铁皮石斛兰的组织培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种铁皮石斛兰的组织培养方法，所述方法包括以下具体步骤：1)、取铁皮石斛兰的部分组织为组培苗进行组织培养；2)、以MS为基本培养基，每升添加琼脂7g、蔗糖30g、椰汁100ml，添加激素后调整pH至6.2，所述激素为6-BA0-2mg/L和/或NAA0-2mg/L，且6-BA和NAA的添加量不同时为0；3)、将石斛兰组培苗的丛生植株分离开来，分别转接到步骤2中所制备的培养基中进行组织培养。所述方法能提高铁皮石斛兰组培苗的生根能力，促进组培苗根的生长，以及增加根的数量，从而进一步提高组培苗的存活和繁殖能力。
【专利说明】铁皮石斛兰的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物的组织培养方法，具体涉及一种铁皮石斛兰的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]石斛兰(Dendoobium)，又名杜兰、石斛、石兰等，属兰科石斛兰属，石斛兰属是兰科植物中最大的一个属，原产地主要分布于亚洲热带和亚热带，澳大利亚和太平洋岛屿，全世界约有1000多种[1]。中国约有76种其中大部分分布于西南、华南、台湾等地。为多年生草本植物,植株由肉茎构成,粗如中指,棒状丛生,叶如竹叶,对生于茎节两旁。花葶从叶腋抽出，每葶有花七八朵，多的达20多朵，呈总状花序，每花6瓣，四面散开，中间的唇瓣略圆。许多品种的瓣边均为紫色，瓣心为白色，也有少数品种为黄色、橙色。石斛兰是极其珍贵的中药材千年以来它一直和灵芝，人参，冬虫夏草等一样被列为上品中药。其性味:甘淡微咸。性属清润，清中有补，补中有清。对人体有驱解虚热，益精强阴等疗效。而且其花色鲜艳，花形端正，花期长，深受人们喜爱，随着花卉产业的兴起，人们发现它有很高的观赏价值，因而归入洋兰的范畴，逐渐从草药圃跨进到大花园中去，成为当今非常时兴的新花，与卡特兰、蝴蝶兰、万带兰并列为观赏价值最高的四大观赏兰类。被广泛用于插花、盆栽观赏、胸花等，并有“父亲节之花”的美誉，同时也是国际兰花市场上最重要的鲜切花之一。
[0003]我国野生石解兰资源丰富，但由于较长时期缺乏保护，野生资源数量明显下降。针对这一状况应加快对我国野生石解兰种质资源的评价与开发，从而降低人们为图暴利采挖的盲目性[2]。目前，石解兰的分类比较困难，甚至某些种类只有开花时才可定种，为此需要建立种质资源库，收集和整理我国野生石解资源，为资源的有效保存、科普教育和科学研究打下基础。同时，要以工厂化、规模化生产为目标，着力解决有开发前景的野生石解兰的快繁体系研究，并且可以结合试管苗和人工种子野生放养达到可持续发展的目的。我国石解兰产业发展较晚，从20世纪90年代才开始规模化生产，虽然发展速度很快，但是仍存在诸多问题:如生产类型单一，主要以盆花为主，微型花卉和切花都极少生产，且盆花品种匾乏，已不能满足市场多元化的需求；又如育种工作滞后，生产和销售的观赏石解兰基本上都是驯养的野生石解兰和进口品种[3]。为了能够让我国的观赏石解兰产业迅速发展，首先应当加强对野生石解兰资源的保护、开发与利用，加强和深化对观赏石解兰的育种研究，提高育种水平，培育出观赏价值高、具有自主知识产权的新优品种，进而促进生产和科研有机结合，使生产企业能够积极栽培我国自我培育的有市场前景的新优品种。
[0004]培养基是药用石斛属植物组织培养的核心技术，它提供了药用石斛离体培养条件下保持良好生长的必要营养。培养基的主要成分有无机营养元素、碳源、有机附加物和植物生长调节剂。目前，常用的药用石斛培养基有MS、B5、N6、KC、马铃薯培养基等。其中，MS是应用最为广泛的基本培养基。张治国等研究了 6种不同基本培养基对铁皮石斛原球茎继代增殖的影响，结果表明:1/2MS培养基适宜原球茎分化；VW培养基上分化的原球茎平均鲜重最高[4]。王国梅等以野生金钗石斛茎段诱导长出的原球茎为材料，比较了 MS、1/2MS、B5、Miller4种不同基本培养基诱导金钗石斛原球茎生长增殖的情况，发现B5培养基中原球茎的净增殖倍数明显高于其他三种培养基[5]。曾宋君等发现硝态氨远高于胺态氨的N6培养基对石斛胚的萌发和生长最好，而以石斛茎尖作为培养材料，N6培养基诱导愈伤组织能力明显不如MS[6]。Devi等利用Dendronbium moschatum的莖尖在5种培养基上诱导形成拟原球茎，结果表明Nitch培养基的诱导效果最好。朱艳等以铁皮石斛茎段诱导丛生芽作为目的，筛选出1/2MS诱导丛生芽的效果好，生成的苗粗壮。王亦非等考察了 MS、N6、B5、KC4种基本培养基及大量元素减半的上述4种培养基对诱导细胞团形成的作用，发现:4种培养基使用全量大量元素的比大量元素减半的诱导效果要好，其中MS培养基是表现最好的，诱导效果可达38.5% [7]0胡如善等则认为MS、KC、N6三种基本培养基在石斛茎段促侧芽萌发方面基本没有差异，而在石斛试管丛生芽继代增殖时，培养基以MS最好，试管丛生芽继代增殖系数最大，其次为N6，KCU/2MS诱导效果最差。韦晓新等研究了 MS、1/2MS、B5、N6和White培养基对铁皮石斛原球茎的生长和多糖积累的影响，发现:1/2MS和N6培养基适合原球茎生长和多糖积累，White培养基中原球茎的干重最高，而在MS中培养的原球茎干重和多糖含量均处于较低的水平，并有部分原球茎发生了褐变现象，认为MS培养基并不利于铁皮石斛生产多糖成分。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于解决上述现有技术的不足，提供一种铁皮石斛兰的组织培养方法，该方法能提高铁皮石斛兰组培苗的生根能力，促进组培苗根的生长，以及增加根的数量，从而进一步提高组培苗的存活和繁殖能力。
[0006]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
[0007]—种铁皮石斛兰的组织培养方法，包括以下具体步骤:
[0008]1、取铁皮石斛兰的部分组织为组培苗进行组织培养；
`[0009]2、以MS为基本培养基，每升添加琼脂7g、蔗糖30g、椰汁100ml，添加激素后调整pH至6.2，所述激素为6-BA0-2mg/L和/或NAA0_2mg/L，且6-BA和NAA的添加量不同时为0 ；
[0010]3、将石斛兰组培苗的丛生植株分离开来，分别转接到步骤2中所制备的培养基中进行组织培养。
[0011]较佳的，步骤I中所述组培苗为经组织培养获得的不定芽再生苗。
[0012]较佳的，步骤2中所述激素为6-BAlmg/L和NAAlmg/L。
[0013]较佳的，步骤3中每瓶培养基中接入3-5株所述丛生植株。
[0014]较佳的，步骤3中组织培养的条件是:25°C恒温培养，每日光照培养16h，光照强度20001x，暗培养 8h。
[0015]本发明的优点是:解决铁皮石斛兰组织培养上现有技术的不足，提供一种组织培养方法，提高铁皮石斛兰组培苗的生根能力，促进组培苗根的生长，并增加根的数量，从而促进组培苗的存活和繁殖能力的进一步提高。
【专利附图】
【附图说明】:
[0016]图1是【具体实施方式】中不同培养基的生根状况:A至I为分别从培养基A至I中选取的样品。
【具体实施方式】:
[0017]分别在相同的石斛兰基本培养基中添加不同的激素，通过比较它们的生根能力，得出6-BA1.0mg/L、NAA1.0mg/L的激素配比是最适合石斛兰生根的培养的体系,解决了石斛兰生根难的难题，提高了石斛兰组培苗在自然环境中的成活率。
[0018]实施例1:
[0019]1、材料与方法
[0020]选取经组织培养获得的不定芽再生苗为试验材料。
[0021]2主要试剂及仪器
[0022]6-BA、NAA,上海国药；SW_CJ-2D超净工作台，苏州净化；全自动高压灭菌锅SX-500,日本Tokyo ;高压灭菌器，德国Hermle公司。
[0023]3 方法
[0024]3.1培养基的配置
[0025]以MS为基本培养基，每升添加琼脂7g、蔗糖30g、椰汁100ml，添加激素后，调整pH至6.2，不同处理激素配比如表1所示。
[0026]表1石斛兰生根培养基不同激素配比
[0027]
【权利要求】
1.一种铁皮石斛兰的组织培养方法，包括以下具体步骤: 1)、取铁皮石斛兰的部分组织为组培苗进行组织培养； 2)、以MS为基本培养基，每升添加琼脂7g、蔗糖30g、椰汁100ml，添加激素后调整pH至6.2，所述激素为6-BA0-2mg/L和/或NAA0_2mg/L，且6-BA和NAA的添加量不同时为0 ; 3)、将石斛兰组培苗的丛生植株分离开来，分别转接到步骤2中所制备的培养基中进行组织培养。
2.如权利要求1所述的方法，其中，I)中所述组培苗为经组织培养获得的不定芽再生苗。
3.如权利要求1所述的方法,其中，2)中所述激素为6-BAlmg/L和NAAlmg/L。
4.如权利要求1所述的方法，其中，3)中每瓶培养基中接入3-5株所述丛生植株。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中，3)中组织培养的条件是:25°C恒温培养，每日光照培养16h,光照强度20001x,暗培养8h。
【文档编号】A01H4/00GK103583359SQ201310504180
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月24日 优先权日:2013年10月24日
【发明者】朱丽娜, 陈己任, 陈仕贵 申请人:湖南农业大学