养25天，光照条件同①诱导培养。
[0013]④生根培养
将壮苗培养后长势旺盛的芽切去茎基部褐色物质后接入生根培养基1/2 MS+生长调节物质IBA 0.3mg/L,培养6周后生根,光照条件同①诱导培养。
[0014]⑤炼苗和移栽
将生根植株的培养瓶瓶盖打开，室温下炼苗6 d后，取出试管苗，洗净，移栽到准备好的珍珠岩、蛭石、泥炭珍间的重量比1:1:1苗床上，保持温度2(T25°C，湿度85%~95%，适当遮荫，成活率达90%。
[0015]所述的MS基本培养基是由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分所组成。
[0016]所述的大量元素为:硝酸钾KNO3,1900 mg.?Λ硝酸铵NH4NO3,1650 mg-1,磷酸二氢钾 KH2PO4,170 mg.1，硫酸镁 MgSO4.7 H2O, 370 mg.1，氯化钙 CaCl2.4 H20,440mg.L 1 ο
[0017]所述的微量元素为:碘化钾KI, 0.83 mg.L-1,硼酸H3BO3 , 6.2 mg.!/1,或硫酸猛MnS04.4 H2O, 22.3 mg.1 或硫酸锌 ZnSO4.7 H20,8.6 mg.1 或钥酸钠 Na2MoO4.2 H2O,
0.25 mg.L' 硫酸铜 CuSO4.5 H2O, 0.025 mg.L' 氯化钴 CoCl2.6 H2O, 0.025 mg.L'
[0018]所述的铁盐为:乙二胺二乙酸二钠Na2.EDTA，37.3 mg.L—1，硫酸亚铁FeSO4.7H2O, 27.8 mg.L 1O
[0019]所述的有机成分为:肌醇C6H12O6.2H20,100 mg.L-1，甘氨酸 NH2CH2COOH, 2mg.L—1，盐酸硫胺素 C12H17C1qS.2Η(:1，0.1 mg.L—1，盐酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl ,0.5 mg.L—1，烟酸 NC5H4COOH, 0.5 mg.L'
[0020]所述的1/2 MS基本培养基的成分为:大量元素是MS的一半，其余成分微量元素、铁盐，有机成分与MS的有机成分相同。
[0021]所述的生长调节物质NAA为萘乙酸，6-BA为6_苄基腺嘌呤，TDZ为噻二唑苯基脲，KT为激动素，IBA为吲哚-3- 丁酸。
【权利要求】
1.一种铁线莲栽培品种‘Betty Risdon’的组织培养方法,其特征是包括如下步骤:. 1)外植体消毒处理； .2)芽诱导和芽增殖。
2.根据权利要求1所述的一种铁线莲栽培品种‘BettyRisdon’的组织培养方法，其特征是所述的步骤I)外植体消毒处理，具体包括: 取铁线莲“贝蒂.里斯登”当年生的幼嫩茎节和顶芽，依次进行自来水冲洗lh，毛笔来回刷洗20次，于超净工作台上用质量浓度75%乙醇灭菌20 S，无菌水冲洗2次，之后用质量浓度0.1%氯化萊灭菌7 min,立即用无菌水冲洗4次；用灭菌滤纸吸干外植体表面水分,切除叶柄和两端受伤部位，实验统计的污染率分别为62%、49%，褐化率为24%、31%。
3.根据权利要求1所述的一种铁线莲栽培品种‘BettyRisdon’的组织培养方法，其特征是所述的步骤2)芽诱导和芽增殖，具体包括: ①诱导培养， 冲洗后将外植体置于培养皿中，用剪刀、镊子切除叶柄、两端受伤部位后，将芽接种于已灭菌的诱导培养基1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+TDZ 1.0 mg/L上5周，质量浓度为3 %的蔗糖2(T30 g/L， 质量浓度为0. 7 %的琼脂7 g/L, pH 5.7，培养温度25°C ;光照条件:光照/黑暗，其中光照16 h/d，光照度为2400 Ix ； ②不定芽增殖培养， 将诱导培养基中诱导出的丛生芽分成单芽，接入1/2 MS+生长调节物质6-BA 0.2 mg/L+生长调节物质KT 0.5 mg/L+生长调节物质NAA 0.05 mg/L增殖培养基中培养4周，光照条件同①诱导培养； ③壮苗培养， 将增殖培养基中叶色浓绿、长度为2 cm左右的不定芽逐个切下，接入MS基本培养基中培养25天，光照条件同①诱导培养； ④生根培养 将壮苗培养后长势旺盛的芽切去茎基部褐色物质后接入生根培养基1/2 MS+生长调节物质IBA 0.3 mg/L，培养6周后生根，光照条件同①诱导培养； ⑤炼苗和移栽， 将生根植株的培养瓶瓶盖打开，室温下炼苗6d后，取出试管苗，洗净，移栽到由珍珠岩、蛭石、泥炭组成的苗床上，所述的珍珠岩、蛭石和泥炭间的重量比为1:1:1，保持温度20^250C，湿度85%~95%，适当遮荫，成活率达90%。
4.根据权利要求3所述的一种铁线莲栽培品种Clematis‘Betty Risdon’的组织培养方法，其特征是所述的MS基本培养基是由大量元素、微量元素、铁盐和有机成分所组成。
5.根据权利要求4所 述的一种铁线莲栽培品种Clematis‘Betty Risdon’的组织培养方法，其特征是所述的大量元素为:硝酸钾KNO3,1900 mg - 1,硝酸铵NH4NO3,1650 mg - 1,磷酸二氢钾 KH2PO4,170 mg.L—1，硫酸镁 MgSO4.7 H2O, 370 mg.L' 氯化钙 CaCl2.4 H2O,440 mg.I71 ； 所述的微量元素为:碘化钾KI，0.83 mg. 1,硼酸H3BO3，6.2 mg.L—1，或硫酸锰MnS04.4 H2O, 22.3 mg. 1 或硫酸锌 ZnSO4.7 H20,8.6 mg. 1 或钥酸钠 Na2MoO4.2 H2O,.0.25 mg.L' 硫酸铜 CuSO4.5 H2O, 0.025 mg.L' 氯化钴 CoCl2.6 H2O, 0.025 mg.L-1 ； 所述的铁盐为:乙二胺二乙酸二钠Na2.EDTA, 37.3 mg.L—1，硫酸亚铁FeSO4.7 H2O,.27.8 mg.L 1 ; 所述的有机成分为:肌醇 C6H12O6.2H20,100 mg.L-1，甘氨酸 NH2CH2COOH, 2 mg.L-1，盐酸硫胺素 C12H17C10S.2HC1，0.1 mg.L-1，盐酸吡哆醇 C8H11O3N.HCl ,0.5 mg.L-1，烟酸NC5H4COOH, 0.5 mg.L'
6.根据权利要求3所述的铁线莲栽培品种“贝蒂.里斯登”的组织培养方法，其特征是所述的1/2 MS基本培养基的成分为:大量元素是MS的一半，其余成分微量元素、铁盐，有机成分与MS的有机成分相同。
7. 根据权利要求3所述的铁线莲栽培品种“贝蒂.里斯登”的组织培养方法，其特征是所述的生长调节物质NAA为萘乙酸，6-BA为6-苄基腺嘌呤，TDZ为噻二唑苯基脲，KT为激动素，IBA为吲哚-3-丁酸。
【文档编号】A01H4/00GK103461131SQ201310428130
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】方炎明, 程莹, 严靖, 王磊 申请人:南京林业大学