表达抑制麦长管蚜羧酸酯酶的发卡rna的dna分子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种表达抑制麦长管蚜羧酸酯酶的发卡RNA的DNA分子及其应用。本发明所提供的DNA分子的结构为SEQ正向-X-SEQ反向，所述SEQ正向的序列为序列1的第1-345位；所述SEQ反向的序列与所述SEQ正向的序列反向互补；所述X是所述SEQ正向与所述SEQ反向之间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。实验证明，将所述DNA分子转化小麦幼胚愈伤组织，获得转基因株系，进行蚜虫饲喂试验，麦长管蚜食用转基因叶片后，羧酸酯酶基因表达量和酶活性显著降低、繁殖率下降，且其对辛硫磷溶剂的耐受性降低20-30%。可见，本发明对于农业生产上害虫的防治具有重要意义。
【专利说明】表达抑制麦长管蚜羧酸酯酶的发卡RNA的DNA分子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种表达抑制麦长管蚜羧酸酯酶的发卡RNA的DNA分子及其应用。
【背景技术】
[0002]蚜虫是小麦生产中的主要害虫，主要有麦无网长管蚜(Metopolophiumdirhodum),麦二叉姆(Schizaphis graminum),禾谷纟益管姆(Rhopalosiphum padi )和麦长管虫牙(Sitobion avenae),分布极广,几乎遍及世界各产麦国。姆虫以成虫、若虫吸取小麦汁液危害小麦，排到叶片上的蜜露降低光合作用，并传播多种病毒病，包括大麦黄矮病毒，导致小麦产量降低和品质下降。
[0003]目前，防治小麦蚜虫或者其他害虫主要还是依靠化学杀虫剂，虽然在一定程度上能够减少虫害所带来的产量下降，但是长期的使用化学杀虫剂不但费用较高而且容易使蚜虫产生相应的抗性，同时导致蚜虫天敌杀伤严重，环境污染加剧。
[0004]近年来，随着蚜虫抗药性的增强，化学杀虫剂的使用浓度和药用量也呈现增长的趋势。
[0005]植物介导的dsRNA确可以长效的抑制目标基因的表达，达到生产上控制害虫的目的，这种利用植物表达与昆虫特定基因匹配的双链RNA分子，当昆虫取食这类植物后，其靶基因的表达被明显降低，这种技术不仅为昆虫的功能基因组研究提供了便捷的方法，也为农业害虫的防治提供了特异性更强且环境安全的新思路、新技术。
【发明内容】
`[0006]本发明的目的是提供一种表达抑制麦长管蚜羧酸酯酶的发卡RNA的DNA分子及其应用。
[0007]本发明所提供的DNA分子具体为如式(I)所示的DNA片段:
[0008]SEQ正向-X-SEQ反向(I)
[0009]所述序列为序列表中序列I的第1-345位；
[0010]所述SEQ_的序列与所述序列反向互补(序列I的第1513-1857位)；
[0011]所述X是所述SEQ1^1与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ正向及所述SEQ反向均不互补。
[0012]在本发明中，式(I)中所述X为FAD2内含子序列,具体如序列表中序列2所示。
[0013]更加具体的，式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列如序列表中序列I所示。
[0014]含有所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0015]所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0016]在本发明中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为rbcS启动子。
[0017]进一步,所述rbcS启动子的序列如序列表中序列3所示。
[0018]在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为在pBAC-rbcs-sNTL载体的酶切位点插入序列I所示DNA片段后得到的重组质粒；所述酶切位点具体为Kpn I和BamH
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[0019]由以上式(I)所示DNA片段编码得到的RNA分子也属于本发明的保护范围。
[0020]以上式(I)所示DNA片段，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌，或所述RNA分子在如下al)_a6)任一中的应用也属于本发明的保护范围:
[0021 ] al)抑制麦长管蚜羧酸酯酶表达；
[0022]a2)降低麦长管蚜羧酸酯酶活性；
[0023]a3)降低麦长管蚜的耐药性；
[0024]a4)降低麦长管蚜的 繁殖率；
[0025]a5)防治麦长管蚜；
[0026]a6)培育抗麦长管蚜的转基因植物。
[0027]本发明的另一个目的是提供一种培育抗麦长管蚜的转基因植物的方法。
[0028]本发明所提供的培育抗麦长管蚜的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤:将以上式(I)所示DNA片段导入目的植物中，得到抗麦长管蚜的转基因植物；
[0029]所述抗麦长管蚜具体体现在如下bl) _b4)中的至少一种:
[0030]bl)抑制麦长管蚜的羧酸酯酶表达；
[0031]b2)降低麦长管蚜的羧酸酯酶活性；
[0032]b3)降低麦长管蚜的耐药性；
[0033]b4)降低麦长管蚜的繁殖率。
[0034]进一步，在本发明的一个实施例中，al)和bI)中所述抑制麦长管蚜的羧酸酯酶表达具体为使麦长管蚜的羧酸酯酶编码基因在RNA水平的表达量降低。
[0035]在本发明中，a3)和b3)中所述耐药性中的“药”具体为辛硫磷溶剂。所述辛硫磷溶剂的化学名称为0，0- 二乙基-0-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯，分子式为C12H15N2O3PS,分子量为 298.18。
[0036]在以上所述的应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物；在本发明中，所述植物为单子叶植物小麦，具体为小麦品种辽春10号。在本发明的一个实施例中，所述麦长管蚜具体为一龄麦长管蚜。
[0037]本发明通过RT-PCR方法克隆了麦长管蚜羧酸酯酶基因(SaCbE E4)片段，进一步构建了此基因片段的发夹RNAi构件。将该构件转化小麦幼胚愈伤组织，获得了转基因株系。蚜虫饲喂试验表明，麦长管蚜食用转基因叶片后，羧酸酯酶基因表达量和酶活性显著降低、繁殖率下降，且其对辛硫磷溶剂的耐受性降低20-30%。可见，本发明对于农业生产上害虫的防治具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为麦长管蚜总RNA的电泳检测结果。其中，泳道I和2为两个重复，均为麦长管蚜总RNA。[0039]图2为RT-PCR获得SaCbE E4基因片段(约0.35kb)。其中，泳道M为DAN分子量标准2000bp DNA Ladder ;泳道I为利用第一对引物(Pl_sR和Pl_sF)PCR扩增所得添加了BamH I和Hind III酶切位点的SaCbE E4基因片段，命名为CbE E4-1。泳道2为利用第二对引物(Pl-asR和Pl_asF)PCR扩增所得添加了 Kpn I和Sac I酶切位点的SaCbE E4基因片段，命名为CbE E4-2。
[0040]图3为pHurricane载体的质粒图谱。
[0041]图4为重组质粒pBSK-FAD2Il-CbE E4的酶切鉴定结果。其中，泳道Ml为DAN分子量标准IKb DNA Ladder ;泳道M2为DAN分子量标准2000bp DNA Ladder ;泳道I为pTE-CbEE4-1的Hind III和BamH I酶切结果；泳道2为pHurricane载体的Hind III和BamH I酶切结果；泳道3为重组质粒pBSK-FAD2Il-CbE E4的Hind III和BamHI酶切结果。
[0042]图5为重组质粒pBSK-CbE E4R的酶切鉴定结果。其中，泳道Ml为DAN分子量标准IKb DNA Ladder ;泳道 M2 为 DAN 分子量标准 2000bp DNA Ladder ;泳道 I 为 pTE-CbE E4-2的Kpn I和Sac I酶切结果；泳道2为pBSK_FAD2Il_CbE E4的Kpn I和Sac I酶切结果；泳道3为重组质粒pBSK-CbE E4R的Kpn I和Sac I酶切结果。
[0043]图6为pBAC-rbcs-sNTL载体的质粒图谱。
[0044]图7为重组质粒pBAC-rbcs-CbE E4的酶切鉴定结果。其中，泳道M为DAN分子量标准IKb DNA Ladder ;泳道I为pBAC-rbcs-sNTL的Kpn I和BamH I酶切结果；泳道2为pBSK-CbE E4R的Kpn I和BamH I酶切结果；泳道3为重组质粒pBAC-rbcs-CbE E4的KpnI和BamH I酶切结果。
[0045]图8为重组表达载体pBAC-rbcs-CbE E4的质粒图谱。其中，位于BamH I和KpnI之间的“CbE-1ntron-CbE”即为序列3所示的RNAi构件。
[0046]图9为SaCbE E4的RNAi转基因小麦的PCR鉴定。其中，A为T3代转基因植株用针对RNAi构件的引物对P4-F/P4-R进行PCR扩增的结果(箭头处为约0.35kb目的条带);B为T3代转基因植株用针对FAD2IntronI的引物对P6-R/P6-F进行PCR扩增的结果(箭头处为约Ikb目的条带)。A和B中，泳道M均为DNA分子量标准DL2000Marker ;泳道+均为阳性对照pBAC-rbcs-CbE E4质粒；泳道-均为阴性对照未转基因小麦；泳道1_9均为转基因植株，在两次扩增中均出现目的条带(即A和B中均出现目的条带)的为阳性植株。
[0047]图10为SaCbE E4的RNAi转基因小麦对麦长管蚜羧酸酯酶基因表达量干扰效果分析结果。其中，A为麦长管蚜取食转基因小麦叶片I天后的检测结果出为麦长管蚜取食转基因小麦叶片3天后的检测结果；C为麦长管蚜取食转基因小麦叶片5天后的检测结果。*表示差异显著(p〈0.05) ;**表示差异极显著(p〈0.01)。
[0048]图11为SaCbE E4的RNAi转基因小麦对麦长管蚜羧酸酯酶活性影响分析结果。*表不差异显著(P〈CL 05) ;**表不差异极显著(p〈0.01)。
[0049]图12为SaCbE E4的RNAi转基因小麦对麦长管蚜耐药性干扰效果分析结果。
[0050]图13为SaCbE E4的RNAi转基因小麦对麦长管蚜繁殖率的影响分析结果。**表不差异极显著(p〈0.0Do
【具体实施方式】
[0051 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0052]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053]麦长管姆(Sitobion avenae):从中国农业大学上庄实验站小麦试验田获得,按照“王春芝，3种小麦蚜虫的形态识别与防治技术，农技服务，2008，25 (3):50，58” 一文记载的方法，鉴定证实确为麦长管姆(Sitobion avenae)。其形态学特征如下:无翅孤雌姆体长
3.1_，宽1.4_，长卵形，草绿色至橙红色，有时头部带红色或褐色，腹部两侧有不明显的灰绿至灰黑色斑。触角黑色，第3节有8 —12个感觉圈排成一行。腹部第6— 8节及腹面具横网纹，无缘瘤。喙粗大，黑色，长度超过中足基节。腹管长圆筒形，黑色，长为体长的1/4，在端部有十几行网纹。有翅孤雌蚜体长3.0mm，椭圆形，绿色。喙不达中足基节。腹管长圆筒形，黑色，端部具15~16行横行网纹，尾片长圆锥状，有8~9根毛。若蚜体绿色，有时粉红色，复眼红色，一般体较短。
[0054]pHurricane载体:记载于“张付芸，陈伟霞,刘子渲,李保云,梁荣奇.小麦SS I1-A基因片段的克隆及其RNAi表达载体的构建.中国农学通报，2011，27 (7):50_54”一文中的“H质粒”。
[0055]pBAC35SIH3载体:记载于“隋晓燕，赵琰，王树彬等.无载体框架结构的大豆铁蛋白线性表达盒提高小麦籽粒铁含量的研究.农业生物技术学报，2012，20(7):766~773”一文中，用于基因枪遗传转化后抗性愈伤组织的筛选。
[0056]小麦(Triticum aestivum L.)品种辽春10号:由辽宁省农业科学院用杂交方法选育的强筋小麦新品种，1998年通过全国农作物品种审定委员会审定。参见“刘振元.强筋麦新品种辽春10号高产栽培技术.中国种业，2001年第6期”一文。公众可从商业途径获得，也可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。
[0057]实施例1、表达抑制麦长管蚜羧酸酯酶的发卡RNA的DNA分子的获得
[0058]一、麦长管蚜羧酸酯`酶基因SaCbE E4目的片段获得
[0059]设计如下2 对引物 Pl-sF/Pl-sR 和 Pl-asF/Pl-asR:
[0060]Pl-sF:5，-GGATCCAAGTATTGCGCAAGATGAGGGTC-3，(下划线处为 Bam H I 酶切位点，其后的序列为序列I的第1-23位)；
[0061]Pl-sR:5，-AAGCTT GCTACGTAAGAATAATTACCAC-3’(下划线处为 Hind III 酶切位点，其后的序列为序列I的第324-345位的反向互补序列)。
[0062]Pl-asF:5，_GGTACC AAGTAITGCGCAAGATGAGGGTC-3’(下划线处为 Kpn I 酶切位点，其后的序列为序列I的第1-23位)；
[0063]Pl-asR:5’ -GAGCTC GCTACGTAAGAATAATTACCAC-3’(下划线处为 Sac I 酶切位点，其后的序列为序列I的第324-345位的反向互补序列)。
[0064]2对引物的扩增片段长度均为345bp (不包括额外添加的酶切位点)。
[0065]取麦长管蚜成虫，按照美莱博RNA提取试剂盒提取总RNA(图1)。图中，28S、18S都很清晰，说明提取的总RNA可以用于RT-PCR。以该总RNA为模板、分别以第一对引物(Pl_sR和Pl-sF)和第二对引物(Pl-asR和Pl-asF)进行RT-PCR，均得到0.35Kb左右的麦长管蚜羧酸酯酶基因SaCbE E4目的片段(图2)，分别将目的片断从琼脂糖胶回收后连到pGEM-Teasy载体(promega公司)上,热激转化大肠杆菌DH5 a菌株,经蓝白斑筛选阳性克隆,提取质粒，并进行酶切鉴定及测序。
[0066]将经测序表明在pGEM-Teasy载体上连入大小约为0.35Kb的DNA片段I (命名为DNA片段CbE E4-1) “GGATCC+序列I的第1-345位+AAGCTT，，的重组质粒命名为pTE_CbEE4-1 ;将经测序表明在pGEM-Teasy载体上连入大小约为0.35Kb的DNA片段2 (命名为DNA片段CbE E4-2)“GGTACC+序列I的第1-345位+GAGCTC”的重纟目质粒命名为DTE-CbE E4-2。
[0067]二、重组表达载体pBAC-rbcs-CbE E4的构建及鉴定
[0068]1、目的片段反向插入FAD2Intronl的下游
[0069]用BamH I和Hind III同时酶切步骤一构建的pTE-CbE E4-1以及pHurricane载体(质粒图谱如图3所示)，电泳后分别回收前者约0.35Kb片段和后者的大片段，连接这两个片段，转化感受态大肠杆菌DH5 a菌株，涂板，挑斑，摇菌，提取重组质粒，将其命名为pBSK-FAD2Il-CbE E4。
[0070]用限制性内切酶BamH I和Hind III对pTE-CbE E4-1、pHurricane载体，以及重组质粒pBSK-FAD2Il-CbE E4分别进行双酶切。结果如图4所示，酶切pTE_CbE E4-1得到约
0.35Kb的目的片段(泳道I )，酶切pHurricane载体得到约4.0kb的片段(泳道2)，而酶切重组质粒pBSK-FAD2Il-CbE E4得到一条约4.0kb的片段和一条约0.35kb的片段(泳道3)，其中大片段同pHurricane载体大小相符，小片段同目的片段大小相符，证明从pTE_CbE E4-1切下的0.35kb的目的片段已经反向连接到pHurricane载体上。
[0071]进一步，对所述重组质粒pBSK-FAD2Il-CbE E4进行序列测定，结果表明，重组质粒pBSK-FAD2Il-CbE E4为在pHurricane载体上位于FAD2Intronl下游的酶切位点BamH I和Hind III之间反向插入序列I的第1-345位后得到的重组质粒。
[0072]2、目的片段正向插入FAD2Intronl的上游
[0073]用Kpn I 和 Sac I 同时酶切步骤一构建的 pTE-CbE E4-2 以及 pBSK_FAD2Il_CbEE4载体，电泳后分别回收前者约0.35Kb片段和后者的大片段，连接这两个片段，转化大肠杆菌DH5 a感受态，涂板，挑斑，摇菌，提取重组质粒，将其命名为pBSK-CbEE4-1R。
[0074]用限制性内切酶KpnI 和 Sac I 对pTE-CbE E4-2、pBSK_FAD2Il_CbE E4，以及重组质粒pBSK-CbE E4-1R分别进行双酶切。结果如图5所示，酶切pTE-CbE E4-2得到约0.35kb的目的片段(泳道I )，酶切pBSK-FAD2I1-CbE E4得到约4.35kb的片段(泳道2)，而酶切重组质粒pBSK-CbE E4-1R得到一条约4.35kb的片段和一条约0.35kb的片段(泳道3)，其中大片段同pBSK-FAD2Il-CbE E4大小相符，小片段同目的片段大小相符，证明从pTE_CbE E4-2上切下的0.35kb的目的片段已经连接到pBSK-FAD2Il-CbE E4上。
[0075]进一步，对所述重组质粒pBSK-CbE E4-1R进行序列测定，结果表明，重组质粒pBSK-CbE E4-1R 为在 pBSK-FAD2I1-CbE E4 载体上位于 FAD2Intronl 上游的酶切位点 KpnI和Sac I之间正向插入序列I的第1-345位后得到的重组质粒。
[0076]在重组质粒pBSK-CbE E4-1R中，位于酶切位点Kpn I和BamH I之间的序列即为RNAi构件。所述RNAi构件的序列为序列表中序列I所示。
[0077]3、将RNAi构件置于rbcS启动子下游
[0078]用限制性内切酶Kpn I和BamH I同时双酶切pBAC-rbcs-sNTL载体(质粒图谱如图6所示，构建过程见下文)和以上构建的重组质粒pBSK-CbE E4-1R，电泳后分别回收前者大小约为4kb的片段和后者大小约为1.88kb的片段，连接这两个片段，转化大肠杆菌感受态，涂板，挑斑，摇菌 ，提取重组质粒，将其命名为pBAC-rbcs-CbE E4。
[0079]用限制性内切酶Kpn I 和 BamH I 对 pBSK-CbE E4-1R、pBAC-rbcs_sNTL，以及重组质粒pBAC-rbcs-CbE E4分别进行双酶切。结果如图7所示，酶切pBAC-rbcs-sNTL可得到一条大小约为4kb的骨架片段(泳道I )，酶切pBSK-CbE E4R可得到一条大小约为1.88kb的目的片段(泳道2)，而酶切重组质粒pBAC-rbcs-CbE E4则得到一条约4kb的片段和一条约为1.88kb的片段(泳道3)，其中大片段同pBAC-rbcs-sNTL酶切后的骨架片段大小相符，小片段同目的片段大小相符，证明从pBSK-CbE E4R上切下的约1.Skb的目的片段已经连接到pBAC-rbcs-sNTL 的 Kpn I 和 BamH I 位点之间。
[0080]进一步,对所述重组质粒pBAC-rbcs-CbE E4进行序列测定，结果表明，重组质粒pBAC-rbcs-CbE E4为在pBAC-rbcs-sNTL载体的rbcS启动子下游的酶切位点Kpn I和BamHI之间插入序列表中序列I后得到的重组质粒。
[0081]重组表达载体pBAC-rbcs-CbE E4的质粒示意图如图8所示。在重组表达载体pBAC-rbcs-CbE E4中，启动所述序列I所示DNA片段转录的启动子为rbcS启动子,其核苷酸序列如序列表中序列3所示。序列I由1857个核苷酸组成。其中，第1-345位为SaCbE E4基因片段的正向序列；第378-1495位为FAD2内含子核苷酸序列(序列2);第1513-1857位为所述SaCbE E4基因片段的反向序列。正向序列和反向序列之间由一段内含子(intixm)序列隔开以维持载体的稳定性；该系统在植物细胞中转录产生带发夹结构(hairpin)的dsRNA，引发RNAi，从而可用于抑制目的基因的表达。
[0082]其中，pBAC-rbcs-sNTL载体的构建方法及后续的筛选鉴定过程参见文献uSambrook J,Fritsch E F，Maniatis T.Molecular cloning - A laboratory Mauual, 2nded., New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.”。具体方法如下:
[0083]I)将载体PBAC202 (参考文献“高泽发，陈旭清，杨凤萍，梁荣奇，张立全，张晓东.人工合成gna基因在小麦中的表达 及其抗蚜虫效果研究，农业生物技术学报，2006，14(4): 559-564”)用 BamH I 和 Kpn I 酶切，回收 3.8Kb 载体片段。
[0084]2)由上海捷瑞生物工程有限公司人工化学合成sNTL基因全长(5’端加上BamH I酶切位点，3’端加上Kpn I酶切位点)，经过DNA测序证明正确。sNTL基因⑶S全长为序列表中序列4。
[0085]3)BamH I和Kpn I双酶切上一步获得的sNTL基因片段和用BamH I和Kpn I酶切载体pBAC202得到的3.8kb载体片段连接后，选择sNTL方向和rbcs启动子方向一致的重组载体，命名为pBAC-rbcs-sNTL。重组载体pBAC-rbcs-sNTL的结构描述为:在载体pBAC202的酶切位点BamH I和Kpn I之间插入了序列表中序列4所示DNA片段后得到的重组载体。
[0086]实施例2、SaCbE E4的RNAi转基因小麦的获得及鉴定
[0087]一、SaCbE E4的RNAi转基因小麦的获得
[0088]选取开花后12-15天的小麦品种辽春10号的幼穗，将其种子消毒后剥取幼胚，盾片向上置于幼胚接种培养基(配方:MS基本培养基+2，4-D2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，pH5.8。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度)上，25土TC暗培养3-5天诱导出小麦愈伤组织。选择生长状态良好的愈伤组织块进行基因枪共转化(将pBAC-rbcs-CbE E4和pBAC35SIH3按照3:1摩尔比混合，其中pBAC35SIH3质粒带有除草剂Basta的抗性基因bar)，转化后的愈伤25土 TC暗培养2_3天后移至筛选培养基(配方:幼胚接种培养基+Basta2-25mg/L。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度)上进行除草剂抗性筛选；观察筛选1-2周之后，将生长状态良好的抗性愈伤组织转移到分化培养基(配方:MS基本培养基+玉米素lOmg/L+Basta0.5mg/L, pH5.8。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度)上使其分化，大约4-5周后可分化出幼苗，将其转移到生根壮苗培养基(配方:MS培养基+IAA10mg/L，PH5.8。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度)中进行生根壮苗；炼苗2-3天后移栽至土壤中可长成Ttl代转基因植株。
[0089]同时设置向小麦品种辽春10号中转入pBAC-rbcs-sNTL空载体的对照。
[0090]二、SaCbE E4的RNAi转基因小麦的鉴定
[0091]用针对RNAi构件的引物对P4-F/P4-R，以及针对FAD2Intronl的引物对P6-R/P6-F对步骤一获得具有Basta抗性的SaCbE E4的RNAi转基因小麦的Ttl-T4代植株进行PCR鉴定。以重组表达载体pBAC-rbcs-CbE E4作为阳性对照，未转基因的小麦品种辽春10号为阴性对照，同时设置向小麦中转入pBAC-rbcs-sNTL的空载体对照。实验重复3次。
[0092]针对RNAi构件的引物:
[0093]P4-F:5’ -AAGTAITGCGCAAGATGAGGGTC-3’(序列 I 的第 1-23 位)；
[0094]P4-R:5’-GCTACGTAAGAATAATTACCAC-3’ (序列 I 的第 324-345 位的反向互补序列)。
[0095]针对FAD2Intronl 的引物:
[0096]P6-F:5’ -GGTAACGATTCAAGAGAGTCTTC-3，(序列 2 的第 79-101 位)。
[0097]P6-R:5’-CCGCTCACGATAGATCTGCT-3’(序列 2 的第 1004-1023 位的反向互补序列)；
[0098]结果如图9所示，作为阳性对照的pBAC-rbcs-CbE E4质粒扩增出大小约为0.35kb和Ikb的两个目标带，而作为阴性对照 的未转基因植株和转入pBAC-rbcs-sNTL的空载体的植株均没有扩出目标片段；而SaCbE E4的RNAi转基因小麦可同时扩增出0.35kb和Ikb左右的两个目标片段的为阳性植株。从阳性植株中随机选取两株，分别命名为SadsCbEl-5和SadsCbE2-2。
[0099]实施例3、SaCbE E4的RNAi转基因小麦对麦长管蚜防治效果研究
[0100]麦长管蚜种群，室内饲养蚜虫三代，期间从未施用过任何杀虫剂。室内饲养温度为21±1°C，相对湿度为50-60%，光周期为L:D=16h:8h。蚜虫饲养在感蚜小麦品种京411上，两周更换一次新鲜的幼苗用于蚜虫。
[0101]一、SaCbE E4的RNAi转基因小麦对麦长管蚜羧酸酯酶基因表达量干扰效果分析
[0102]以处于一龄若虫时期的麦长管蚜为实验材料，分别饲喂在T3代处于两叶一心幼苗期的SaCbE E4的RNAi转基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2_2上I天、3天、5天(用纱网单株隔离)。利用qRT-PCR技术分析麦长管蚜体内羧酸酯酶基因的表达量。具体操作如下:
[0103]利用Primer5.0软件设计羧酸酯酶基因SaCbE E4的扩增引物对P2-F/P2-R (扩增片段大小为343bp)，设计内参基因P-actin的扩增引物对P3-F/P3-R (扩增片段大小为238bp)。
[0104]羧酸酯酶基因SaCbE E4的扩增引物:
[0105]P2-F:5，-TGGTTGGGAGTGTGGAAC-3，；
[0106]P2-R: 5，-AGCAAATCCTAATACGCCC-3，。
[0107]内参基因P -actin的扩增引物:
[0108]P3-F:5， -CCGAAAAGCTGTCATAATGAAGACC-3，；
[0109]P3-R: 5，-GGTGAAACCTTGTCTACTGTTACATCTTG-3，。
[0110]取分别饲喂在T3代处于两叶一心幼苗期的SaCbE E4的RNAi转基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2-2上I天、3天、5天的麦长管蚜，按照美莱博RNA提取试剂盒提取总RNA0取500ng的总RNA反转录为cDNA,稀释10°、IO1UO2UO3' 104、IO5倍，作为荧光定量PCR的模板，检测以上设计的两对引物的特异性。
[0111]扩增体系:引物(IOiimol ? OOJiiLJXTrans Start TM Green qPCRSuperMixlO U L、Passive Reference Dye0.4 U L、模板 cDNA2 U L, ddH20 补充至 20 U L。
[0112]PCR 循环程序:95°C 35s ；95°C 5s，60°C 35s，72°C 10s，35 个循环；每个样本 3 个重复。
[0113]最终结果的计算采用2_AAct法(Ct表示循环数)进行计算，使用EXcel2003软件进行统计学分析，具体参见 “Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relativegene expression data using real-time quantitative PCR and the2 AAct method.Methods25 (4):402~408.”一文,使用Excel2003软件进行统计学分析,计算每种处理的平均值与方差，并进行显著性差异的分析(t-test，n=3, P < 0.01或0.05)。
[0114]实验重复3次，结果取平均值。
[0115]同时设置以未转基因的小麦品种辽春10号(CK)和转入pBAC-rbcs-sNTL空载体的小麦植株饲喂麦长管蚜的对照。
[0116]结果如图10所示，从图中可以看出，麦长管蚜取食SadsCbEl-5叶片1-3天后，其体内羧酸酯酶基因表达量较对照(CK)降低，在第5天时达到极显著水平(p〈0.01);麦长管蚜取食转基因株系SadsCbE2-2叶片1_3天后，麦长管蚜羧酸酯酶基因表达量较对照(CK)显著降低(p〈0.05),在第5天时达到极显著水平(p〈0.01)。而对于用转入pBAC-rbcs-sNTL空载体的小麦植株饲喂麦长管蚜的对照组，其结果与未转基因对照(CK)基本一致，无统计学差异。以上结果表明，SaC·bE E4的RNAi转基因小麦可有效降低麦长管蚜体内羧酸酯酶的表达量。
[0117]二、SaCbE E4的RNAi转基因小麦对麦长管蚜羧酸酯酶活性影响分析
[0118]以处于一龄时期的麦长管蚜麦长管蚜为实验材料，分别饲喂在T3代SaCbE E4的RNAi转基因株系SadsCbE1-5和SadsCbE2-2上3天、5天(用纱网单株隔离)。用蒸馏水冲洗麦长管蚜，然后放在滤纸上吸干，放入玻璃匀浆器中，分别加入浓度为0.04mol/L的pH7.0的磷酸缓冲液(PBS)冰浴匀浆，匀浆液在4°C下，8000r/min离心IOmin (离心半径为Ilcm),取上清液作为羧酸酯酶酶源。按照van Asperene方法(参见“Van Asperen KA.studyof housefly esterases by means of a sensitive colorimetric method.Journal ofInsect Physiology, 1962,8(4):401~414” 一文)测定姆虫体内羧酸酯酶的活性,具体如下:将酶源用浓度0.04mol/L PH7.0PBS溶液适当稀释后取lml，加入浓度为3X10_4mol/L的底物a -乙酸萘酯(a -NA, Sigma公司生产，目录号R9461)的水溶液1.0ml和浓度为l(T4mol/L的毒扁豆碱(Sigma公司，目录号E8375_250mg)的水溶液0.01ml,混匀后于37°C恒温水浴中反应10min,然后加入0.5ml显色液,摇匀后静置15min,于590nm处比色测定，以PBS取代酶液作为对照。其中，显色液的配方如下:1%固蓝B盐溶液:5%SDS溶液=体积比2: 5，现用现配。其中，1%固蓝8盐(分子式(:141112(:12财02*2%12，分子量475.46，深绿色粉末，溶于水)溶液的配方如下:称取0.4g固蓝B盐加ddH2025ml，即得1%固蓝B盐溶液。5%SDS (十二烷基苯磺酸钠)溶液的配方如下:称取1.0gSDS加ddH2020mL，即得5%SDS溶液。[0119]以上方法测定羧酸酯酶的活性的原理:底物a -乙酸萘酯(a -NA)在羧酸酯酶的作用下发生水解生成a-萘酚，a-萘酚与固蓝B盐作用，生成深蓝色或深红色物质，在590nm处比色测定其吸光度。羧酸酯酶的活性越强，生成a _萘酚的量越大，进而生成的深蓝色或深红色物质越多，致使所测得的0D590值越大。在37°C和pH7.0条件下，反应前后每毫升酶液每分钟使吸光度上升(或下降)1.00，定义为I个酶活单位(U/mLXmin)。
[0120]实验重复3次，结果取平均值。
[0121]同时设置以未转基因的小麦品种辽春10号(CK)和转入pBAC-rbcs-sNTL空载体的小麦植株饲喂麦长管蚜的对照。
[0122]结果如图11所示，从图中可以看出，麦长管蚜取食SadsCbEl-5叶片3天或5天后，麦长管蚜体内羧酸酯酶的活性较对照(CK)均显著降低(p〈0.05);麦长管蚜取食转基因株系SadsCbE2-2叶片3天或5天后，麦长管蚜体内羧酸酯酶的活性较对照(CK)均极显著降低(p〈0.01)。而对于用转入pBAC-rbcs-sNTL空载体的小麦植株饲喂麦长管蚜的对照组，其结果与未转基因对照(CK)基本一致，无统计学差异。以上结果表明，SaCbE E4的RNAi转基因小麦可有效降低麦长管蚜体内羧酸酯酶的活性。
[0123]三、SaCbE E4的RNAi转基因小麦对麦长管蚜耐药性干扰效果分析
[0124]以处于一龄时期的麦长管蚜为实验材料，分别饲喂在T3代SaCbE E4的RNAi转基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2-2上5天(用纱网单株隔离)。
[0125]辛硫磷溶剂:0，0_ 二乙基-0-(苯乙腈酮肟)硫代磷酸酯，分子式:C12H15N203PS，分子量:298.18。
[0126]辛硫磷溶剂能够水解a_萘酚，羧酸酯酶能够酶解辛硫磷溶剂，因此，通过用分光光度计测定a-萘酚的浓度 来估算辛硫磷溶剂，进而估算羧酸酯酶的活性(参考文献:Devonshire AL.The properties of a carboxylesterase from the peachpotatoaphid, Myzus persicae(Sulz.), and its role in conferring insecticide resistance.Biochem.J., 1977, 167:675 ~683 ；Lan WS, Jian C, Jiang H, et al.Expression andcharacterization of carboxylesterase E4gene from peach-potato aphid(Myzuspersicae)for degradation of Carbaryl and Malathion) ?Biotechno logyLetters, 2005，27:1141-1146)。具体操作如下:
[0127]1、分别取食喂5天的麦长管蚜，用蒸馏水冲洗，然后放在滤纸上吸干，放入玻璃匀浆器中，分别加入0.04mol/L pH值7.0的磷酸缓冲液(PBS)冰浴匀浆，匀浆液于4°C，8000r/min离心IOmin,取上清液作为羧酸酯酶酶源。
[0128]2、将4mL酶液(对照为0.04mol/L pH=7.0的PBS缓冲液)和ImLlOO u M辛硫磷溶液加入到 15mL10mM KH2P04/K0H 缓冲液(pH=7.5)(配方:将 1.36g 无水 KH2PO4 溶于 1000mL蒸馏水中，用KOH颗粒调节pH值至7.5)中，反应体系20mL。37°C温育。每隔5min取一次样(2mL)。
[0129]3、中步骤2的2mL溶液中加入浓度为3X 10_4mol/L的底物a -乙酸萘酯(a -NA,Sigma公司生产，目录号R9461)的水溶液1.0ml和浓度为l(T4mol/L的毒扁豆碱(Sigma公司，目录号E8375-250mg)的水溶液0.01ml，混匀后于37°C恒温水浴中反应lOmin，再加入
0.5ml的DBLS，混合均匀后于590nm处比色测定OD值，从而估算羧酸酯酶活性。在37°C和PH7.0条件下，反应前后每毫升酶液每分钟使吸光度上升(或下降)100，定义为I个酶活单位(U/mLXmin)。其中 DBLS 由 45mg 固蓝 B 盐、4.5mL H2OU0.5mL5%SDS 配制而成。5%SDS(十二烷基苯磺酸钠)溶液的配方如下:称取1.0gSDS加ddH2020mL，即得5%SDS溶液。
[0130]实验重复3次，结果取平均值。
[0131]同时设置以未转基因的小麦品种辽春10号(CK)和转入pBAC-rbcs-sNTL空载体的小麦植株饲喂麦长管蚜的对照。
[0132]结果如图12所示，从图中可以看出，SaCbE E4的RNAi转基因株系上饲喂的麦长管蚜的羧酸酯酶活性降低，对辛硫磷溶剂的水解速度较对照(CK)变慢。而对于用转入pBAC-rbcs-sNTL空载体的小麦植株饲喂麦长管蚜的对照组，其结果与未转基因对照(CK)基本一致，无统计学差异。以上结果表明，SaCbE E4的RNAi转基因小麦可有效降低麦长管蚜的耐药性，使其对药物更加敏感。
[0133]四、SaCbE E4的RNAi转基因小麦对麦长管蚜繁殖率的影响
[0134]以处于一龄时期的麦长管蚜为实验材料，分别饲喂在T3代SaCbE E4的RNAi转基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2-2上15天(用纱网单株隔离)。饲喂在两种转基因株系上的麦长管蚜的初始数量均为10头。饲喂15天后，统计各转基因株系上麦长管蚜的数目。
[0135]实验重复3次，结果取平均值。
[0136]同时设置以未转基因的小麦品种辽春10号(CK)和转入pBAC-rbcs-sNTL空载体的小麦植株饲喂麦长管蚜的对照。
[0137]结果如图13所示，从图中可以看出，转基因株系SadsCbEl-5和SadsCbE2_2上的虫牙虫数目均较对照(CK)极显著 降低(p〈0.01)。而对于用转入pBAC-rbcs-sNTL空载体的小麦植株饲喂麦长管蚜的对照组，其结果与未转基因对照(CK)基本一致，无统计学差异。以上结果表明，SaCbE E4的RNAi转基因小麦可有效降低麦长管蚜的繁殖率。
【权利要求】
1.如式(I)所示的DNA片段: SEQ正向-X-SEQ反向(I) 所述SEQM的序列为序列I的第1-345位； 所述SEQ的序列与所述序列反向互补； 所述X是所述SEQ1^1与所述间的间隔序列，在序列上，所述X与所述SEQ1向及所述SEQfi^1均不互补。
2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述X的序列如序列表中序列2所示。
3.根据权利要求1或2所述的DNA片段，其特征在于:所述DNA片段的核苷酸序列为序列表中序列I所示。
4.含有权利要求1-3中任一所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体； 所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为rbcS启动子。
6.权利要求1-3中任一所述的DNA片段编码得到的RNA分子。
7.权利要求1-3中任一所述的DNA片段，或权利要求4或5所述的重组表达载体、表达盒或重组菌，或权利要求6所述的RNA分子在如下al) -a6)任一中的应用: al)抑制麦长管蚜羧酸酯酶表达； a2)降低麦长管蚜羧酸酯酶活性； a3)降低麦长管蚜的耐药性； a4)降低麦长管蚜的繁殖率； a5)防治麦长管蚜； a6)培育抗麦长管蚜的转基因植物。
8.一种培育抗麦长管蚜的转基因植物的方法，包括如下步骤:将权利要求1-3中任一所述的DNA片段导入目的植物中，得到抗麦长管蚜的转基因植物； 所述抗麦长管蚜具体体现在如下bl) -b4)中的至少一种: bl)抑制麦长管蚜的羧酸酯酶表达； b2)降低麦长管蚜的羧酸酯酶活性； b3)降低麦长管蚜的耐药性； b4)降低麦长管蚜的繁殖率。
9.根据权利要求7所述的应用，或权利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
10.根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于:所述单子叶植物具体为小麦。
【文档编号】A01N57/16GK103589728SQ201310552870
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】梁荣奇, 倪中福, 许兰杰, 段晓亮, 吕延华, 尤明山, 解超杰, 李保云, 彭惠茹, 姚颖垠, 杜金昆, 刘志勇, 胡兆荣, 孙其信 申请人:中国农业大学