一种短小芽孢杆菌gbsw19及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种短小芽孢杆菌(Bacillus?pumilus)GBSW19，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日期为2013年9月9日，保藏编号为CGMCC?No.8140。本发明的短小芽孢杆菌(Bacillus?pumilus)GBSW19可用于作物秸秆降解，同时兼具抑制水稻纹枯病菌、水稻白叶枯病菌等植物病原菌的功能，从而促进水稻的生长，具有很好的应用前景。
【专利说明】—种短小芽孢杆菌GBSW19及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物【技术领域】，尤其涉及一种短小芽孢杆菌GBSW19及其应用。
【背景技术】
[0002]作物秸杆是当今世界上仅次于煤炭，石油，天然气的第四大能源，也是唯一可再生的能源，是最具有利用潜力的生物质资源之一。在传统农业中，秸杆资源不经过任何处理而直接用于肥料、燃料和饲料，利用率较低，并且大量的秸杆由于缺乏合适利用方法而被农民就地焚烧，一方面是对资源的一种浪费，另一方面，给周边地区安全和环境带来了巨大威胁，如释放出大量一氧化碳、氮氧化物、光化学氧化剂和悬浮颗粒等对人体有害的物质。
[0003]目前，虽然秸杆利用的方法有很多，在不同地区的效果也不错，但由于技术和成本的原因，秸杆在工业及能源领域的应用尚存在一定程度的制约；此外，由于目前收集、运输秸杆成本高而收购价格低，农民缺少积极性，因而并未从根本上解决秸杆出路问题，农民们仍然在年复一年地就地焚烧大量秸杆。
[0004]就中国乃至全世界的秸杆利用情况来看，秸杆还田是目前适用范围最广，最容易推广的利用方法。秸杆还田可以将秸杆中的C、N、K、P及微量元素释放到大田，大量研究结果表明，秸杆还田能有效改善土壤物理性状，增加土壤养分含量，有利于土壤中有机质的积累，长期保持秸杆还田，可以有效解决目前中国耕地生产力和肥力下降问题，同时显著提高作物产量并减少甚至替代部分化肥的使用。然而，秸杆不经处理直接还田在自然条件下腐解速度慢，影响播种、出苗和苗期生长；而且秸杆覆盖后会给病虫害提供越冬场所，易使下茬作物发生各类病虫害。
[0005]短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),是一种耐热、好氧的G+杆状细菌,该菌能产生抗逆性强的芽孢，能显著抑制病原菌，是一种常见的植物根围促生细菌(PGPR)，也是目前生防细菌中研究和应用较多的一类细菌；同时，大量的报道证实，芽孢杆菌可以产生胞外纤维素酶、半纤维素酶等，可以有效降`解木质纤维素。因此，在秸杆降解过程中，利用可产生降解木质纤维素酶类的生防短小芽孢杆菌加速秸杆木质纤维素的降解，使养分最有效的释放；同时，作为生防菌的芽孢杆菌对大田作物本身不仅无害，还兼具对病原微生物的拮抗作用，从而降低病害发生风险。短小芽孢杆菌生长繁殖快、营养需求低、对人畜无害、能够抑制多种作物病害并产生脂肽化合物，且其批量生产工艺简单、成本较低、施用方便、储存期长、不会让农作物产生抗药性，这些优点使之成为一种理想的作物秸杆降解制剂。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提出一种能够有效降解作物秸杆、同时能拮抗作物病原菌的短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus)GBSW19。
[0007]为达此目的，本发明采用以下技术方案:
[0008]一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)GBSW19,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2013年9月9日，保藏编号为CGMCC N0.8140。[0009]该菌为革兰氏阳性菌，细杆状，好氧，能运动。菌落半透明，微黄色。生理生化特性:接触酶阳性，V-P反应呈阳性，不能水解淀粉、可以水解酪素，不产生吲哚。&16S rDNA测序结果与 Genbank 上(http://www.ncb1.nlm.nih gov/blast/Blast.cgi )已知序列进行比对，与 Bacillus pumilus XJSL4-9 相似度为 100%。
[0010]所述短小芽孢杆菌GBSW19能产生胞外木质纤维素降解酶和表面活性肽。
[0011]包含所述短小芽孢杆菌GBSW19和/或其代谢产物并以其为活性成分的微生物制剂也属于本发明的保护范围。
[0012]优选地，所述微生物制剂为液态。
[0013]本发明还提供了上述微生物制剂的制备方法，包括如下步骤:
[0014](I)将所述短小芽孢杆菌GBSW19接种于LB固体培养基，于28~37°C下培养14~24小时获得菌体；
[0015](2)将步骤(1)获得的菌体接入LB液体培养基中，于28~37°C下振荡培养12~24小时制成种子液；
[0016](3)按体积百分比为5%的接种量，将步骤(2)所得种子液接种于发酵培养基中，于28~37°C下发酵培养至少36~48小时，收集发酵液即得所述微生物制剂。
[0017]上述制备方法中，优选地，所述发酵培养基包括如下重量百分比的组分:小麦秸杆粉I~3%、优选2%，磷酸氢二钾0.1~0.5%、优选0.2%，硝酸钠0.3~0.8%、优选0.5%和葡萄糖0.5~1.5%、优选1%。
[0018]本发明还提供了所述短小芽孢杆菌GBSW19的应用，具体应用如下:
[0019]所述短小芽孢杆菌GBSW19在作物秸杆降解中的应用；优选地，所述作物秸杆为小麦稻杆。
[0020]所述短小芽孢杆菌GBSW19在防治水稻纹枯病中的应用。
[0021]所述短小芽孢杆菌GBSW19在防治水稻白叶枯病中的应用。
[0022]所述短小芽孢杆菌GBSW19在促进水稻生长中的应用。
[0023]本发明提供的短小芽孢杆菌GBSW19对小麦秸杆等作物秸杆有明显的降解效果，并且对水稻纹枯病菌、水稻白叶枯病菌等植物病原菌有明显的抑制效果。本发明短小芽孢杆菌GBSW19单独作用于秸杆时，秸杆失重率可达39.8%，纤维素降解率达31.5%，半纤维素降解率达37.7%，木质素降解率达52.9%。
[0024]保藏信息
[0025]保藏日期:2013年9月9日；
[0026]保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称:CGMCC)，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，100101 ；
[0027]保藏编号:CGMCCN0.8140。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为实施例1分离的部分菌株的BOX-PCR指纹图谱。
[0029]图2为基于16S rDNA序列构建的系统发育树。
[0030]图3为实施例2所述对31株生防芽孢杆菌的平板筛选的部分结果(A)和胞外内切纤维素酶活测定结果(B);其中，图A显示的平板筛选的部分结果包含了本发明的短小芽孢杆菌GBSW19。
[0031]图4为本发明的短小芽孢杆菌GBSW19单独降解时小麦秸杆粉的失重率曲线。
[0032]图5为本发明的短小芽孢杆菌GBSW19单独降解时小麦秸杆粉的纤维素降解率曲线。
[0033]图6为本发明的短小芽孢杆菌GBSW19单独降解时小麦秸杆粉的半纤维素降解率曲线。
[0034]图7为本发明的短小芽孢杆菌GBSW19单独降解时小麦秸杆粉的木质素降解率曲线。
[0035]图8为本发明的短小芽孢杆菌GBSW19产生的表面活性素(surfactin)的MALD1-TOF-MS 检测图。
[0036]图9显示分离的本发明短小芽孢杆菌GBSW19的抑菌活性；从左到右依次为对水稻白叶枯病菌(A)和水稻纹枯病菌(B)的抑菌活性效果图，其中CK代表空白对照组，GBSW19代表本发明短小芽孢杆菌GBSW19处理组。
【具体实施方式】
[0037]为更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，本发明的典型但非限制性的实施例如下。
[0038]实施例1具有生 防效应的芽孢杆菌的分离、筛选与鉴定
[0039]采用五点取样法，于西藏拉萨市、林芝地区、山南地区和日喀则地区，不同环境条件下共采集35个土样，以稀释涂平板法对菌株进行分离纯化，分离得到1388个菌株。然后，以水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)和油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)为指不菌，最后得到311株抑菌效果较好的菌株(抑菌圈直径> 5mm)。对这311个抑菌效果好的分离菌株进行基因组rep-PCR (repetitive extragenic palindromic PCR)指纹图谱筛选,共得到 150 个指纹图谱不一样菌株(指纹图谱见图1)。对经过指纹图谱筛选获得的150个菌株进行生理生化鉴定，将150个菌株分为7个类群，然后，从每个类群中选取代表性的菌株共31个株系进行脂肪酸气相色谱(fatty acid methyl ester, FAME)和16S rDNA分子鉴定(见图2),最后，综合表型鉴定和一系列分子鉴定的结果，将分离的、有生防潜力的31个芽孢杆菌菌株鉴定为:短小芽孢杆菌(B.pumilus) 11株,腊样芽孢杆菌(B.cereus) 7株,苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis) 3株,解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens) 3株,萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus) 3 株，B.axarquiensis2 株,枯草芽抱杆菌(B.subtilis) I 株,地衣芽抱杆菌(B.1icheniformis) I 株。
[0040]实施例2兼具生防和秸杆降解潜力菌株的筛选
[0041]以实施例1所鉴定的31株生防芽孢杆菌为基础，以平板透明圈法进行第一轮初筛，得到可以产生胞外木质纤维素降解酶的菌株27株，部分平板筛选结果见图3A。紧接着以不同性质的多糖底物测定这27株芽孢杆菌胞外酶活力的大小，胞外内切纤维素酶活测定结果见图3B。最后综合初筛和复筛结果，得到2株兼具生防和秸杆降解潜力的菌株GBSW19 和 LNXM37。
[0042]实施例3菌株GBSW19对小麦秸杆粉的实际降解效果综合测评[0043]将实施例2所得平板上活化的GBSW19菌株挑至液体LB培养基中，于37°C、200rpm振荡培养12小时制成种子液，再以体积百分比为2%的接菌量转接至添加小麦秸杆粉(5目)为唯一碳源的Hutchinson培养基中振荡培养,于不同天次收集培养液，并以差重法和改进的Van Voest法测定小麦秸杆粉的失重率、纤维素降解率、半纤维素降解率和木质素降解率，最终得到菌株GBSW19对小麦秸杆粉的实际降解效果综合测评结果(见图4-7)。
[0044]图4-7结果显示:菌株GBSW19单独作用于秸杆时，秸杆失重率可达39.8%，纤维素降解率达31.5%，半纤维素降解率达37.7%，木质素降解率达52.9%。
[0045]实施例4菌株GBSW19产生的脂肽化合物的MALD1-T0F-MS分析
[0046]脂肽化合物是芽孢杆菌产生的最主要抑菌化合物，包括伊枯草菌素(Iturin)、表面活性素(Surfactin)和芬枯草菌素(Fengycin)三大类,在植物病害防治过程中发挥着重要的作用。将芽孢杆菌菌株GBSW19首先接种于LB培养基中过夜培养，第二天将菌株转接入含有Landy培养基的三角瓶中，在30°C、200r/min条件下振荡培养38h。培养结束后，将培养物离心取上清液，在上清液中加入6mol.T1HCl调pH至2.0,然后轻微搅动2h或过夜。离心收集沉淀,加入甲醇后用Imo l.L4NaOH调节pH至7.0，再用甲醇抽提2次并将抽提液合并，获得脂肽类化合物粗提物；利用基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALD1-T0F-MS)对该粗体物进行分析发现GBSW19可以产生surfactin (见图8)。
[0047]实施例5本发明短小芽孢杆菌GBSW19的抑菌活性
[0048]a.对病原细菌水稻白叶枯病菌的抑菌筛选
[0049]将指示菌病原细菌水稻白叶枯病菌按一定比例(1:30)加入冷却到50°C左右的NA培养基中混匀，制成含菌平板，在距离中心2.5cm处十字垂直放置4个直径为4_的滤纸片，吸取待测菌株菌液5 μ 1，接种于滤纸片上，对照不接种测试菌，用无菌水代替，每个处理重复三次。置于28°C培养箱共培养2-3天后，观察并记录结果。
[0050]b.对病原真菌油菜菌核病菌的拮抗筛选
[0051]在26°C培养箱中活化的油菜菌核病病菌PDA平板边缘打取直径为0.7cm的菌碟(取指示菌边缘生长旺盛的菌丝块)，接种在新的PDA平板中央。在距离菌块2.5cm处，呈“十”字形分布的四个接种点，放上直径4mm的滤纸小圆片，取待测菌液5ul点在滤纸片中央，对照不接种测试菌，用无菌水代替，每个处理重复3次，放入26°C恒温培养箱中培养2-3天后，取出观测并记录抑菌结果。
[0052]c.对病原真菌水稻纹枯病菌的拮抗筛选
[0053]在28°C培养箱中活化的水稻纹枯病菌PDA平板边缘打取直径为0.7cm的菌碟(取指示菌边缘生长旺盛的菌丝块)，接种在新的PDA平板中央。在距离菌块2.5cm处，呈“十”字形分布的四个接种点，放上直径7mm的滤纸小圆片，取待测菌液5ul点在滤纸片中央，对照不接种测试菌，用无菌水代替，每个处理重复3次，放入26°C恒温培养箱中培养3-5天后，取出观测并记录抑菌结果。
[0054]结果:本发明短小芽孢杆菌GBSW19能够有效抑制水稻白叶枯病菌和水稻纹枯病菌，抑菌圈直径分别>15mm和>5mm，如图9的A和B所示；对油菜菌核病菌无明显抑制效果。
[0055] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明，但本发明并不局限于上述，即不意味着本发明必须依赖上述才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。`
【权利要求】
1.一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)GBSW19,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2013年9月9日，保藏编号为CGMCC N0.8140。
2.根据权利要求1所述的短小芽孢杆菌GBSW19，其特征在于，能产生胞外木质纤维素降解酶和表面活性肽。
3.—种微生物制剂，其特征在于，其活性成分为权利要求1或2所述短小芽孢杆菌GBSW19和/或其代谢产物。
4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂为液态。
5.如权利要求3或4所述微生物制剂的制备方法，包括如下步骤: (1)将所述短小芽孢杆菌GBSW19接种于LB固体培养基，于28~37°C下培养14~24小时获得菌体； (2)将步骤(1)获得的菌体接入LB液体培养基中，于28~37°C下振荡培养12~24小时制成种子液； (3)按体积百分比为5%的接种量，将步骤(2)所得种子液接种于发酵培养基中，于28~37°C下发酵培养至少36~48小时，收集发酵液即得所述微生物制剂； 优选地，所述发酵培养基包括如下重量百分比的组分:小麦秸杆粉I~3%、优选2%，磷酸氢二钾0.1~0.5%、优选0.2%，硝酸钠0.3~0.8%、优选0.5%和葡萄糖0.5~1.5%、优选1%。
6.权利要求1所述短小芽孢杆菌GBSW19在作物秸杆降解中的应用；优选地，所述作物稻杆为小麦稻杆。
7.权利要求1所述短小芽孢杆菌GBSW19在防治水稻纹枯病中的应用。
8.权利要求1所述短小芽孢杆菌GBSW19在防治水稻白叶枯病中的应用。
9.权利要求1所述短小芽孢杆菌GBSW19在促进水稻生长中的应用。
【文档编号】A01P3/00GK103589670SQ201310560992
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】高学文, 臧昊昱, 伍辉军, 张万宽 申请人:无锡亚克生物科技有限公司