一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法及应用，步骤为：将新鲜的肝组织经暴露的血管用灌注溶液冲洗干净，直至消化完全；然后将新鲜分离的肝细胞置于含有细胞洗液的培养皿中过细胞筛得到单细胞悬液；清洗后沉淀单细胞并重悬，用渐进冻存的方法，保存于液氮；复苏的胎肝细胞通过优化高活力胎肝细胞的铺板密度、Percoll离心介质纯化低活力胎肝细胞以及后续培养程序，建立紧密的细胞单层培养。本发明可大量分离、保存及高效率复苏胎肝细胞，复苏的胎肝细胞能保持良好的肝细胞特性、分化状态及对乙型肝炎病毒易感性，从而缓解原代肝细胞资源稀缺问题，并建立了稳定的体外抗乙型肝炎病毒筛药平台。
【专利说明】一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药生物【技术领域】，具体涉及一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法及应用，该方法可大量分离、冻存与复苏人胎肝细胞，复苏后的胎肝细胞保持良好的肝细胞功能以及对乙型肝炎病毒易感性。
【背景技术】
[0002]人原代肝细胞(英文缩写为PHHs)目前被认为是最理想的体外肝特异性病理研究的细胞模型，例如，运用这种细胞可建立对乙型肝炎病毒(英文缩写为HBV)的体外感染。PHHs也被公认为是一种很有价值的肝细胞移植的细胞来源，为肝功能衰竭患者带来了重生的希望。然而，新鲜肝组织资源稀缺，肝细胞数量有限，批次间肝细胞差异等问题，极大地限制了其大规模应用。细胞冻存被认为是一个很有前途的解决方案。目前，关于原代成人肝细胞的冻存和复苏方法的工作已经有很多文献报道，但迄今报道的复苏效率相对较低且不稳定。另一个PHHs重要来源是人胎肝细胞(英文缩写为HFHs)，它是人成熟肝细胞的早期阶段，具有相对较高的细胞活力和增殖能力，这些特性赋予它们即使在恶劣的冻存过程后仍然可以被复苏并形成致密单层细胞的潜力。此外，原代成人肝细胞通常分离自肝病患者的病变肝活检组织，细胞数目少且细胞活力低；而HFHs通常分离于已死胎儿的新鲜肝组织，可以提供更大量的高活力肝细胞。目前为止，还没有如何冻存和复苏HFHs的研究报告及专利。
[0003]乙型肝炎病毒(英文缩写为HBV)感染及其相关疾病是中国的重大疾病之一，中国约有1.7亿的乙肝携带者，每年死于相关疾病的病人约一百万。由于长期缺乏支持完整HBV感染与复制的药物筛选与评价平台，HBV的治疗策略与方法相对滞后。人原代肝细胞是HBV研究最为理想的细胞感染模型，能够支持HBV完整的感染与复制循环，能够在体外最为真实地反映药效及药代动力学。由于上述PHHs局限性问题使得实验很难大规模进行，实验重复性差。本专利利用优化的冻存与复苏条件，证明冻存复苏后的HFHs仍然具有HBV易感性，在很大程度上解决了上述PHHs局限性。
[0004]大量的研究表明，原代肝细胞移植对肝功能衰竭病人的治疗效果卓著，可以极大缓解病人对供肝的需求，是一种很有应用前景的治疗策略。肝细胞的数量及质量决定了该治疗策略的可行性。本专利利用优化的冻存与复苏条件，可以大量冻存HFHs，复苏后的HFHs具有良好的细胞活力及肝细胞功能，具有极大的临床应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种对乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法，包括:利用两步胶原酶灌注法，从已死胎儿新鲜肝组织中分离得到大量的高活力胎肝细胞，经过渐进冷冻的方法长期低温保存原代胎肝细胞，再通过优化复苏条件，Per coll离心介质纯化低活力胎肝细胞以及后续培养程序，建立的单层细胞保持良好的原代胎肝细胞形态特征、肝细胞特异的蛋白表达、良好的细胞增殖活力以及对乙型肝炎病毒的易感性。
[0006]本发明的另一个目的在于提供了一种乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法在构建抗HBV入侵药物筛选与评价的体外细胞模型中的应用。
[0007]为解决上述技术问题，本发明采取以下技术措施:
[0008]一种人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法，包括以下步骤:
[0009]I)已死胎儿新鲜肝组织经暴露的血管用灌注溶液I灌注，直至肝组织中血液被冲洗干净；
[0010]2)用37°C预热的灌注溶液II灌注步骤I)中冲洗干净的肝组织，直至肝组织失去弹性消化完全；
[0011]3)将步骤2)消化完全的肝组织转移至含有细胞洗液的培养皿中，抖落消化好的细胞，形成细胞悬液；
[0012]4)将步骤3)中细胞悬液通过70 μ m的细胞筛，得到单细胞悬液；
[0013]5)将步骤4)获得的单细胞悬液在800转/分钟和4°C条件下，离心5分钟沉降，
用细胞洗液重悬，重复离心二次；
[0014]6)利用台酚蓝染色法计算步骤5)中重悬细胞的细胞密度与细胞活力，细胞活力为60%~95%时冻存；
[0015]7)将步骤6)中单细胞`悬液重复离心一次，细胞沉淀利用细胞冻存液以IO7个活细胞/ml的密度重悬细胞。将重悬的细胞以I支冻存管I毫升的量分装细胞悬液，再将冻存管转移到冻存盒(购自美国NALGENETM，降温速度为每I分钟1°C )，盛有细胞的细胞冻存盒放于-80°C冰箱10-14小时，经过该渐进冷冻后，冻存管转移到液氮罐中长期保存，最长保存记录为24个月；
[0016]8)取出需要复苏的细胞，置于37~40°C的水浴锅中I~2分钟，800转/分钟离心3分钟，去掉细胞冻存液，利用铺板培养液重悬细胞，台酚蓝染色法计算重悬细胞的细胞密度与细胞活力；
[0017]9)将获得的肝细胞且细胞活力大于70%以3~4X IO5活细胞/cm2的密度接种到胶原包被的培养皿或培养板中，摇匀后培养4~6小时将培养液换成生长培养液,培养24小时后，再将生长培养液换成维持培养液；
[0018]10)步骤8)中细胞活力为40%~70%时，复苏胎肝细胞用PBS洗2次，利用密度梯度为70%、50%、30%的Percoll离心介质纯化得到高活力胎肝细胞，离心条件为350Xg，4°C离心30分钟；取Percoll密度70%与Percoll密度50%之间的细胞层，PBS清洗2次，台酚蓝染色法计算重悬细胞的细胞密度与细胞活力，后续铺板与培养过程同步骤9)。
[0019]所述灌注溶液I配方为:8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、lg/L葡萄糖、ImM丙酮酸钠和2mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸，调pH至7.4 ;
[0020]所述灌注溶液II配方为:8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、lg/L葡萄糖、ImM丙酮酸钠、5mM氯化钙和0.3g/L IV型胶原酶，调pH至7.4 ;
[0021]所述细胞洗液的配方为:DMEM培养液使用前加入10%v/v胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素；
[0022]所述细胞冻存液为=William氏E培养基使用前加入45%v/v胎牛血清和10%v/v 二甲亚砜(英文缩写为DMSO)。
[0023]所述铺板培养液的配方为=William氏E培养基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM轻乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L丙酮酸钠、0.2mM抗坏血酸-2-磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、KT7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和5%v/v胎牛血清;其中，ITS+premix含有6.25 u g/ml胰岛素、6.25 u g/ml转铁蛋白、6.25ng/ml亚硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 u g/ml亚油酸；
[0024]所述生长培养液的配方为=William氏E培养基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM轻乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L丙酮酸钠、0.2mM抗坏血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、I(T7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和20ng/ml表皮生长因子；其中，ITS+premix含有6.25 u g/ml胰岛素、6.25 u g/ml转铁蛋白、6.25ng/ml亚硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 u g/ml亚油酸；
[0025]所述维持培养液的配方为=William氏E培养基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM轻乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L丙酮酸钠、0.2mM抗坏血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、KT7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2%v/V DMSO ;其中，ITS+premix 含有 6.25 u g/ml 胰岛素、6.25 u g/ml 转铁蛋白、6.25ng/ml 亚砸酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 u g/ml亚油酸。
[0026]作为优选方案，所述步骤6)或8)中，确定细胞密度与细胞活力的方法为:将细胞悬液与0.4%m/v台酚蓝染色液以1:1的体积比混匀，迅速将20 u I混合液加入到计数板中且将该计数板插入相应的计数仪中，仪器读出相应的细胞密度与细胞活力，0.4%台酚蓝染色液具体配制方法为:0.4g台酚蓝固体完全溶解到100ml的磷酸缓冲液溶液(英文缩写为PBS)中，具体配方为:8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、3.58g/L十二水磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾，pH7.2至7.4，高压蒸汽灭菌，4°C保存备用。
`[0027]作为优选方案，所述胶原包被的培养皿或培养板的制备方法:将172 ill冰醋酸加入到100ml去离子水中，再加入终浓度为50 ii g/ml的IV型鼠尾胶原，在无菌条件下，
0.22 um滤膜过滤除菌后，4°C保存待用；将该工作液以5 u g/cm2的包被量加入到需要包被处理的培养板或培养皿中，常温孵育；1小时后，将胶原工作液吸出，自然晾干后封口 4°C保存；使用前，将胶原包被的培养皿或培养板需用PBS清洗一次，以去除残留的醋酸。
[0028]一种乙型肝炎病毒易感的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法在构建抗HBV入侵药物筛选与评价的体外细胞模型中的应用，其应用过程如下:
[0029]I)培养的细胞在铺板后6天内进行乙型肝炎病毒感染。感染液的配制方法为:WE中加入2%v/v DMS0、4%m/v (质量体积比)聚乙二醇8000和10%v/v高病毒滴度的病人血清(病毒滴度为2X109拷贝/ml)。配制好的感染液加入到待感染的细胞中，孵育16至24小时。感染结束后去掉感染液，用PBS清洗3次，加入新鲜含2%DMS0的维持培养液，2天换I次新鲜的培养液；收集旧培养液用作酶联免疫吸附试验，分析乙型肝炎病毒表面抗原(英文缩写为HBsAg)的分泌水平。在培养的后期，细胞固定后用免疫荧光的方法检测细胞内核心抗原(英文缩写为HBcAg)的表达；或者，将细胞裂解利用Hirt法抽提细胞内乙型肝炎病毒脱氧核酸，再通过DNA印迹(Southern blot)的方法检测各时间点乙型肝炎病毒复制中间体的产生。
[0030]与现有技术相比，本发明具有以下优点:
[0031]其一，本发明利用常规的肝细胞分离技术，分离得到大量的高活力人原代胎肝细胞，肝细胞数可达109，活力60%~95% ；
[0032]其二，本发明利用渐进冷冻的方法，通过优化的复苏条件，可以将复苏后高活力(大于70%)原代肝细胞形成致密单层，该致密单层保持良好的肝细胞形态特征、肝细胞功能与细胞增殖活力；
[0033]其三，复苏后低活力(40%~70%)原代肝细胞经Percoll离心介质纯化得到高活力胎肝细胞，纯化后胎肝细胞通过优化的复苏条件形成致密单层，该致密单层保持良好的肝细胞形态特征、肝细胞功能与细胞增殖活力；
[0034]其四，通过该方法复苏的原代肝细胞在铺板后6天内具有HBV易感性，极大地提高了实验的重复性，建立了稳定的抗HBV入侵药物筛选与评价的体外细胞模型；
[0035]其五，本发明得到的冻存原代胎肝细胞具有数量大，保存时间长，细胞复苏后活力高且保持了完好的肝细胞功能，解决了肝细胞移植的细胞来源问题，有望应用于临床。 【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1为复苏后原代胎肝细胞的形态特征示意图。
[0037]图2为复苏后原代胎肝细胞的肝细胞特异蛋白的表达示意图。
[0038]图3为复苏后原代胎肝细胞的增殖活力示意图。
[0039]图4为复苏后原代胎肝细胞对乙型肝炎病毒的易感性示意图。
【具体实施方式】
[0040]为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
[0041]实施例1:
[0042]一种对乙型肝炎病毒乙肝的人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法，其步骤如下:
[0043]1.两步胶原酶灌注法分离人原代胎肝细胞:
[0044]两步胶原酶灌注法第一步:新鲜的肝组织材料经暴露的血管用灌注溶液I灌注约30分钟，直至肝组织中血液被冲洗干净。灌注溶液I的具体配方为:8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、Ig/L葡萄糖、ImM丙酮酸钠和2mM乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸，调pH至7.4，用0.22 μ m微孔滤器过滤除菌，4°C保存。
[0045]两步胶原酶灌注法第二步:用37°C预热的灌注溶液II灌注直至肝组织失去弹性。灌注溶液II的具体配方为:8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、lg/L葡萄糖、ImM丙酮酸钠、5mM氯化钙和0.3g/L IV型胶原酶(购自美国Sigma公司),调pH至7.4,用0.22 μ m微孔滤器过滤除菌,4°C保存。
[0046]将消化好的肝组织转移到含有细胞洗液的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液。细胞洗液为商业化购买的DMEM培养液(购自美国GIBCO公司)，使用前加入10%v/v胎牛血清(购自美国GIBCO公司)，100U/ml青霉素，100mg/ml链霉素。再将该细胞悬液通过70 μ m的细胞筛，以获得单细胞悬液。将单细胞悬液转移至离心机中离心以沉降肝细胞与肝非实质细胞，离心条件为:50Xg，4°C，5分钟。用细胞洗液重悬，重复以上离心三次。
[0047]2.细胞浓度与细胞活力的检测:
[0048]将I中最后一次离心前细胞悬液与0.4%m/g台酚蓝染色液以1:1的体积比混匀，迅速将20 μ I混合液加入到计数板(购自美国Counterstar公司)中且将该计数板插入相应的计数仪中，仪器读出相应的细胞密度与细胞活力。0.4%台酚蓝染色液具体配制方法为0.4g台酚蓝固体溶解到100ml的磷酸缓冲液溶液(英文缩写为PBS，具体配方为:8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、3.58g/L十二水磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾，pH7.2至7.4，高压蒸汽灭菌，4°C保存备用)中。一般情况下每次分离的活细胞数为IO9个，细胞活力介于60%~95%之间。
[0049]3.人原代胎肝细胞的冻存:
[0050]经方法I分离得到的细胞沉淀，利用细胞冻存液以IO7个活细胞/ml的细胞密度重悬细胞。细胞冻存液为:在商业化购买的William氏E培养基(简称WE，购自美国GIBCO公司)中使用前加入45%v/v胎牛血清，10%v/v 二甲亚砜(英文缩写为DMS0)。将重悬的细胞以I支冻存管I毫升的量分装细胞悬液，再将冻存管转移到冻存盒(购自美国NALGE NETMCryol0C，降温速度为每I分钟1°C )，盛有细胞的细胞冻存盒放于_80°C冰箱过夜，经过该渐进冷冻后，冻存管转移到液氮罐中长期保存，最长保存记录为24个月。
[0051]4.人原代胎肝细胞的复苏:
[0052]取出需要复苏的细胞，置于37~40°C的水浴锅中快速解冻I~2分钟，800转/分钟离心去掉细胞冻存液，利用铺板培养液重悬细胞，台酚蓝染色法计算重悬细胞的细胞密度与细胞活力。重悬细胞的铺板培养液为商业化购买的William氏E培养基(简称WE，购自美国GIBCO公司)，使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羟乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L丙酮酸钠、0.2mM抗坏血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、10-7Μ地塞米松、ITS+premix (含有 6.25 μ g/ml 胰岛素、6.25 μ g/ml 转铁蛋白、6.25ng/ml 亚硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 μ g/ml亚油酸)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和5%v/v胎牛血清(购自美国GIBCO公司)。
[0053]复苏获得的肝细胞细胞活力大于70%，以3~4X IO5活细胞/cm2的密度接种到胶原包被的培养皿或培养板中，摇匀后培养4~6小时将培养液换成生长培养液。生长培养液为商业化购买的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羟乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L丙酮酸钠、0.2mM抗坏血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、10-7Μ地塞米松、ITS+premix(含有 6.25 μ g/ml 胰岛素、6.25 μ g/ml 转铁蛋白、6.25ng/ml 亚砸酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白、5.35 μ g/ml亚油酸)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和20ng/ml表皮生长因子(购自美国BD公司)。细胞在生长培养液中培养24小时后，将细胞培养液换成维持培养液，2~3天换一次培养液。维持培养液为商业化购买的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM轻乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L丙酮酸钠、0.2mM抗坏血酸-2-磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、I(T7M地塞米松、ITS+premix (含有6.25 μ g/ml胰岛素、6.25 μ g/ml转铁蛋白、6.25ng/ml亚硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 u g/ml亚油酸)、100U/ml青霉素、100mg/ml 链霉素和 2%v/v DMSO。
[0054]复苏获得的肝细胞细胞活力为40%~70%时，胎肝细胞用PBS洗2次，利用密度梯度为70%、50%、30%的Percoll离心介质纯化得到高活力胎肝细胞，离心条件为350Xg，4°C离心30分钟；取Percoll密度70%与Percoll密度50%之间的细胞层，PBS清洗2次，台酚蓝染色法计算重悬细胞的细胞密度与细胞活力，一般情况下细胞活力大于70%。获得的肝细胞以3~4X IO5活细胞/cm2的密度接种到胶原包被的培养皿或培养板中，摇匀后培养4~6小时将培养液换成生长培养液。生长培养液为商业化购买的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM轻乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L丙酮酸钠、0.2mM抗坏血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、ICT7M地塞米松、ITS+premix(含有6.25 u g/ml胰岛素、6.25 u g/ml转铁蛋白、6.25ng/ml亚硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白、5.35 u g/ml亚油酸)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和20ng/ml表皮生长因子(购自美国BD公司)。细胞在生长培养液中培养24小时后,将细胞培养液换成维持培养液,2~3天换一次培养液。维持培养液为商业化购买的WE，使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羟乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L丙酮酸钠、0.2mM抗坏血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、KT7M地塞米松、ITS+premix (含有 6.25 u g/ml 胰岛素、6.25 u g/ml 转铁蛋白、6.25ng/ml 亚硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 u g/ml亚油酸)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2%v/v DMSO。
[0055]检测与分析
[0056]1.冻存后胎肝细胞的最佳复苏条件的确定
[0057]一方面，利用同一批次的冻存肝细胞，以不同细胞密度接种到培养皿中，观察其形成细胞单层情况；另一方面，在最佳铺板密度下利用不同细胞活力的冻存复苏胎肝细胞，铺板六小时，观察其形成单层的情况。
[0058]利用高活力的复苏胎肝细胞(细胞活力大于80%)，分别以I X IO5个活细胞/cm2、
2X IO5个活细胞/cm2、3X IO5个活细胞/cm2、3.5 X IO5个活细胞/cm2、4X IO5个活细胞/cm2接种到胶原包被的细胞培养皿中，培养6小时后，将铺板培养基换成维持培养基，培养至第3天时利用相差显微镜观察细胞单层的融合度与细胞间的紧密度。
[0059]利用不同细胞活力(40%~80%)的复苏胎肝细胞，以上述确定的最佳密度铺板接种到胶原包被的培养皿中，在铺板培养基中培养6小时,将未贴壁的胎肝细胞轻轻洗掉后利用相差显微镜观察细胞贴壁情况。
[0060]结果分析
[0061]a.铺板密度对形成单层(成功复苏)至关重要:原代胎肝细胞铺板后，很快进入去分化状态，丢失其分化特性，但致密的单层培养有助于其分化特性的维持。如表1所示，能形成致密单层的细胞密度为3X IO5个活细胞/平方厘米、3.5X IO5个活细胞/平方厘米以及4X IO5个活细胞/平方厘米。2X IO5个活细胞/平方厘米和2.5X IO5个活细胞/平方厘米也能形成单层，但细胞并不紧密，后续培养也表现为分化特性相对于紧密单层更早退化。而IX IO5个活细胞/平方厘米的密度不能形成单层，细胞很快去分化。
[0062]b.高的细胞活力是成功复苏的必要条件:由于培养皿有限的接触面积，死细胞跟活细胞相互竞争这些位置。如表1 所示，铺板6小时后只有细胞活力大于70%才能较好地形成细胞单层。对于40%~70%的细胞活力可以通过Percoll离心介质纯化得到高活力胎肝细胞，该方法可以较好地形成细胞单层。不同Percoll离心介质纯化条件及效果见表2。经优化确定条件I为最优纯化条件，其活细胞回收率约为34%，回收的高活力肝细胞利用上述优化铺板条件可以较好地形成致密单层。
[0063]表1
[0064]
【权利要求】
1.一种人胎肝细胞分离、冻存与复苏的方法，包括以下步骤: 1)已死胎儿新鲜肝组织经暴露的血管用灌注溶液I灌注，直至肝组织中血液被冲洗干净; 2)用37°C预热的灌注溶液II灌注步骤I)中冲洗干净的肝组织，直至肝组织失去弹性消化完全； 3)将步骤2)消化完全的肝组织转移至含有细胞洗液的培养皿中，抖落消化好的细胞，形成细胞悬液； 4)将步骤3)中细胞悬液通过70ii m的细胞筛，得到单细胞悬液； 5)将步骤4)获得的单细胞悬液在800转/分钟和4°C条件下，离心5分钟沉降，用细胞洗液重悬，重复离心二次； 6)利用台酚蓝染色法 计算步骤5)中重悬细胞的细胞密度与细胞活力，细胞活力为60%~95%时冻存； 7)将步骤6)中单细胞悬液重复离心一次，细胞沉淀利用细胞冻存液以IO7个活细胞/ml的密度重悬细胞；将重悬的细胞以I支冻存管I毫升的量分装细胞悬液，再将冻存管转移到冻存盒，盛有细胞的细胞冻存盒放于-80°C冰箱10-14小时，经过该渐进冷冻后，冻存管转移到液氮罐中长期保存，最长保存记录为24个月； 8)取出需要复苏的细胞，置于37~4(TC的水浴锅中广2分钟，800转/分钟离心3分钟，去掉细胞冻存液，利用铺板培养液重悬细胞，台酚蓝染色法计算重悬细胞的细胞密度与细胞活力； 9)将获得的肝细胞且细胞活力大于70%以3~4XIO5活细胞/cm2的密度接种到胶原包被的培养皿或培养板中，摇匀后培养4~6小时将培养液换成生长培养液,培养24小时后,再将生长培养液换成维持培养液； 10)步骤8)中细胞活力为409^70%时，复苏胎肝细胞用PBS洗2次，利用密度梯度为70%、50%、30%的Percoll离心介质纯化得到高活力胎肝细胞，离心条件为350Xg，4°C离心30分钟；取Percoll密度70%与Percoll密度50%之间的细胞层，PBS清洗2次，台酚蓝染色法计算重悬细胞的细胞密度与细胞活力，后续铺板与培养过程同步骤9)； 所述灌注溶液I配方为:8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、lg/L葡萄糖、ImM丙酮酸钠和2mM乙二醇双四乙酸，调pH至7.4 ; 所述灌注溶液II配方为:8.00g/L氯化钠、0.40g/L氯化钾、3.57g/L羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/L 二水磷酸氢二钠、0.06g/L磷酸二氢钾、lg/L葡萄糖、ImM丙酮酸钠、5mM氯化钙和0.3g/L IV型胶原酶，调pH至7.4 ; 所述细胞洗液的配方为:DMEM培养液使用前加入10% v/v胎牛血清、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素； 所述细胞冻存液为:William氏E培养基使用前加入45% v/v胎牛血清和10% v/v 二甲亚砜； 所述铺板培养液的配方为=William氏E培养基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羟乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L丙酮酸钠、0.2mM抗坏血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、KT7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和5% v/v胎牛血清;其中，ITS+premix含有6.25 μ g/ml胰岛素、6.25 μ g/ml转铁蛋白、6.25ng/ml亚硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 μ g/ml亚油酸； 所述生长培养液的配方为=William氏E培养基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羟乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L丙酮酸钠、0.2mM抗坏血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、KT7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和20ng/ml表皮生长因子;其中，ITS+premix含有6.25 μ g/ml胰岛素、6.25 μ g/ml转铁蛋白、6.25ng/ml亚硒酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 μ g/ml亚油酸； 所述维持培养液的配方为=William氏E培养基使用前加入IOmM尼克酰胺、20mM羟乙基哌嗪乙磺酸、17mM碳酸氢钠、550mg/L丙酮酸钠、0.2mM抗坏血酸_2_磷酸、14mM葡萄糖、2mM谷氨酰胺、I(T7M地塞米松、ITS+premix、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和2% v/V DMSO ;其中，ITS+premix 含有 6.25 μ g/ml 胰岛素、6.25 μ g/ml 转铁蛋白、6.25ng/ml 亚砸酸、1.25mg/ml牛血清白蛋白和5.35 μ g/ml亚油酸。
2.根据权利要求1所述的方法，确定细胞密度与细胞活力的方法为:将细胞悬液与0.4% m/v台酚蓝染色液以1:1的体积比混匀，将20 μ I混合液加入到计数板中且将该计数板插入相应的计数仪中，仪器读出相应的细胞密度与细胞活力，0.4%台酚蓝染色液具体配制方法为:0.4g台酚蓝固体完全溶解到100ml的磷酸缓冲液溶液中，具体配方为:8.0g/L氯化钠、0.2g/L氯化钾、3.58g/L十二水磷酸氢二钠和0.24g/L磷酸二氢钾，pH7.2至7.4，高压蒸汽灭菌，4°C保存备用。
3.根据权利要求1所述的方法，所述胶原包被的培养皿或培养板的制备方法:将172 μ I冰醋酸加入到100ml去离子水中，再加入终浓度为50 μ g/ml的IV型鼠尾胶原，在无菌条件下，0.22 μ m滤膜过滤除菌后，4°C保存待用；将该工作液以5 μ g/cm2的包被量加入到需要包被处理的培养板或培养皿中，常温孵育；1小时后，将胶原工作液吸出，自然晾干后封口 4°C保存；使用前，将胶原包被的培养皿或培养板需用PBS清洗一次。
4.权利要求1所述的方法在构建抗HBV入侵药物筛选与评价的体外细胞模型中的应用。
【文档编号】A01N1/02GK103740637SQ201410009255
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】胡康洪, 周明, 祁燕, 李家福, 成细瑶 申请人:康珞生物科技（武汉）有限公司