一种耐盐芦竹种苗的诱导驯化培育方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐盐芦竹种苗的诱导驯化培育方法，利用NaCl(50mmol/l)-MS+6-BA(6mg/l)+IBA(0.4mg/l)诱导培养芦竹腋芽，获得无菌幼嫩茎段，通过NaCl(50-100mmol/l)-MS+2、4-D(4mg/l)+KT(0.05mg/l)诱导其脱分化形成愈伤组织，控制不同浓度梯度NaCl(50-300mmol/l)进行持续继代培养，再选择具有较好耐盐性状(200mmol/l?NaCl以上)的愈伤组织块，以200mmol/l?NaCl-MS+CPPU(1.5mg/l)+NAA(0.01mg/l)进行200mmol/l?NaCl胁迫下的分化培养、生根壮苗、以及炼苗移栽等技术环节，从而得到具较高耐盐性的芦竹种苗。
【专利说明】一种耐盐芦竹种苗的诱导驯化培育方法
所属【技术领域】
[0001]本发明涉及一种耐盐芦竹种苗的诱导驯化培育方法。
【背景技术】
[0002]芦竹在我国已被认为是本土高大型禾本科植物，其分布范围相当广，北起辽宁，南至广西、台湾。芦竹可作为造纸制浆、搭建棚架、生态修复、药物提取以及用于生物质能开发的原料，其应用前景极为广阔。芦竹可进行规模化栽培，合理整合进入当地农业生产系统。江苏省西部里下河水网地区是芦竹的主要产地，其分布面积达3万多公顷，如果将其引入到江苏东部沿海滩涂围垦区域进行规模化种植，可望取得经济、生态与社会三重效益。然而，将芦竹从江苏西部里下河水网地区的甜土，转入江苏东部沿海滩涂围垦区域的盐土进行种植，面临着对滩涂高盐分难以适应而致成活率偏低的问题，且传统的种根(茎)分株繁殖法、茎段扦插法等还存在劳动强度大、 运输成本高、繁殖效率低等问题，难以满足在沿海滩涂围垦区域进行规模化种植的需求。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种耐盐芦竹种苗的诱导驯化培育方法，该方法不仅能够提高芦竹在江苏东部沿海滩涂高盐分土壤上种植的成活率，而且能够解决传统种植劳动强度大问题。
[0004]为解决上述技术问题，本发明提出的一种耐盐芦竹种苗的诱导驯化培育方法，包括以下步骤:
[0005](I)芦竹外植体取材与灭菌处理，芦竹采样于江苏里下河地区沟河堤岸上部的芦竹种群，取其茎杆，该茎杆的外径不粗于1cm，用枝剪剪成3-5cm带I个腋芽的茎段，用洗衣粉水刷洗后，再用去离子水冲洗干净，在无菌室超净台上，以每100ml加0.25ml吐温-80的0.1% HgCl2溶液，对芦竹外植体进行表面灭菌处理，之后再用无菌水冲洗8-10次；
[0006](2)芦竹外植体腋芽无菌培养的建立，以NaCl (50mmol/l) -MS+6-BA (6mg/I)+IBA(0.4mg/l)诱导培养芦竹外植体，在无菌室超净台上，将步骤(1)中已表面灭菌的芦竹茎段，保持其腋芽朝上，通过无菌操作插入上述试管培养基中，然后放入培养室中诱导培养，以获得无菌幼嫩茎叶，培养温度:25±2°C，光照:16h(白天)/8h(夜晚)，光强:50 μ mo I.m_2.s_1 ；
[0007](3)芦竹无菌幼嫩茎段脱分化及其继代增殖，待步骤(2)中无菌茎段腋芽长至
0.5cm 以上时，即可用解剖刀切下，转入 NaCl(50mmol/l)-MS+6-BA(6mg/l)+IBA(0.2mg/l)增殖培养基，在幼嫩茎段长至l_2cm时去叶，将其转入脱分化诱导培养基:NaCl (50mmol/I) -MS+2、4-D (4mg/l) +KT (0.05mg/l)，诱导愈伤组织形成；愈伤组织培养达35-40天时，转入继代培养基:NaCl (50mmol/l) -MS+2,4-D (3mg/l) +6-BA (0.2mg/l)，进行继代增殖5-10 次，每代间隔 35-40 天，其培养基中 NaCl 浓度按 50mmol/l、100mmol/l、150mmol/l、200mmol/l、250mmol/l、300mmol/l进行递增，选择既能达到用量需求,又具较高耐盐性状(200mmol/l NaCl)的颗粒状愈伤组织块，转入分化培养环节，继代增殖培养阶段控制培养温度25±2°C,光照:14h (白天)/IOh (夜晚)，光强:50 μ mol.m 2.s \培养室相对湿度:65-80% ；
[0008](4)芦竹愈伤组织诱导分化、生根与壮苗，将步骤(3)中达到要求的芦竹愈伤组织及时转入分化培养基:200mmol/l NaCl-MS+CPPU(1.5mg/l)+NAA(0.01mg/l)，待芦竹愈伤分化新芽生长至2-3cm时，转入生根与壮苗培养基:200mmol/l NaCl-l/2MS+NAA(0.4mg/I)，进行生根壮苗培养3-4周，此时培养温度25±2°C，光照:16h(白天)/8h (夜晚)，光强:50-100 μ mo I.m 2.s 1 ；
[0009](5)芦竹耐盐幼苗出瓶炼苗与移栽，待步骤(4)瓶或管中的芦竹幼苗培养达4周后，将其从瓶或管中取出，洗去其根部所附着的培养基，在温室内进行炼苗时，其栽培基质为有土或无土均可，在其栽培基质内逐步添加含50mmol/l、100mmol/l及至200mmol/INaCl的l/2Hoagland营养液，保持培养温度20-25°C (白天)/16_20°C (黑夜)，光照为100-150 μ mo I.m_2.s_\空气相对湿度:80%以上，待芦竹幼苗叶片达5_6片，叶色浓绿，根须长5cm以上时，即可成苗；
[0010](6)芦竹耐盐幼苗的养护，步骤(5)中的芦竹幼苗用于移栽，进行无土栽培时，注意将其根系小心埋入栽培基质，以免伤根，若用于江苏滨海盐土大田栽培，宜带土团进行移栽，可用遮阳网进行遮阳，或用喷雾器少量喷水使幼苗叶片保持湿润，以防其在移栽过程中过分失水。
[0011]在上述耐盐芦竹种苗的诱导驯化培育方法中，利用NaCl (50mmol/I) -MS+6-BA (6mg/l) +IBA (0.4mg/l)诱导培养芦竹腋芽，获得无菌幼嫩茎段，通过NaCl (50-100mmol/l) _MS+2、4_D (4mg/l) +KT (0.05mg/l)诱导其脱分化形成愈伤组织，控制不同浓度梯度NaCl (50-300mmol/l)进行持续继代培养，再选择具有较好耐盐性状(200mmol/l NaCl 以上)的愈伤组织块，以 200mmol/l NaCl-MS+CPPU (1.5mg/I)+NAA (0.01mg/l)进行200`mmol/l NaCl胁迫下的分化培养、生根壮苗、以及炼苗移栽，从而得到高耐盐性的芦竹种苗，不仅提高了芦竹在江苏东部沿海滩涂高盐分土壤上种植的成活率，而且解决了传统种植劳动强度大等问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1:芦竹茎段外植体诱导出芽(腋芽)。
[0013]图2:芦竹腋芽无菌培养体系建立。
[0014]图3:芦竹幼嫩茎段诱导得到愈伤组织。
[0015]图4:芦竹嫩茎愈伤组织的继代增殖。
[0016]图5:芦竹耐盐愈伤组织块的选择。
[0017]图6:芦竹愈伤组织分化生根壮苗。
[0018]图7:芦竹经炼苗后得到可移栽的带土种苗。
[0019]图8:耐盐芦竹种苗在江苏沿海滩涂盐土定植生长情况。
【具体实施方式】
[0020]一种耐盐芦竹种苗的诱导驯化培育方法，包括以下步骤:(1)芦竹外植体取材与灭菌处理，芦竹采样于江苏里下河地区沟河堤岸上部不同的芦竹种群，取其茎杆(外径Icm以下)，用枝剪剪成3-5cm带I个腋芽的茎段，用洗衣粉水刷洗后，再用去离子水冲洗干净。在无菌室超净台上，以每100ml加0.25ml吐温-80的0.1 % HgCl2溶液，对芦竹外植体进行表面灭菌处理，之后再用无菌水冲洗8-10次，洗完后将其放入盛有无菌水的广口瓶中，以备进行无菌培养。(2)芦竹外植体腋芽无菌培养的建立，以NaCl(50mmol/I) -MS+6-BA(6mg/l) +IBA(0.4mg/l)诱导培养芦竹外植体。在无菌室超净台上，将步骤(1)中已表面灭菌的芦竹茎段，保持其腋芽朝上，插入上述试管培养基中，然后放入培养室中诱导培养，以获得无菌幼嫩茎叶，如图1所示，保持培养温度25±2°C，光照16h (白天)/8h (夜晚)，光强:50 μ mol.m_2.s' (3)芦竹无菌幼嫩茎段脱分化及其继代增殖，待步骤(2)中无菌莖段腋芽长至0.5cm以上时，即可用解剖刀切下，转入NaCl (50mmol/l) -MS+6-BA (6mg/I)+IBA(0.2mg/l)增殖培养基，根据需要可增殖多次，如图2所示。待新生嫩茎长至1_1.5cm时，去其叶，将其转入脱分化诱导培养基=NaCl (50mmol/l) _MS+2、4_D (4mg/l) +KT (0.05mg/I)，诱导嫩茎愈伤组织形成，此时，可根据其愈伤组织发生情况，适当调整NaCl (IOOmmol/I)与2、4-D(3mg/l)的浓度，如图3所示。愈伤组织培养达35-40天时，转入继代培养基:NaCl (50mmol/l) _MS+2、4_D (3mg/l) +6-BA (0.2mg/l)，进行继代增殖培养，此后根据其增殖情况与需求，进行继代增殖5-10次，每代间隔35-40天，如图4所示，其培养基中NaCl浓度按 SOmmoI /1、10Ommol /1、1 SOmmoI / 1、200_o1 / 1.250mmo1 / 1.300mmo1 / I 进行递增，最终选择既能达到用量需求，又具较高耐盐性状(200mmol/l NaCl)的颗粒状愈伤组织块，转入分化培养环节，如图5所示。继代增殖培养阶段控制培养温度25±2°C，光照14h(白天)/10h(夜晚)，光强:50μπιο1.πm2.s_\培养室相对湿度:65-80 %。(4)芦竹愈伤组织诱导分化、生根与壮苗，将步骤(3)中达到要求的芦竹愈伤组织及时转入分化培养基:200mmol/l NaCl-MS+CPPU (1.5mg/l)+NAA (0.01mg/l)，待芦竹愈伤分化新芽生长至 2_3cm时，适时转入生根壮苗培养基:200mmol/l NaCl-l/2MS+NAA(0.4mg/l)，进行生根壮苗培养3-4周，如图6所示，此时保持培养温度25±2°C，光照16h(白天)/8h(夜晚)，光强:50-100 μ mol.πm2.s' (5)芦竹耐盐幼苗出瓶炼苗与移栽，待步骤(4)瓶或管中芦竹幼苗培养达4周，将其自瓶(管)中取出，洗去其根部所附着的培养基，根据情况在光照培养箱或温室内进行炼苗。在温室内进行炼苗时，其栽培基质为有土与无土均可，在其栽培基质内根据其生长情况逐步添加含50mmol/l、100mmol/l及至200mmol/lNaCl的l/2Hoagland营养液，保持培养温度约20-25°C (白天)/16-20°C (黑夜)，光照为100-150 μ molnTY1，空气相对湿度:80%以上。待芦竹幼苗叶片达5-6片，叶色浓绿，根须长约5cm以上时，即可成苗，如图7所示。(6)芦竹耐盐幼苗的养护，步骤(5)芦竹幼苗用于移栽，进行无土栽培时，注意将其根系小心埋入栽培基质，以免伤根。若用于江苏滨海盐土大田栽培，需尽可能带土团(炼苗时所附)进行移栽，适时用遮阳网进行遮阳，或用喷雾器少量喷水使幼苗叶片保持湿润，以防其在移栽过程中过分失水。本实施例是在2012年5月初，将本方法所培育的芦竹耐盐幼苗，如图7所示，移栽至江苏大丰沿海滩涂围垦区域盐土上种植，移栽的植株可在盐分8g/kg的盐土上正常生长，如图8所示。上述耐盐芦竹种苗的诱导驯化培育方法，利用植物在离体培养，尤其是愈伤组织或细胞培养的过程中存在广泛的体细胞变异，以及容易受到特定因素的诱导与驯化的特性，通过一定浓度的NaCl胁迫、诱导或驯化芦竹的愈伤组织，有效提高芦竹的耐盐能力，培育出可在沿海滩涂盐土上规模化种植的芦竹种苗，可为利用沿海滩涂盐土(水)资源提供种质资源`与技术支撑。
【权利要求】
1.一种耐盐芦竹种苗的诱导驯化培育方法，包括以下步骤: (1)芦竹外植体取材与灭菌处理，芦竹采样于江苏里下河地区沟河堤岸上部的芦竹种群，取其茎杆，该茎杆的外径不粗于1cm，用枝剪剪成3-5cm带I个腋芽的茎段，用洗衣粉水刷洗后，再用去离子水冲洗干净，在无菌室超净台上，以每100ml加0.25ml吐温-80的.0.1% HgCl2溶液，对芦竹外植体进行表面灭菌处理，之后再用无菌水冲洗8-10次； (2)芦竹外植体腋芽无菌培养的建立，以NaCl(50mmol/l)-MS+6-BA(6mg/I)+IBA(0.4mg/l)诱导培养芦竹外植体，在无菌室超净台上，将步骤(1)中已表面灭菌的芦竹茎段，保持其腋芽朝上，通过无菌操作插入上述试管培养基中，然后放入培养室中诱导培养，以获得无菌幼嫩茎叶，培养温度:25±2°C，光照:16h(白天)/8h(夜晚)，光强:.50 μ mo I.m-2.s_1 ； (3)芦竹无菌幼嫩茎段脱分化及其继代增殖，待步骤(2)中无菌茎段腋芽长至0.5cm以上时，即可用解剖刀切下，转入 NaCl(50mmol/l)-MS+6-BA(6mg/l)+IBA(0.2mg/l)增殖培养基，在幼嫩茎段长至l_2cm时去叶，将其转入脱分化诱导培养基:NaCl (50mmol/I) -MS+2、4-D (4mg/l) +KT (0.05mg/l)，诱导愈伤组织形成；愈伤组织培养达35-40天时，转入继代培养基:NaCl (50mmol/l) _MS+2、4_D (3mg/l) +6-BA (0.2mg/l)，进行继代增殖.5-10 次，每代间隔 35-40 天，其培养基中 NaCl 浓度按 50mmol/l、100mmol/l、150mmol/l、.200mmol/l、250mmol/l、300mmol/l进行递增，选择既能达到用量需求，又具较高耐盐性状(200mmol/l NaCl)的颗粒状愈伤组织块，转入分化培养环节，继代增殖培养阶段控制培养温度25±2°C ,光照:14h (白天)/IOh (夜晚)，光强:50 μ mol.m 2.s \培养室相对湿度:.65-80% ； (4)芦竹愈伤组织诱导分化、生根与壮苗，将步骤(3)中达到要求的芦竹愈伤组织及时转入分化培养基:200mmol/l NaCl-MS+CPPU(1.5mg/l)+NAA(0.01mg/l)，待芦竹愈伤分化新芽生长至2-3cm时，转入生根与壮苗培养基:200mmol/l NaCl-l/2MS+NAA(0.4mg/l)，进行生根壮苗培养3-4周，此时培养温度25±2°C，光照:16h(白天)/8h(夜晚)，光强:.50-100 μ mo I.m 2.s 1 ； (5)芦竹耐盐幼苗出瓶炼苗与移栽，待步骤(4)瓶或管中的芦竹幼苗培养达4周后，将其从瓶或管中取出，洗去其根部所附着的培养基，在温室内进行炼苗时，其栽培基质为有土或无土均可，在其栽培基质内逐步添加含50mmol/l、100mmol/l及至200mmol/INaCl的l/2Hoagland营养液，保持培养温度20_25°C (白天)/16_20°C (黑夜)，光照为.100-150 μ mo I.m_2.s_\空气相对湿度:80%以上，待芦竹幼苗叶片达5_6片，叶色浓绿，根须长5cm以上时，即可成苗； (6)芦竹耐盐幼苗的养护，步骤(5)中的芦竹幼苗用于移栽，进行无土栽培时，注意将其根系小心埋入栽培基质，以免伤根，若用于江苏滨海盐土大田栽培，宜带土团进行移栽，可用遮阳网进行遮阳，或用喷雾器少量喷水使幼苗叶片保持湿润，以防其在移栽过程中过分失水。
【文档编号】A01H4/00GK103749302SQ201410017013
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月15日 优先权日:2014年1月15日
【发明者】刘兴华, 朱小梅, 洪立洲, 王茂文, 丁海荣, 杨丽 申请人:江苏沿海地区农业科学研究所, 盐城师范学院